LIM Homeodomena transkripcijski faktor Isl1 usmerja normalno pilorično razvoj z usmerjanjem Gata3

LIM Homeodomena transkripcijski faktor Isl1 usmerja normalno pilorično razvoj z usmerjanjem Gata3
Abstract
Ozadje
nenormalnosti v pilorično razvoju ali v funkciji krčenja na pilorus vzrok refluksa dvanajstnika vsebina v želodcu in poveča tveganje za želodčne metaplazijo in raka. Nenormalnosti pilorično regiji so povezana tudi s prirojenimi napakami, kot je dokaj pogosto neonatalne hipertrofično pilorično zaklopke in primarne duodenogastric refluksa. Zato je razumevanje pilorično razvoj je zelo kliničnega pomena. Tukaj smo preiskali vlogo LIM Homeodomena transkripcijski faktor Isl1 v pilorično razvoju.
Rezultati
Preizkus Isl1 izražanja v razvoju miške želodec z imunohistokemijo, cel mount in situ
hibridizacija in v realnem času kvantitativne PCR dokazali da Isl1 je zelo izražena v razvoju miške želodec, predvsem v gladko mišično plasti pilorus. Isl1 izraz je bila preučena tudi imunofluorescenco v človeški hipertrofično pilorično stenozo, kjer je bilo ugotovljeno, da ima večina gladkih mišičnih celic za izražanje Isl1. Isl1 funkcija
in razvoja zarodka želodcu so raziskovali uporaben tamoksifen-inducibilne Isl1
modela knockout miške. Isl1
pomanjkljivost je privedlo do skoraj popolne odsotnosti pilorično zunanji vzdolžni mišične plasti na embrionalnih dan 18,5, kar je v skladu z Gata3
null fenotipa miške. Kromatin imuno luciferazne testi in elektroforezne premik testi mobilnosti je pokazala, da Isl1 zagotavlja normalno pilorično razvoj neposredno ciljanje Gata3
.
Sklepe
Ta študija kaže, da je v Isl1-Gata3
prepis regulativni osi bistvena za normalno piloricne razvoj. Te ugotovitve so zelo klinično pomembna, in lahko pomaga bolje razumeti poti, ki vodijo do pilorusa bolezni.
Ključne besede
α-gladke mišice aktina Gata3 Isl1 pilorus Ozadje
vretenčar črevesju je izjemen struktura, ki zaužije in prebavi hrane, absorbira hranila in odstranjuje odpadne snovi. Črevo izvira iz preproste cevaste strukture, sestavljene iz treh zarodnih plasti, vključno z osnovnim endoderm, okoliškega splanhični mezoderma, in ectoderm [1-3]. V zarodkih miši, postane gut potiskane po anterior-posterior, hrbtne, trebušne, levo-desno, in radialni osi. Črevesje cev je sestavljena iz foregut, midgut in epigastru vzdolž anterior-posterior osi [4, 5]. Kot razvoj napreduje, foregut povzroča požiralnika, želodca, jeter, pljuč in trebušne slinavke. Midgut tvori tanko črevo in epigastru razvije v debelem črevesu [1, 5-8].
Želodec izhaja iz zadnjo foregut. Želodec morfološko razlikuje od foregut cevi okoli zarodka dan 9.5 (E9.5) in širitev mesenchyme pred želodca omogoča domena želodcu, da je viden začetek na E10.5 [9]. Mezenhimske celice želodca diferencirajo v štiri različne koncentričnih plasti, vključno lamine proprie, muscularis sluznice in krožno in vzdolžno gladkih mišic na različnih stopnjah razvoja zarodka [10]. Z E11.5, želodec je izrazito povečan. Želodec gladkih mišic razlikuje na E13, s posebnim slojem a-gladka aktin (α-SMA) -positive celic, ki se pojavljajo in krožni mišično plast tvori vsej želodcu [11]. Gladka mišica Plast v zožen bodoči piloricne sfinktru območju približno E14.5 [2, 9]. Pri E18.5 je piloricne sfinkter začne delovati pri preprečevanju refluks dvanajstniku vsebine v želodcu [9].
