LIM homeodomain transkripcijski faktor Isl1 usmjerava normalan pilorusa razvoj ciljajući Gata3

LIM faktor homeodomain transkripcije Isl1 usmjerava normalan pilorusa razvoj ciljajući Gata3 pregled apstraktne pregled pozadini pregled aberacija u pyloric razvoja ili kontrakcije funkciji piloms uzrok refluksa dvanaesnika sadržaj u želucu, te povećava rizik od želuca metaplazijama i raka. Abnormalnosti u pyloric regiji također su povezani s prirođenim defektima kao što su relativno uobičajenog neonatalna hipertrofične stenozu pilorusa i primarne duodenogastric refluksa. Dakle, razumijevanje pilorusa razvoj od velikog kliničkog značaja. Evo, istražili smo ulogu faktora LIM homeodomain transkripcije Isl1 u pyloric razvoju. Pregled Rezultati
ispitu Isl1 izražavanja u razvoju miša želudac imunohistokemijski, cijeli mount in situ hibridizacije pregled, i real-time kvantitativni PCR pokazao da Isl1 je visoko izražen u razvoju miša želudac, uglavnom u glatkom mišićnom sloju od piloms. Izraz Isl1 također je ispitivana imunofluorescencije u ljudskoj hipertrofične stenozu pilorusa u kojoj je pronađeno većina glatkih mišićnih stanica izraziti Isl1. Isl1 pregled funkcija u embrionalnom razvoju želuca istraživan je korištenjem tamoksifen indukcijske Isl1 pregled modela knockout miš. Isl1 pregled nedostatak je dovelo do gotovo potpune odsutnosti piloričkog vanjskog uzdužnog mišića sloju na embrionalni dan 18,5, što je u skladu s Gata3 pregled null miša fenotipa. Kromatina imunoprecipitaciju, luciferaze testovi i elektroforetskim testovi pomak mobilnost otkrila da Isl1 osigurava normalan pilorusa razvoj izravno ciljanje Gata3
. Pregled Zaključci pregled Ovo istraživanje pokazuje da je Isl1-Gata3 pregled transkripcija regulatorni os je bitno za normalno pilorisa razvoj. Ovi rezultati su vrlo klinički relevantni i mogu pomoći da bolje razumiju putevi vode do pyloric bolesti. Pregled Ključne riječi pregled, α-glatkih mišića aktin Gata3 Isl1 piloms Pozadina pregled kralježnjaka crijevo je izvanredan struktura koja proguta i probavlja hranu, upija hranjive tvari i uklanja otpadne tvari. Gut potječe iz jednostavnog cjevaste strukture koja se sastoji od tri zametka slojeva, uključujući temeljne endoderm, okolni crijevni mesoderm, i ektoderm [1-3]. U mišjih zametaka, crijevo postaje uzorkom duž anterior-posterior, leđne-ventralno, lijevo-desno, a radijalne osi. Gut cijev sastoji se od prednjem crijevu, midgut i hindgut duž svoje anterior-posterior osi [4, 5]. Kao što je razvoj napreduje, prednjem crijevu dovodi do jednjaka, želuca, jetre, pluća i gušterače. Midgut oblikuje u tanko crijevo i hindgut razvija u debelom crijevu [1, 5-8].
Želudac je izvedena iz stražnjeg prednjem crijevu. Želudac morfološki razlikuje od prednjem crijevu cijevi oko embrionalnog dana 9,5 (E9.5) i širenjem prethodno želučane mezenhimu omogućuje domena želuca tako da bude vidljiv s početkom u E10.5 [9]. Mezenhimalne stanice želuca diferenciraju u četiri odvojena koncentričnih slojeva, uključujući lamina propria, muscularis sluznica i kružne i uzdužnog glatkih mišića u različitim stupnjevima razvoja zametka [10]. Do E11.5, želudac je izrazito proširene. Glatkog mišića želuca razlikuje na P13, s posebnim slojem oc-glatkih mišića aktin (α-SMA) pozitivnih stanica pojavljuju i kružnog mišića sloj tvori cijelom trbuhu [11]. Sloj glatkih mišića zgusne u tijesan potencijalnim pilorisa sfinktera regiji na oko E14.5 [2, 9]. Pri E18.5 je pilorisa sfinkter počinje djelovati u sprečavanju refluks duodenalnog sadržaja u želucu [9].
