LIM homeodomain transkripsjonsfaktor Isl1 dirigerer normal pyloric utvikling ved å målrette Gata3

LIM homeodomain transkripsjonsfaktor Isl1 dirigerer normal pyloric utvikling ved å målrette Gata3
Abstract
Bakgrunn
Misdannelser i pyloric utvikling eller i kontraktile funksjon av pylorus årsaken reflux av duodenal innholdet i magen og øke risikoen for mage metaplasi og kreft. Abnormiteter i sekken er også knyttet til medfødte defekter som relativt vanlig neonatal hypertrofisk pylorusstenose, og primær duodenogastric reflux. Derfor forstå pyloriske utvikling er av stor klinisk relevans. Her undersøkte vi rollen som LIM homeodomain transkripsjonsfaktor Isl1 i pylorusstenose utvikling.
Resultater
Undersøkelse av Isl1 uttrykk i utviklings mus magen ved immunhistokjemi, hele mount in situ
hybridisering og sanntids kvantitativ PCR demonstrert som Isl1 er sterkt uttrykt i utviklingen av mus mage, i hovedsak i glatt muskulatur lag av pylorus. Isl1 uttrykk ble også undersøkt av immunfluorescens i menneskelig hypertrofisk pylorusstenose der flertallet av glatte muskelceller ble funnet å uttrykke Isl1. Isl1
funksjon i embryonale magen utvikling ble undersøkt ved hjelp av en tamoxifen-induserbar Isl1
knockout mus modell. Isl1
mangel førte til nesten fullstendig fravær av pyloric ytre langsgående muskel lag på embryonale dag 18,5, som er konsistent med Gata3
null mus fenotype. Chromatin immunoprecipitation, luciferase analyser, og elektro mobilitet skift analyser viste at Isl1 sikrer normal pyloric utvikling av direkte rettet mot Gata3
.
Konklusjoner
Denne studien viser at Isl1-Gata3
transkripsjon reguleringsaksen er viktig for normal pylorusstenose utvikling. Disse funnene er svært klinisk relevant og kan bidra til å bedre forstå veier fører til pyloriske sykdom.
Nøkkelord
α-glatt muskel aktin Gata3 Isl1 pylorus Bakgrunn
virveldyr gut er en bemerkelsesverdig struktur som får i seg og fordøyer maten, absorberer næringsstoffer, og fjerner avfallsstoffer. Tarmen stammer fra et enkelt rørformet struktur som består av tre bakterie lag inkludert en underliggende endoderm, et området innvoller mesoderm, og en ektoderm [1-3]. I mus embryoer, blir tarmen mønster langs anterior-posterior, dorsal-ventral, venstre-høyre, og radiale akser. Tarmen røret består av den forutgående, midttarmen, og hindgut langs dens anterior-posterior aksen [4, 5]. Ettersom utviklingen skrider frem, den forutgående gir opphav til øsofagus, mage, lever, lunger, og bukspyttkjertel. Midgut danner tynntarmen og den hindgut utvikler seg til tykktarmen [1, 5-8].
Magen er avledet fra den bakre forutgående. Magen morfologisk skiller fra forutgående rør rundt embryonale dag 9,5 (E9.5) og utvidelse av pre-gastrisk mesenchyme tillater domenet av magen for å være synlig begynnelsen på E10.5 [9]. Mesenchymalceller av magen differensiere inn i fire forskjellige konsentriske lag, inkludert lamina propria, muskularis slimhinner, og sirkulære og langsgående glatt muskulatur på ulike stadier av embryoutvikling [10]. Ved E11.5, er magen tydelig forstørret. Magen glatt muskulatur skiller ved E13, med et tydelig lag av α-glattmuskel aktin (α-SMA) -positive celler som opptrer og en sirkulær muskelsjikt som danner hele magen [11]. Glatt muskulatur lag blir tykkere i den innsnevrede potensielle pyloric sphincter regionen på ca E14.5 [2, 9]. Ved E18.5 begynner pyloriske ringmuskelen for å fungere i å hindre tilbakeløp av duodenale innholdet i magen [9].