Posteriorno ali pilorus del želodca je anatomsko spoj med želodcu in dvanajsterniku. Na terminus od pilorus, lahko različne zaklopk zavihki v pilorusa sfinktru treba gledati [2]. V normalnih fizioloških pogojih, želodec odvisna od njene peristaltično krčenja zmelje in potiska delno prebavi hrane in pilorus opira na odebeljeno pilorusa sfinkter, da nadzorujejo pretok hrane v tankem črevesu. Nenormalnosti pilorusa razvoju ali v funkciji krčenja na pilorus povzročilo refluks dvanajstniku vsebine v želodcu in poveča tveganje za nastanek želodčnega metaplazijo in raka [12, 13]. Nepravilnosti iz pilorus so povezane s prirojenimi napakami [14-16]. Zato je bilo veliko pozornosti nameniti regulacijskih elementov in poti razvoja želodcu, še posebej pilorus in pilorično razvoj sfinktru.
Prejšnja podatkov chick predlagal, da kostni morfogenetski protein (BMP) signalizacijo ureja mezenhimskih izražanje Nkx2.5
in Sox9
, ki vpliva na značaj pilorično epitela, vendar nima nobenega vpliva na pilorično gladkih mišic [5, 17], kar kaže, da mezenhimskih signalizacijo z neznanimi dejavniki vplivajo na pilorično epitelne fenotip. Pri miših, so molekularnih mehanizmov pilorično nastanka malo razume, z relativno malo od dejavnikov, ki so potrebni za ki so bile ugotovljene normalne piloricne razvoj. Tisti, ki so bili vključuje Sox9
[17], Six2
[9], Bapx1
[18], Nkx2.5
[3, 17], Gremlin
[9], in Gata3
[19, 20]. Ablacijo od Homeodomena transkripcijskega faktorja, Six2
, izraženo v posteriorni želodcu, moti odebelitev pilorusa gladkega mišičja sloja in oslabi konstrikcijo pilorus sfinktru. Poleg tega je izguba Six2
odpravlja Sox9
izraz, in zmanjšuje Nkx2.5
in Gremlin
izraz v pilorus, čeprav ta izraz kasneje povrne [9], kar kaže, da Six2
, Sox9
, Nkx2.5
in Gremlin
so potrebni za pilorično razvoj. Poleg tega Nkx2.5
, Sox9
in Gata3
so co-izražena v hrbtnih piloricne zunanji vzdolžni mišic (OLM) plast, ki zapade med E14.5 in E16.5. Po izbrisu Nkx2.5
ali Gata3
hrbtna piloricne OLM je skoraj odsoten in zožitev pilorus mišice zapiralke je oslabljen [20].
LIM Homeodomena (LIM-HD) transkripcijski faktor Isl1 je bil prvotno ugotovljeno, da deluje kot insulin gen ojačevalec zavezujoč beljakovin [21]. Isl1 je sestavljena iz dveh tandem Lim domen in Homeodomena. Homeodomena, s helix-turn-vijačnice strukturo, ki se veže na regulatornih zaporedij DNA ciljnih genov, medtem ko so LIM domen ukvarja predvsem protein-proteinskih interakcij, ki urejajo dejavnost Lim-HD [22]. Isl1 igra ključne vloge pri določanju celic, proliferacijo in diferenciacijo v živčnem sistemu [23, 24], srce [25], in hipofize [26]. Poleg tega je bila Isl1 izraz odkrita v želodčnem mesenchyme [27, 28] in gastrointestinalne epitela v obeh embrionalnih in odraslih miših [29]. Vendar pa je vloga Isl1 pri razvoju želodcu je treba še raziskati. V tej študiji, smo pregledali Isl1 ekspresijo v želodcu. Isl1 je bil močno izražen v posteriorni želodcu v zgodnjih fazah razvoja in je bila v glavnem omejena na gladkih mišičnih celicah pilorus. Preučiti Isl1
funkcijo v razvoju želodcu, smo uporabili tudi tamoksifen-inducibilne modela knockout miške. Inducibilni model je bil potreben, ker Isl1 - /-
mutanti umre približno E10.5 zaradi napak v oblikovanju srca. Naši rezultati kažejo, da je Isl1 bistvenega pomena za tvorbo pilorično OLM plasti v želodcu organogenezo.