Posteriorno ili pylorus dio želuca je anatomski spoj između želuca i dvanaesterac. Na terminusu pylorus, različite valvularne preklopi piloričkog sfinktera može vidjeti [2]. U normalnim fiziološkim uvjetima, želudac ovisi o njegovom peristaltičkom kontrakcija za mljevenje i potisak djelomično probavljena hrana, a pilorus oslanja na zadebljanog piloričkog sfinktera za kontrolu protoka hrane u tankom crijevu. Abnormalnosti piloričkog razvoju ili u kontraktilne funkcije pylorus uzrokuje refluks duodenalnog sadržaja u želucu, te povećati rizik od želuca metaplazijama i raka [12, 13]. Abnormalnosti piloms se odnose na urođenih defekata [14-16]. Dakle, mnogo je pozornost na regulacijskih elemenata i puteve razvoja želuca, pogotovo pilorus i pyloric razvoj sfinktera.
Prethodni podaci pilić je predložio da koštani morfogenetski protein (BMP) signalizacije uređuje mezenhimalne izraz Nkx2.5 Netlogu i Sox9 pregled, koji utječe na karakter pyloric epitela, ali nema utjecaja na pyloric glatkih mišića [5, 17], sugerirajući da mezenhimalne signalizaciju od strane nepoznatih faktora utječe na pilorusa epitela fenotip. U mišem, molekularni mehanizmi pyloric formiranja malo su shvatili, s relativno malo faktora potrebnih za normalno pilorisa razvoj nakon što je identificiran. Oni koji su bili su Sox9 pregled [17], Six2 pregled [9], Bapx1 pregled [18], Nkx2.5 pregled [3, 17], Gremlin pregled [9], a Gata3 pregled [19, 20]. Ablacija faktora homeodomain transkripcije, Six2 Netlogu izražen u stražnjem želucu, remeti zadebljanje pyloric glatkog mišićnog sloja i slabi stezanje piloms sfinktera. Osim toga, gubitak Six2 pregled eliminira Sox9 pregled, izraza, te smanjuje Nkx2.5
i gremlin pregled izraz u piloms, iako taj izraz poslije oporavlja [9], sugerirajući da Six2
, Sox9 pregled, Nkx2.5 pregled i Gremlin pregled su potrebni za pyloric razvoj. Osim toga, Nkx2.5 pregled, Sox9 pregled i Gata3 pregled su ko-izražen u leđnoj pilorisa vanjski uzdužni mišića (čovječja ribica) sloj koji sazrijeva između E14.5 i E16.5. Nakon brisanja Nkx2.5 Netlogu ili Gata3 Netlogu, dorzalni pilorisa čovječja ribica je gotovo odsutna i sužavanje piloms sfinktera je oslabljena, [20].
Limskog homeodomain (LIM-HD) transkripcijski faktor Isl1 je izvorno utvrđeno da funkcioniraju kao gena za inzulin pojačivača veznog proteina [21]. Isl1 se sastoji od dvije tandem Lim domena i homeodomain. Homeodomain, sa svojim helix-turn-spiralne strukture, veže se na regulatorne DNA sekvence ciljnih gena, dok Limskog domene su uglavnom uključeni u protein-protein interakcije koje reguliraju aktivnost LIM-HD [22]. Isl1 igra kritičnu ulogu u određivanju stanica, proliferaciju i diferencijaciju u živčanom sustavu [23, 24], srce [25], i hipofizu [26]. Osim toga, ekspresija Isl1 otkriven je u želučanoj mezenhimu [27, 28] i gastrointestinalnog epitela u embrijskom i odraslih miševa [29]. Međutim, uloga Isl1 u razvoju želuca još treba istražiti. U ovom istraživanju, ispitali smo Isl1 ekspresiju u želucu. Isl1 je vrlo izražena u stražnjem želuca u ranim fazama razvoja, i to uglavnom ograničena na glatkim mišićnim stanicama piloms. Ispitati Isl1 pregled ulogu u razvoju želuca, koriste smo tamoksifen-induktivni modela knockout miš. Može inducirati model je potreban jer Isl1 - /-