Rezultati
Isl1 je izražena v zametkih želodcu miške
Proučili smo Isl1
ravni mRNA v embrionalni želodcu miške, ki v realnem kvantitativna PCR (RT-qPCR) in cela mount in situ
hibridizacije (wish). Isl1
mRNA je bila prvotno odkrita E11.5 ga RT-qPCR. Isl1
dosegla najvišjo raven v E13.5, sledi strm padec v E14.5, in niso imeli nobenih bistvenih sprememb v odrasli dobi (Dodatni datotek 1: Slika S1a). Ta rezultat je bil podoben predhodnim poročilom [29]. Lokalizacija Isl1
ekspresijo mRNA smo raziskovali uporabo ŽELJA. Izvedli smo Isl1
ŽELJA zarodkov v želodcu ob E11.5, E13.5 in E14.5. Na E11.5 je Isl1
lokalizirana na zadnjo polovico želodca (Dodatni datoteka 1: Slika S1b). Vendar pa je bil v Isl1
ŽELJA signala močnejši in kondenzira v pilorus jih E13.5 (slika 1A). Kot razvoj želodec napredovala, da pilorus še naprej izražajo Isl1
in izražanje Isl1
razširiti na bodoči pilorično mišice zapiralke na E14.5 (Dodatni datotek 1: Slika S1b). Vendar pa je v Isl1
ŽELJA signala precej oslabljen od E13.5 do E14.5. Ti Isl1
Rezultati WISH strinjal z rezultati Isl1
RT-qPCR. Slika 1 Isl1 je izražena v razvoju miške želodec. (A), embrionalne analiza želodcu WISH je pokazala, da je bila Isl1
izraz omejena na pilorus v E13.5 (puščica). (B) Imunohistokemijsko za Isl1 v želodcu. Profili iz zarodkov so razporejeni v lezije rostralnog za repne zaporedoma v E11.5 in E13.5 in Isl1 izraz je bil predvsem lokalizirana na mesenchyme z zadnjo želodcu. Pri E14.5 in E18.5 je Isl1 močno izražena v gladkih mišičnih celicah pilorus, čeprav je bilo nekaj Isl1-pozitivnih celic v lamele proprie (puščic). Razširjene slike v okvirčkih regijah so prikazani spodaj izvirnih slik. D, dvanajsternik; Liv, jetra; Pa, trebušne slinavke; St, želodec. Lestvica palice originalnih slik: 100 mikrometrov; obsega palice iz povečanih slik: 50. um
Nato smo ocenili Isl1 beljakovin izražanje imunohistokemijo. Rezultati so pokazale, da je bila Isl1 predvsem lokalizirana posteriorni želodčne mesenchyme je od E11.5 do E13.5, potem smo Isl1 izražen v gladkih mišičnih celicah pilorus (sliki 1B in dodatnega datoteka 1: Slika S1c) in je prav tako mogoče zaznati v lamina Propria (slika 1B, puščice). Pri odraslih želodcu miške, so pri gladkem mišičnem sloju opazili le nekaj Isl1-pozitivnih celic. (Dodatni datoteka 1: Slika S1c)
Isl1-pozitivnih celic se sočasno izražene z a-gladko aktin v embrionalni želodcu miške
da bi videli, ali je bil Isl1 izraz, povezan z gladko razvoj mišic od pilorus smo opisali izražanje Isl1 in najzgodnejši gladkih označevalne α-SMA z uporabo imunofluorescence. Rezultati so pokazali, da delež Isl1-pozitivnih celic, ki izražajo α-SMA postopoma povečuje (slika 2). Na E11.5, ni bilo zaznati α-SMA-pozitivne celice, čeprav je Isl1 visoko izraženo v mesenchyme z zadnjo želodcu. Na E14.5, podskupina Isl1-pozitivnih celic, predvsem tistih v notranjem krožno mišico (ICM) v pilorus so α-SMA pozitiven. Z E16.5 je piloricne OLM že opravili diferenciacijo [20]. Na E18.5, je bila večina Isl1-pozitivnih celic v pilorus α-SMA pozitiven. Isl1 izraz vztrajal pri zrelih pilorično