mutanti umiru na otprilike E10.5 zbog nedostataka u formiranju srca. Naši rezultati pokazuju da Isl1 je bitno za formiranje pyloric čovječje sloja u želucu organogeneze. Pregled Rezultati
Isl1 izražava se u embrionalnom miša želucu pregled smo ispitali Isl1 pregled razine mRNA u embrionalnom miša želuca stvarnost vrijeme kvantitativni PCR (RT-qPCR) i cijelo brdo in situ hibridizacije pregled (želja). Isl1 pregled mRNA u početku je bio otkriven na E11.5 pomoću RT-qPCR. Isl1 pregled dosegnuo najvišu razinu u E13.5, nakon čega slijedi oštar pad na E14.5 i nisu imali značajne promjene u odrasloj dobi (dodatne datotečne 1: Slika S1a). Ovaj rezultat je sličan prethodno izvješće [29]. Lokalizacija Isl1 pregled mRNA ekspresije istraživana je pomoću želju. Izvršili smo Isl1 pregled želju u embrionalnom želudac na E11.5, E13.5, E14.5 i. Na E11.5, Isl1 pregled je lokaliziran na stražnje polovine želuca (dodatne datotečne 1: Slika S1b). Međutim, Isl1 pregled ŽELJA signal je bio puno jači i kondenzira u piloms by E13.5 (Slika 1A). Kao što je razvoj želudac napredovala, piloms nastavili iskazivati ​​Isl1
i izražavanje Isl1 pregled proširiti i na potencijalnom pyloric sfinktera na E14.5 (Dodatni file 1: Slika S1b). Međutim, Isl1 pregled ŽELJA signal znatno oslabljena od E13.5 na E14.5. Ove Isl1 pregled ŽELJE rezultati složio s rezultatima Isl1 pregled RT-qPCR. Slika 1 Isl1 se izražava u razvoju miša želudac. (A) embrija analiza želudac ŽELJA pokazala da Isl1 pregled ekspresija ograničena na piloms na E13.5 (strelica). (B) Imunohistokemijsko bojanje Isl1 u želucu. Sekcije iz embrija raspoređeni u rostralno na kaudalnom sekvencu na E11.5 i E13.5 i Isl1 ekspresija uglavnom lokaliziran mezenhimu od stražnjeg želuca. Na E14.5 i E18.5, Isl1 vrlo je izražen u stanicama glatkih mišića piloms, iako je bilo nekih Isl1-pozitivnih stanica u lamina propria (strelica). Uvećanih slika u uokvirenih regija prikazani su u nastavku izvorne slike. D, dvanaesnika; Liv, jetre; Pa, gušterače; St, želudac. Mjerila izvornih slika: 100 mm; Mjerne letve od uvećanih slika:. 50 um pregled Zatim ocjenjuje Isl1 ekspresije proteina imunohistokemijski. Rezultati su pokazali da Isl1 uglavnom lokaliziran na stražnji želuca mezenhimu od E11.5 na E13.5, onda Isl1 je u stanicama glatkih mišića piloms (Slika 1B i dodatne datotečne 1: Slika S1c), a bio je i prepoznatljiv u lamina propria (Slika 1B, strelice). U odraslih miša želucu, samo nekoliko Isl1-pozitivne stanice su opažene u glatkom sloju mišića. (Dodatni file 1: Slika S1c) pregled Isl1-pozitivne stanice se istovremeno izložen sa oc-glatkih mišića aktin u embrionalnom miša želucu
da biste vidjeli je li Isl1 izraz se odnosio na glatke razvoj mišića od piloms, ispitali smo ekspresiju Isl1 i najraniji glatkih mišića čiji se α-SMA metodom imunofluorescencije. Rezultati pokazuju da je udio Isl1-pozitivnih stanica koje eksprimiraju α-SMA postupno povećana (Slika 2). Pri E11.5, bez α-SMA-pozitivne stanice bile su detektirane iako Isl1 je visoko izražen u mezenhimu od stražnjeg želuca. Pri E14.5, podskup Isl1-pozitivnih stanica, uglavnom onih u unutarnjem kružnom mišića (ICM) u pylorus bili α-SMA pozitivnih. Do E16.5, pilorisa čovječja ribica je prošla diferencijaciju [20]. Pri E18.5, većina Isl1-pozitivnih stanica u pylorus su α-SMA pozitivnih. Isl1 izraz ustrajao u zrelim