ICM in človeško ribico in lamina Propria celice izrazil Isl1 (Dodatni datoteka 1: Slika S2). Poleg tega je bila Isl1 izraz preučiti v človeških vzorcih hipertrofično pilorično stenozo imunofluorescencno in rezultati pokazali, da je bila Isl1 odraža tudi v človeških gladkih mišičnih celicah pilorus (Dodatni datotek 1: Slika S3). Zato ti rezultati kažejo, da lahko Isl1 sodeluje pri tvorbi pilorično sfinkter. Slika 2 Double imunskim barvanjem za Isl1 in α-gladke mišice aktina v mišjih gladke mišične celice hrbtne pilorus. Isl1 in α-SMA co-izraz v gladkih mišičnih celicah na E11.5, E14.5 in E18.5. Rumene prekinjene črte označujejo epitelijskih bazalne membrane je, bele debele prekinjene črte označujejo ICM in človeško ribico mejo, in bele prekinjene črte označujejo človeško ribico in trebušne slinavke meje. Rdeče obarvanje je Isl1 je zeleno obarvanje a-SMA, in DAPI jedrska counterstaining (DNA) je modre barve. α-SMA, α-gladkih mišic aktina; ICM, notranji krožni mišice; OLM, zunanji vzdolžni mišice; Pa, trebušne slinavke; St, želodec. Lestvica bari:. 50 mikrometrov
Isl1 izraz dejansko ablacije v Isl1
MCM /F
-inducible knockout miši
Da bi raziskali učinke Isl1
ablacijo na razvoj želodcu, smo uporabili Isl1
MCM /F
-inducible Cre (Isl1
MCM /Del
) miši (slika 3A) in Isl1
F /+ m
ledu so bili uporabimo kot kontrole [30, 31]. Zarodki so genotipizacijo s PCR na E18.5 (Dodatni datotek 1: Slika S4) in nedotaknjena ali mutant Isl1
mRNA je odlikuje semi-kvantitativno PCR (slika 3B). Slika 3 Učinkovitost Isl1 ablacijo v želodcih iz Isl1 MCM /Del želodcev mutant z miško na E18.5. (A) tamoksifen-inducibilne Cre rekombinaze izrezanega DNA sekvence obdajata dve loxP
mestih. (B) Isl1
RNA so ablacije v Isl1
MCM /DEL
mutiranih želodcem, kot jih semi-kvantitativno PCR videl. Isl1
F /+ m
led pokazala par izdelek 592 osnovno ker Isl1
MCM /DEL
miši ustvarila par izdelka 303 bazo. (C) Isl1 je bila precej navzdol urediti na ravni beljakovin v Isl1
MCM /DEL
mutiranih želodcev kot je razvidno iz zahodne blot. Izražanje zarodkov na E11.5 je bila uporabljena kot pozitivno kontrolo. (D) Isl1 protein izraz v Isl1
F /+ A
nd Isl1
MCM /DEL
zarodka pilorus. Isl1 izraz se je občutno zmanjšal Isl1
MCM /Del
zarodkov želodcev, kot imunofluorescencno videl. Slike v Isl1
F /+ na
nd Isl1
MCM /Del
, obdelujejo na isti diapozitiv in fotografirali ob istem izpostavljenosti. Povečane podobe boxed območij so prikazane na desni strani združenih slik. Rumene puščice kažejo reprezentativnih Isl1-pozitivnih celic in bele puščice kažejo reprezentativnih Isl1 negativnih celic. Telefonski prekinjene črte označujejo epitelne kleti membrano. Lestvica bari:. Analize 50 mikrometrov
Western blot pokazala, da je količina beljakovin Isl1 v embrionalni želodcu Isl1
MCM /DEL
miši so bile bistveno nižje od tistih v Isl1
F /+ m
led (slika 3C). Rezultati imunofluorescenčnega dokazali bistveno zmanjša Isl1 obarvanje v pilorus od Isl1
MCM /DEL
miši v primerjavi s kontrolno skupino (slika 3D). Ti podatki kažejo, da je Isl1
izraz učinkovito navzdol urejeno v Isl1
MCM /Del
mutant želodci.
Pilorično nenormalnosti Isl1
MCM /F
mutanti
Da bi raziskali učinke Isl1
ablacijo na razvoj želodcu, smo primerjali morfološke in histološke razlike med Isl1
MCM /Del
in Isl1
F /+ s
tomachs na E18.5. Na E18.5, opazili rumene tekočine v Isl1
MCM /DEL
želodci, vendar ne v želodcih iz Isl1
F /+ l
ittermates (slika 4A, zvezdica) . Histološka preiskava pokazala, da je hrbtna piloricne gladkih mišic plast veliko tanjši v pilorus za Isl1
MCM /DEL
miši v primerjavi s kontrolno skupino (slika 4B). preučiti smo izražanja in distribucije a-SMA tako Isl1
MCM /DEL
mutanti in Isl1
F /+ p
ylorus. Rezultati imunofluorescenčnega je pokazala, da pomanjkanje Isl1 prišlo do skoraj popolne odsotnosti pilorično OLM plasti na E18.5 in preostale celice ohlapno organizirane (slika 5A, zvezdice). Poleg tega je bila zožitev pilorusa mišice zapiralke oslabljen v Isl1
MCM /DEL
mutant želodcev v primerjavi z zožitvijo v Isl1
F /+ s
tomachs (slika 5B) . Poleg tega smo analizirali ekspresijo gladkih mišic specifično beljakovino Calponin-1 na E18.5 in imunofluorescenčnega rezultatov je pokazala, da je izguba Isl1 je vplivalo tudi na bližnji odsotnosti Calponin-1 izražanja v hrbtnem pilorično OLM plasti, podobno kot posledico z a- SMA (Dodatni datoteka 1: Slika S5). Sox9 se izraža tako v epiteliju in mesenchyme [9], ki je potrebna za razvoj človeške ribice in oblikovanje pilorično sfinktru zožitve [20]. Naši imunofluorescenčnega Rezultati so pokazali, da Sox9 ostala na normalno raven v želodcu epitela Isl1
MCM /DEL
miši na E14.5 in E18.5 (slika 6 puščic), vendar je območje pilorično gladkih mišic ekspresijo je Sox9 bistveno zmanjša Isl1
MCM /dEL
mutanti na E14.5 (slika 6A, zvezdice) in odsotnosti na E18.5 (slika 6B, zvezdice). Tako je bilo potrebno Isl1
za Sox9
izražanja v hrbtnih pilorično človeško ribico celic. Ti rezultati kažejo, da je Isl1 ključnega pomena za uravnavanje razvoja miške pilorično gladkih mišic. Slika 4 morfološke in histološke spremembe v razvoju želodec za Isl1 MCM /Del mutantov. (A) Gross in mikroskopski dokaz za napake želodca v Isl1
MCM /DEL
miši. Cela mount poglede na E18.5 v Isl1
F /+ neke
ND Isl1
MCM /DEL
miške želodci. Isl1
MCM /DEL
mutant želodci manjkalo funkcionalno pilorično mišice zapiralke (glave puščice), s čimer refluks tekočine kot je bilo ugotovljeno v mutiranih zarodkov. Rumena tekočina je označena z zvezdico. (B) Hematoxylin in eozin obarvanje Isl1
F /+ A
nd Isl1
MCM /DEL
miška pilorus na E18.5. Hrbtna piloricne gladkih mišic (črni škatli regija) je bilo poudarjeno v Isl1
F /+ e
mbryos, vendar je veliko tanjši v Isl1
MCM /DEL
zarodkov. Preostanek pilorus histološko normalno. Zelene prekinjene črte označujejo epitelne kleti membrano. Razširjene slike v okvirčkih regijah so prikazani spodaj originalnih fotografij. Lestvica palice originalnih fotografij: 200 mikrometrov; obsega palice iz povečanih slik: 50 um. H &. E, hematoksilin in eozin