pyloric ICM i čovječja ribica, i lamina propria stanice također izrazio Isl1 (Dodatni file 1: Slika S2). Osim toga, ekspresija Isl1 ispitan u humanim uzorcima hipertrofične stenozu pilorusa imunoflorescencijom, a rezultati su pokazali da Isl1 također je izražena u ljudskim stanicama glatkih mišića pylorus (Dodatni datoteka 1: Slika S3). Stoga, ovi rezultati pokazuju da Isl1 mogu sudjelovati u stvaranju piloričkog sfinktera. Slika 2 Double imunološko za Isl1 i α-glatkih mišića aktin u mišjim glatkih mišićnih stanica leđne piloms. Isl1 i α-SMA ko-ekspresija u stanicama glatkih mišića u E11.5, E14.5, E18.5 i. Žute isprekidane linije označavaju epitela membranu, bijele debele isprekidane linije pokazuju ICM i čovječja ribica granice i bijele točkaste linije označavaju čovječju ribicu i gušterača granicu. Crveno obojenje je Isl1, zelena obojenost a-SMA, a DAPI nuklearna counterstaining (DNA) je plava. α-SMA, α-glatkih mišića aktin; ICM, unutarnje kružne mišića; Čovječja ribica, vanjski uzdužni mišića; Pa, gušterače; St, želudac. Mjerila:. 50 um pregled Isl1 izraz učinkovito ablacijom u Isl1 pregled MCM /F pregled -inducible knockout miševa
Da bi istražili učinke Isl1 pregled, ablacija na razvoj želuca, koriste se Isl1
MCM /F pregled -inducible Cre (Isl1 pregled MCM /Del pregled) miševi (slika 3A) i Isl1 pregled F /+ m pregled leda bili su upotrijebljen kao kontrola [30, 31]. Embriji genotipizirane pomoću PCR na E18.5 (Dodatni file 1: Slika S4) i netaknuti ili mutant Isl1 pregled mRNA je istakla semi-kvantitativnog PCR (slika 3B). Slika 3 Učinkovitost Isl1 ablacije u želucima Isl1 MCM /Del mutant mišem želudaca na E18.5. (A) tamoksifen-induktivni Cre rekombinaze izrezano DNA sekvence između dva loxP
stranicama. (B) Isl1 pregled RNA su ablacijom u Isl1 pregled MCM /Del pregled mutanata želuca kao što se vidi po semi-kvantitativnog PCR. Isl1 pregled F /+ m pregled led pokazala 592 parova baza produkta, dok Isl1 pregled MCM /Del pregled miševa generira 303 parova baza produkta. (C) Isl1 bila je značajno dolje regulirana na razini proteina u Isl1 pregled MCM /Del pregled mutanata želuca kao što je prikazano western blot. Izraz embrija na E11.5 korišten je kao pozitivna kontrola. (D) Isl1 ekspresija proteina u Isl1
F /+ a pregled nd Isl1 pregled MCM /Del pregled embrionalna piloms. Izraz Isl1 znatno smanjena u Isl1 pregled MCM /Del pregled embrija želuca, kao što se vidi po imunofluorescencije. Slike u Isl1
F /+ jedan
nd Isl1
MCM /Del pregled obrađeni su na istom slajdu i snimljena u istom ekspozicijom. Povećani slike uokvirenih površina prikazani su na desnoj strani pripojenih slika. Žute strelice pokazuju reprezentativne Isl1-pozitivnih stanica i bijele strelice pokazuju reprezentativne Isl1-negativne stanice. Žute isprekidane linije označavaju epitela membranu. Mjerila:. 50 um pregled Western blot analize su pokazale da razina Isl1 proteina u embrionalnom želucu Isl1 pregled MCM /Del pregled miševa bile su značajno niže od onih u Isl1 pregled F /+ m pregled led (Slika 3C). Imunofluorescencija rezultati pokazali značajno smanjen Isl1 bojenje u piloms od Isl1 pregled MCM /Del pregled miševa u usporedbi s kontrolama (Slika 3D). Ovi podaci pokazuju da Isl1 pregled, izraz je zapravo dolje regulirano Isl1 pregled MCM /Del pregled mutanta želuci.