Slika 5 izgubo Isl1 moti nastanek hrbtne piloricne zunanji vzdolžni mišice. (A) Imunofluorescenčni za Isl1 in a-SMA v Isl1
F /+ A
nd Isl1
MCM /DEL
zarodka pilorus na E18.5. Izguba Isl1 povzročila skoraj popolno izgubo a-SMA-pozitivnih celic v hrbtni pilorično človeška ribica (zvezdice). Rumene prekinjene črte označujejo epitelijskih bazalne membrane na in bele prekinjene črte kažejo ICM in človeško ribico mejo. Rdeče obarvanje je Isl1 je zeleno obarvanje a-SMA, in DAPI jedrska counterstaining (DNA) je modre barve. Lestvica bari: 50 um. (B) α-SMA imunofluorescenčni od Isl1
F /+ A
nd Isl1
MCM /DEL
zarodka pilorus na E18.5. piloricne mišica zapiralka zožitev primerjavi z Isl1
F /+ e
mbryos, je širši Isl1
MCM /DEL
živali. Meritve sfinkter zoženje so prikazani. Rumene palice razmejiti pilorus in poudarjajo opazne razlike v širini med Isl1
F /+ a
nd Isl1
MCM /DEL
vzorcev. Podatki so povprečje ± SEM (n
= 6 miši na skupino) * P
< 0,05 (Studentov t
-test). Lestvica bari: 50 um. α-SMA, α-gladkih mišic aktina; ICM, notranji krožni mišice; OLM, zunanji vzdolžni mišice.
Slika 6 Izguba Isl1 odpravlja hrbtni pilorično zunanji vzdolžni mišic Sox9 izraz je. (A) Dvojni imunskim barvanjem za Isl1 in Sox9 na hrbtnem pilorus na E14.5. V odsotnosti Isl1 je bila domena mesodermal celic (zvezdice), ki izraža Sox9 manjša. (B) Dvojni imunskim barvanjem za Isl1 in Sox9 na hrbtnem pilorus na E18.5. Inducibilni Isl1 knockout učinkovito odpraviti Isl1 izraz, s sočasno izgubo Sox9 izražanja v hrbtni človeško ribico celic (zvezdice). Sox9 izraz je normalno v želodcu epitela na obeh stopnjah (puščice). Rumene prekinjene črte označujejo epitelijskih kleti membrano in bele pikčaste črte ločen ICM in človeško ribico. Rdeče obarvanje je Isl1, zeleno obarvanje je Sox9 in DAPI jedrska counterstaining (DNA) je modre barve. Lestvica bari: 50 um. ICM, notranji krožni mišice; Človeška ribica, zunanji vzdolžni mišic.
Izražanje in porazdelitev genskega beljakovin izdelka 9.5 (PGP9.5), proti želodčnemu živčnega sistema označevalec [32], je bil nedotaknjen v E18.5 v Isl1
MCM /Del
mutant želodci (Dodatni datoteka 1: Slika S6). Trebušne slinavke in dvanajstnika homeobox gen 1 (Pdx1) je izražena v epitelnih celicah antralnih-piloricne segmenta in lezije rostralnog dvanajstnika [33]. Naši imunofluorescenčnega Rezultati so pokazali, da je Pdx1 izraz v Isl1 podobno
MCM /DEL
miši v primerjavi s kontrolno skupino na E18.5 (Dodatni datotek 1: Slika S7). Poleg tega je bil želodec miške in dvanajstnika epitelijskih meja vzpostavljena med E14.5 in E16.5 [34], to obdobje sovpada z razvojem OLM plasti [20]. Testirali smo celovitost črevesa epitelijske pilorično meji želodčno-small na E18.5 s preučevanjem izražanja na črevesa specifične epitela marker Cdx2 [19]. Naši Imunohistokemija rezultati pokazali, da
MCM /DEL
miši je bil položaj pilorično meje epitela v Isl1 podoben nadzor (Dodatni datotek 1: Slika S8). Ti rezultati kažejo, da izguba Isl1 ne vpliva inervacijo ali epitelijskih razvoj pilorus.
Izguba Isl1 ne vpliva na širjenje ali apoptozo pilorično notranji krožni mišice in zunanjih vzdolžnih mišičnih celicah PODJETJA
Da bi videli, ali je bila Isl1 izraz povezane za celično proliferacijo v pilorus smo opisali sodelovanje lokalizacijo Isl1 in proliferativni marker bromdeoksiuridina (brdu) z uporabo imunofluorescence v Isl1
F /+ m
ledu. Naši rezultati so pokazali, da so bili brdu-pozitivnih celic gosto na E11.5 in razpršene po vsej ICM in človeško ribico regijah na E14.5 in E18.5 (Dodatni datoteka 1: Slika S9a). Poleg tega je delež bolj razširjeni ICM in človeško ribico celic ni pomembno razlikovala med Isl1
MCM /Del
in Isl1
F /+ m
led na E18.5 ( Dodatna datoteka 1:. Slika S9b)
za oceno potencialnega vpliva na apoptozo, smo pregledali razcepi kaspaze 3 izražanje pri E18.5, in naši rezultati imunofluorescenčnega pokazali, ni bilo kaspaze 3-pozitivnih celic v pilorično ICM ali OLM plasti od Isl1
MCM /Del
in Isl1
F /+ m
led (Dodatni datoteka 1: Slika S10). Ti podatki kažejo, da Isl1 ablacijo ne vpliva na širjenje ali apoptozo pilorično ICM in človeško ribico celic.
Izguba rezultatov Isl1 v zmanjšano izražanje Gata3
, Gremlin
in Nkx2.5
Ker je število dejavnikov, vključno Bapx1
[18], Barx1
[35], Gata3
[19, 36], Gremlin
[5], Nkx2.5
[2] in [9], so poročali Six2
, da sodelujejo pri urejanju pilorično razvoja, smo preučili učinke izgube Isl1 na izražanje teh genov pri E14.5 in E18.5. Rezultati RT-qPCR je pokazala, da je izguba Isl1
ne vpliva na izražanje Bapx1
ali Barx1
bodisi E14.5 ali E18.5 (slika 7A, B). Na E18.5 so α-SMA
in Six2
ravni mRNA bistveno nižje v Isl1
MCM /DEL
miši v primerjavi s kontrolno skupino (slika 7b). Na obeh E14.5 in E18.5, Nkx2.5
, Gata3
in Gremlin
mRNA v želodcu Isl1
MCM /DEL
Miši so bile nižje od kontrole (slika 7A, B). Gata3
ravni mRNA je bilo približno 70% znižala na obeh obravnavanih stopnjah (slika 7A, B). Na podlagi teh rezultatov smo raziskovali Isl1
, Gata3
, Gremlin
in Nkx2.5
izraz v Isl1
MCM /F
mutant in Isl1
F /+ s
tomachs uporabo ŽELJA. Rezultati so pokazale, da je bila ekspresija vsak od teh genov v glavnem omejen na pilorusa regijo, kot je bilo pričakovano; Gata3
izraz je bolj zmanjšati mutiranih želodcev; in Gremlin
in Nkx2.5
le imel subtilne spremembe (slika 7e, F). Isl1
in Gata3
izraz so najbolj močno prizadeta (slika 7c, D). Ti rezultati so skladni s podatki RT-qPCR in kažejo, da Isl1 uravnava izražanje Gata3
, Gremlin
in Nkx2.5
. Slika 7 Aberrant izražanje genov v hindstomach v Isl1 MCM /Del mutantov. (A) RT-qPCR analizo ravni mRNA-hindstomach obogatena transkripcijskih faktorjev na E14.5 kaže znatno zmanjšanje α-SMA
, Six2 Nkx2.5
, Gata3
in Gremlin
mRNA v Isl1
MCM /dEL
mutant želodci (n
= 4). Vsi rezultati so bili normalizirani na ravni GAPDH
mRNA. (B) RT-qPCR analizo ravni mRNA-hindstomach obogatena transkripcijskih faktorjev na E18.5 kaže znatno zmanjšanje Nkx2.5
, Gata3
in Gremlin
mRNA v Isl1
MCM /dEL
mutant želodci (n
= 4). Vsi rezultati so bili normalizirani na ravni GAPDH
mRNA. Podatki so povprečje ± SEM (n = 6
miši na skupino). * P
< 0,05 primerjavi Isl1
F /+
; ** P
< 0,01 primerjavi Isl1
F /+
(Studentov t
-test). (CF) analiza ŽELJA mRNA potrdili izgubo Isl1
, Gata3
, Gremlin
in Nkx2.5
mRNA izraz na E14.5 v Isl1
MCM /DEL
mutant želodcev. Isl1
in Gata3
mRNA so močno navzdol urejeno v Isl1
MCM /DEL
miši, medtem ko so Gremlin
in Nkx2.5
izraz nekoliko zmanjša. Puščice kažejo na pilorično mišice zapiralke.