Pilorusa abnormalnosti u Isl1 pregled MCM /F pregled mutanata
Da bi istražili učinke Isl1 pregled, ablacija na razvoj želuca, usporedili smo morfološke i histološke razlike između Isl1 pregled MCM /Del pregled i Isl1 pregled F /+ s pregled tomachs na E18.5. Na E18.5, žuta tekućina zabilježen je u Isl1 pregled MCM /Del pregled, želuci, ali ne u želucima Isl1 pregled F /+ l pregled ittermates (Slika 4A, zvjezdica) , Histološki pregled je pokazao da je leđna pilorisa glatki sloj mišića je puno tanji u piloms od Isl1 pregled MCM /Del pregled miševa u usporedbi s kontrolnom skupinom (slika 4b). Ispitali smo ekspresiju i distribuciju a-SMA u oba Isl1 pregled MCM /Del pregled mutanata i Isl1 pregled F /+ p pregled ylorus. rezultati imunofluorescencije pokazali da nedostatak Isl1 dovela do gotovo potpune odsutnosti pyloric čovječje sloju na E18.5, a preostale stanice su labavo organizirane (Slika 5a, zvjezdice). Osim toga, stezanje u pyloric sfinktera je oslabljena u Isl1 pregled MCM /Del pregled mutant želuca u usporedbi s suženje u Isl1 pregled F /+ s pregled tomachs (slika 5B) , Nadalje, analizirali smo ekspresiju specifičnih proteina glatkih mišića Calponin-1 na E18.5 i imunofluorescencija rezultati pokazali da gubitak Isl1 rezultirao je u blizini odsutnosti Calponin-1 ekspresije u leđnoj pyloric čovječje sloj, slično rezultirati a- SMA (Dodatni file 1: Slika S5). Sox9 se izražava u oba epitela i mezenhimu [9], a potreban je za razvoj ribicu i formiranja pyloric sfinktera suženja [20]. Naši imunofluorescencija Rezultati su pokazali da Sox9 ostao na normalne razine u želucu epitela Isl1 pregled MCM /Del pregled miševi E14.5 i E18.5 (Slika 6, strelice), ali je područje pyloric glatkih mišića ekspresiju Sox9 znatno smanjena u Isl1 pregled MCM /del pregled mutanata u E14.5 (Slika 6a, zvjezdice) i odsutne E18.5 (Slika 6B, zvjezdice). Dakle, Isl1 pregled je potreban za Sox9 pregled izražavanja u leđnih pilorusa čovječja ribica stanica. Ovi rezultati pokazuju da Isl1 je kritična za regulaciju razvoja miša piloričkog glatkih mišića. Slika 4 Morfološke i histološke promjene u razvoju želudac od Isl1 MCM /Del mutantima. (A) Krupne i mikroskopske dokaze za nedostatke u želucu u Isl1 pregled MCM /del pregled miševa. Cijela montirati pogled na E18.5 u Isl1
F /+ a pregled ND Isl1 pregled MCM /Del pregled miš želuci. Isl1 pregled MCM /Del pregled mutanta želuci nedostajalo funkcionalnu pilorusa sfinktera (strelica), čime refluks fluida kao što je promatrana u mutanta embrija. Žuta tekućina je označen zvjezdicom. (B) hematoksilinom i eozinom bojenje Isl1
F /+ a pregled nd Isl1 pregled MCM /Del pregled miša pilorus na E18.5. Leđna pilorisa glatkih mišića (crni boksač regija) bio je istaknuta u Isl1
F /+ E pregled mbryos, ali je puno tanji u Isl1 pregled MCM /del pregled embrija. Ostatak pylorus bila histološki normalno. Zeleni isprekidane linije označavaju epitela membranu. Uvećanih slika u uokvirenih regija prikazani su u nastavku izvorne fotografije. Mjerila originalnih fotografija: 200 mm; Mjerne letve od uvećanih slika: 50 um. H &, E, hematoksilinom i eozinom
Slika 5 gubitka Isl1 ometa tvorbu leđnom pilorisa vanjskog uzdužnog mišića. (A) imunofluorescencija Isl1 i a-SMA u Isl1
F /+ a pregled nd Isl1 pregled MCM /Del pregled embrionalne pilorus na E18.5. Gubitak Isl1 rezultiralo gotovo potpuni gubitak a-SMA pozitivnih stanica u leđnoj piloričkog čovječje (zvjezdica). Žute isprekidane linije označavaju epitela membranu i bijele točkaste linije označavaju ICM i čovječja ribica granicu. Crveno obojenje je Isl1, zelena obojenost a-SMA, a DAPI nuklearna counterstaining (DNA) je plava. Mjerila: 50 um. (B) α-SMA imunofluorescencija Isl1
F /+ a pregled nd Isl1 pregled MCM /Del pregled embrionalne pilorus na E18.5. U usporedbi s Isl1 pregled f /+ e
mbryos, The pilorisa sfinkter suženje bio je veći u Isl1 pregled MCM /del pregled životinja. prikazana su mjerenja sfinkter suženja. Žute trake obilježiti piloms i istaknuti značajna razlika u širini između Isl1 pregled f /+ A
nd Isl1
MCM /del pregled uzoraka. Podaci su srednja vrijednost ± SEM (n = 6 pregled miševa po skupini), * P pregled < 0.05 (Studentov t-test pregled). Mjerila: 50 um. α-SMA, α-glatkih mišića aktin; ICM, unutarnje kružne mišića; Čovječja ribica, vanjski uzdužni mišića.
Slika 6 Gubitak Isl1 eliminira dorzalni pilorusa vanjski uzdužni mišića Sox9 izraz. (A) Dvostruko imunološko za Isl1 i Sox9 u leđnom piloms na E14.5. U nedostatku Isl1, domene mezodermalni stanica (zvjezdice) izražava Sox9 bio manji. (B) Dvostruko imunološko za Isl1 i Sox9 u leđnom piloms na E18.5. Može inducirati Isl1 nokaut učinkovito eliminira Isl1 izraza, uz popratni gubitak Sox9 izražavanja u leđnom čovječje stanica (zvjezdicu). Sox9 izraz bio normalan u želucu epitel na obje faze (strelica). Žute isprekidane linije označavaju epitela bazalnu membranu i bijele isprekidane linije odvojeno ICM i čovječja ribica. Crveno obojenje je Isl1, zelena obojenost Sox9 i DAPI nuklearna counterstaining (DNA) je plava. Mjerila: 50 um. ICM, unutarnje kružne mišića; Čovječju ribicu, vanjski uzdužni mišići. Pregled, Expression i distribucija proteina genskog produkta 9,5 (PGP9.5), marker unutrašnjom živčanog sustava [32], bio je netaknut na E18.5 u Isl1 pregled MCM /Del
mutant želuci (Dodatni file 1: Slika S6). Pankreasa i dvanaesniku homeobox gene 1 (Pdx1) se izražava u epitelnim stanicama antralnog-pilorisa segmenta i njušku duodenum [33]. Naši imunofluorescencija Rezultati su pokazali da Pdx1 izraz lica bio je sličan u Isl1 pregled MCM /Del pregled miševa u usporedbi s kontrolama na E18.5 (Dodatni file 1: Slika S7). Osim toga, osnovana je miš u želucu i dvanaesniku epitela granica između E14.5 i E16.5 [34] tom periodu se poklapa s razvojem čovječja ribica sloja [20]. mi smo testirali cjelovitost u želucu-tankom crijevu epitela piloričkog granice u E18.5 ispitivanjem ekspresije crijeva specifičnih markera epitela CdX2 [19]. Naši imunohistokemijski rezultati su pokazali da je položaj epitelne pyloric granice u Isl1 pregled MCM /Del pregled miševa bila je slična onoj od kontrole (dodatne datotečne 1: Slika S8). Ovi rezultati pokazuju da gubitak Isl1 ne utječe na inervaciju ili epitela razvoj piloms. Pregled Gubitak Isl1 ne utječe na proliferaciju ili apoptoze pyloric unutarnje kružne mišića i vanjskih uzdužnih mišićnih stanica
Da biste vidjeli je li Isl1 izraz odnosio na staničnu proliferaciju od pylorus ispitali smo ko-lokalizaciju Isl1 i proliferacijski markera bromodeoksiuridin (BrdU) putem imunofluorescencije u Isl1 pregled F /+ m pregled ledom. Naši rezultati pokazuju da BrdU-pozitivne stanice bile guste, na E11.5 i razasutih ICM i čovječja ribica regija na E14.5 i E18.5 (dodatne datotečne 1: Slika S9A). Osim toga, udio razmnožavanje ICM i čovječja ribica stanica nije se značajno razlikovala između Isl1 pregled MCM /Del pregled i Isl1 pregled F /+ m pregled leda na E18.5 ( Dodatni file 1:. Slika S9B)
procijeniti potencijalni utjecaj na apoptozu, ispitali smo odcijepi kaspaze 3 izražavanje na E18.5, a naši imunofluorescencija Rezultati su pokazali da nije bilo 3 kaspaze-pozitivne stanice u pyloric ICM ili čovječja ribica sloja od Isl1 pregled MCM /Del pregled i Isl1 pregled F /+ m pregled led (Dodatni file 1: Slika S10). Ovi podaci ukazuju na to da Isl1 ablacija ne utječe na proliferaciju ili apoptoze pyloric ICM i čovječja ribica stanica.