Isl1 cilji Gata3
in aktivira njegovo transkripcijo
Gata3
selektivno izražena v pilorus v razvoju zarodka miške [19, 20]. Izražanje tako Isl1
in Gata3
mRNA opazili v pilorus na E14.5, ampak ali so Gata3 in Isl1 izražena v istih celicah ni bila raziskana. Zato smo preučili izražanje Isl1 in Gata3 s imunofluorescenčni analize. Rezultati pokazali, da so bile Isl1 in Gata3 proteinov co-izražene v istih celic pilorus v E14.5 in E18.5 v Isl1
F /+ c
kontrolna želodcev (slika 8). Poleg tega je bila površina izražanje Gata3 bistveno manjši Isl1
MCM /DEL
mutant piloricne gladko plast mišic na E14.5 (slika 8A) in je bil izgubljen na E18.5 v pilorično OLM plasti (Slika 8B). Tako je bilo potrebno Isl1
za Gata3
izražanja v hrbtnem pilorično OLM plasti. Da razišče, ali Isl1 ureja razvoj pilorusa, ki jih neposredno ureja Gata3
smo izvedli bioinformatiÄŤnih analizo genomske lokusu Gata3. Miška Gata3
gen vsebuje več domnevna Isl1 odzivne elemente (ATTA /TAAT) pri -2,832 baznih parov (bt) do +1,002 bp iz prepisa iniciacijskih mestih [37]. Ugotovili smo 10 območij, ki so vsebovali domnevnega Isl1 vezavo (slika 9A), in 10 parov ustreznih primerji so bili zasnovani za razširitev te regije naslednje kromatina imuno (čip) študije z uporabo protiteles Isl1. Imunoprecipitirali genomsko DNA smo dobili iz pilorusa regij zarodkov miši na E14.5. Od 10 domnevnih Isl1 zavezujočih območjih, dve diskretni regijah, v -2,558 bp do -2,303 bp (P1 regiji) in -1,081 bp do -855 bp (P6 regija) so zasedli Isl1 beljakovin. Ta rezultat je potrdil semi-kvantitativno PCR (slika 9B) in metode krat obogatitve (Slika 9C). Slika 8 Izguba Isl1 odpravlja hrbtni pilorično zunanji vzdolžni mišic Gata3 izraz. (A) Dvojni imunskim barvanjem za Isl1 in Gata3 na hrbtnem pilorus na E14.5. Regija mesodermal celic (zvezdice), ki izraža Gata3 je bil manjši v Isl1
MCM /DEL
pilorus kot Isl1
Fl +
. (B) Dvojni imunskim barvanjem za Isl1 in Gata3 na hrbtnem pilorus na E18.5. Inducibilni Isl1 knockout učinkovito odpraviti Isl1 izraz, s sočasno izgubo Gata3 izražanja v hrbtni človeško ribico celic (zvezdice). Rumene prekinjene črte označujejo epitelijskih bazalne membrane na in bele prekinjene črte kažejo ICM in človeško ribico mejo. Bela arrowhead označuje nespecifične madež. Vsi avtorji prebrali in potrdil končni rokopis.

• Redek vzrok prebavil phytobezoars: Diospyros lotus
• transkripcijski faktor FOXO4 IS navzdol urejen in zavira tumorskih in metastaz pri raku želodca