Gubitak rezultata Isl1 u smanjenu ekspresiju Gata3 Netlogu, gremlin Netlogu i Nkx2.5
Budući brojnim faktorima, uključujući Bapx1 pregled [18], Barx1 pregled [35], Gata3 pregled [19, 36], Gremlin pregled [5], Nkx2.5 pregled [2] i Six2 pregled [9], su izvijestili da se uključe u regulaciji pyloric razvoja, ispitali smo učinke gubitka Isl1 na izražavanje tih gena kod E14.5 i E18.5. RT-qPCR su rezultati pokazali da gubitak Isl1 pregled nije utjecao na izražavanje Bapx1 Netlogu ili Barx1 Netlogu na obje E14.5 ili E18.5 (Slika 7a, b). Na E18.5, α-SMA pregled i Six2 pregled količine bile su značajno niže u Isl1 pregled MCM /Del pregled miševa u usporedbi s kontrolnom skupinom (Slika 7b). U oba E14.5 i E18.5, Nkx2.5 Netlogu, Gata3 Netlogu i gremlin pregled razine mRNA u želucu Isl1 pregled MCM /Del pregled, miševi su bili niži od kontrola (Slika 7A, B). Gata3 pregled količine bile su oko 70% smanjena na obje faze ispitanih (Slika 7A, B). Na temelju tih rezultata, istražili smo Isl1
, Gata3
, Gremlin
i Nkx2.5 pregled izraz u Isl1
MCM /F
mutanta i Isl1 Netlogu F /+ s pregled tomachs pomoću želju. Rezultati pokazuju da je ekspresija svaka od ovih gena je uglavnom ograničena na piloričkog regiju, kao što je očekivano, Gata3 pregled, izraz je više smanjen u mutanta želucima; i Gremlin pregled i Nkx2.5
imao samo suptilne promjene (Slika 7e, F). Isl1 pregled i Gata3 pregled izraz bili su najjače pogođeni (Slika 7C, D). Ovi rezultati su u skladu s RT-qPCR podataka i sugeriraju da Isl1 regulira ekspresiju Gata3 Netlogu, gremlin Netlogu i Nkx2.5 Netlogu. Slika 7 ekspresiji gena u hindstomach u Isl1 MCM /Del mutantima. (A) RT-qPCR analiza razine mRNA za hindstomach obogaćen transkripcijski faktori u E14.5 ukazuje na značajno smanjenje α-SMA Netlogu, Six2 Nkx2.5 Netlogu, Gata3 Netlogu i gremlin pregled mRNA u Isl1 pregled MCM /del pregled mutanta želuci (n pregled = 4). Svi rezultati su normalizirani na razinama GAPDH pregled mRNA. (B) RT-qPCR analiza razine mRNA za hindstomach obogaćen transkripcijski faktori u E18.5 ukazuje na značajno smanjenje Nkx2.5 Netlogu, Gata3 Netlogu i gremlin pregled mRNA u Isl1
MCM /dEL pregled mutanta želuci (n pregled = 4). Svi rezultati su normalizirani na razinama GAPDH pregled mRNA. Podaci su srednja vrijednost ± SEM (n = 6 pregled miševa po skupini). * P izvoznici < 0,05 naspram Isl1
F /+ pregled; ** P izvoznici < 0,01 naspram Isl1
F /+ pregled (Studentov t-test pregled). (CF) Analiza ŽELJA mRNA potvrdila gubitak Isl1 Netlogu, Gata3 Netlogu, Gremlin pregled, a izraz Nkx2.5 pregled mRNA na E14.5 u Isl1 pregled MCM /DEL pregled mutanata želudac. Isl1 pregled i Gata3 pregled mRNA su teško regulirati na dolje u Isl1 pregled MCM /Del pregled miševa, dok Gremlin pregled i Nkx2.5 pregled, izraz su neznatno smanjeni. Strelice upućuju na pyloric sfinktera.
Isl1 cilja Gata3
i aktivira njegovu transkripciju
Gata3 pregled selektivno izražen u piloms razvijanja miša zametka u [19, 20]. Izražavanje oba Isl1 Netlogu i Gata3 pregled mRNA uočena je u piloms na E14.5, ali da li Gata3 i Isl1 su izražene u istim stanicama nije istražena. Dakle, ispitali smo ekspresiju Isl1 i Gata3 by imunofluorescencija analiza. Rezultati pokazuju da i Isl1 Gata3 proteini su se koeksprimira u istim stanicama pylorus na E14.5 i E18.5 u Isl1 pregled F /+ c pregled kontrolno želudac (Slika 8). Osim toga, područje izražavanja Gata3 bila je značajno manja u Isl1 pregled MCM /Del pregled mutant pilorisa sloj glatkih mišića u E14.5 (Slika 8A) i to je bio izgubljen u E18.5 u pyloric čovječja ribica sloja (Slika 8B). Dakle, Isl1 pregled je potreban za Gata3 pregled izražavanja u leđnoj pyloric čovječja ribica sloja. Da bi istražili da li Isl1 regulira razvoj pilorusa izravno regulira Gata3
, proveli smo bioinformatičkih analizu Gata3 genomske lokusu. Miša Gata3 pregled gen sadrži nekoliko navodne Isl1 elemente odgovora (Atta /TAAT) na -2,832 parova baza (bp) na +1,002 bp od pokretanja transkripcije stranicama [37]. identificirali smo 10 područja koja se nalaze na pretpostavljenu Isl1 vezujući položaj (Slika 9), te 10 parova odgovarajućih primera su dizajnirani da pojača ove krajeve sljedeće kromatina imuno (chip) studije koje koriste antitijela na Isl1. Imunoistaloži genomske DNA dobiven od pilorusa područja mišjih zametaka na E14.5. Od 10 navodnih Isl1 obvezujuća oblasti, dvije zasebne regije, u -2,558 bp do -2,303 bp (P1 regija) i -1,081 bp do -855 bp (P6 regija), zauzeli su Isl1 proteina. Ovaj rezultat je potvrdio i semi-kvantitativnog PCR (Slika 9B) i metode puta obogaćivanje (Slika 9C). Slika 8 Gubitak Isl1 eliminira dorzalni pilorusa vanjski uzdužni mišića Gata3 izraz. (A) Dvostruko imunološko za Isl1 i Gata3 u leđnom piloms na E14.5. Regija mezodermalni stanica (zvjezdice) izražava Gata3 bio manji u Isl1 pregled MCM /Del pregled piloms nego Isl1
Fl +
. (B) Dvostruko imunološko za Isl1 i Gata3 u leđnom piloms na E18.5. Može inducirati Isl1 nokaut učinkovito eliminira Isl1 izraza, uz popratni gubitak Gata3 izražavanja u leđnom čovječje stanica (zvjezdicu). Žute isprekidane linije označavaju epitela membranu i bijele točkaste linije označavaju ICM i čovječja ribica granicu. Bijela strelica pokazuje nespecifičan mrlju. Svi autori pročitali i odobrili konačnu rukopis. Pregled

• Rijetka uzrok probavnih phytobezoars: Diospyrns lotus
• Faktor transkripcije FOXO4 se regulirati na dolje i inhibira proliferaciju tumora i metastaza u želučanom cancer