Bakre eller pylorus del av magesekken er den anatomiske overgangen mellom magesekken og tolvfingertarmen. Ved endestasjon for pylorus, kan de forskjellige klaffe flaps av pyloric sphincter bli sett [2]. Under normale fysiologiske forhold, avhenger av magen på sin peristaltiske sammentrekning å slipe og støte den delvis fordøyet mat, og pylorus er avhengig av sin fortykkede pyloriske ringmuskelen for å styre strømmen av mat inn i tynntarmen. Unormaliteter i pyloric utvikling eller i den kontraktile funksjon av pylorus forårsake refluks av duodenale innholdet i magen og øke risikoen for magekreft metaplasi og [12, 13]. Patologi i pylorus er knyttet til medfødte defekter [14-16]. Derfor har mye oppmerksomhet blitt gitt til reguleringselementene og veier av magen utvikling, spesielt pylorus og pylorusstenose sphincter utvikling.
Tidligere data i chick antydet at benmorfogenetisk protein (BMP) signal regulerer mesenchymale uttrykk for Nkx2.5
og Sox9
, som påvirker karakteren av pyloric epitelet, men har ingen virkning på pyloric glatt muskulatur [5, 17], som tyder på at mesenchymale signalering av ukjente faktorer som påvirker den pyloriske epiteliale fenotype. I mus, er molekylære mekanismer for pyloric formasjon lite forstått, med relativt få av faktorene som kreves for normal pyloric utvikling har blitt identifisert. De som har vært inkluderer Sox9 product: [17], Six2 product: [9], Bapx1 product: [18], Nkx2.5 product: [3, 17], Gremlin product: [9], og Gata3 product: [19, 20]. Ablasjon av homeodomain transkripsjonsfaktor, Six2
, uttrykt i bakre magen, forstyrrer fortykkelse av pyloric glatt muskulatur lag og demper innsnevring av pylorus sphincter. I tillegg, tap av Six2
eliminerer Sox9
uttrykk, og reduserer Nkx2.5 Hotell og Gremlin
uttrykk i pylorus, selv om dette uttrykket senere gjen [9], noe som tyder på at Six2
, Sox9
, Nkx2.5
, og Gremlin
kreves for pylorusstenose utvikling. I tillegg Nkx2.5
, Sox9
, og Gata3
er co-uttrykt i ryggsekken ytre langsgående muskel (OLM) lag som forfaller mellom E14.5 og E16.5. Etter sletting av Nkx2.5
eller Gata3
, er ryggsekken OLM nesten fraværende og innsnevring av pylorus lukkemuskelen er svekket [20].
LIM homeodomain (LIM-HD) transkripsjonsfaktor Isl1 var opprinnelig funnet å fungere som en insulingenet forsterker bindingsprotein [21]. Isl1 består av to tandem LIM domener og en homeodomain. Den homeodomain, med sin helix-sving-heliks struktur, binder seg til regulatoriske DNA-sekvenser av målgener, mens LIM domenene er hovedsakelig involvert i protein-protein interaksjoner som regulerer aktiviteten av LIM-HD [22]. Isl1 spiller viktige roller i celle besluttsomhet, spredning og differensiering i nervesystemet [23, 24], hjerte [25], og hypofysen [26]. I tillegg har Isl1 ekspresjon blitt detektert i mave mesenchyme [27, 28] og gastrointestinale epitel i begge embryonale og voksne mus [29]. Men rollen som Isl1 i magen utviklingen har ennå å bli utforsket. I denne studien undersøkte vi Isl1 uttrykk i magen. Isl1 ble sterkt uttrykt i bakre magen i tidlige stadier av utviklingen, og ble i hovedsak begrenset til de glatte muskelcellene i pylorus. For å undersøke Isl1
funksjon i magen utvikling, vi utnyttet en tamoxifen-induserbar knockout mus modell. En induserbar modellen var nødvendig fordi Isl1 - /-
mutanter dø på ca E10.5 grunn av defekter i hjertedannelse. Våre resultater viser at Isl1 er viktig for dannelsen av pyloric OLM laget under magen organogenesen.
Resultater
Isl1 er uttrykt i embryonale mus magen
Vi undersøkte Isl1
mRNA nivåer i embryonale mus magen av real- tid kvantitativ PCR (RT-qPCR) og hele mount in situ
hybridisering (WISH). Isl1
mRNA ble først oppdaget ved E11.5 av RT-qPCR. Isl1
nådd det høyeste nivået på E13.5, etterfulgt av en kraftig nedgang på E14.5, og hadde ingen vesentlige endringer i voksen alder (tilleggsfiler 1: Figur S1 A). Dette resultatet var lik en tidligere rapport [29]. Lokalisering av Isl1
mRNA uttrykk ble undersøkt ved hjelp av WISH. Vi utførte Isl1
WISH i embryonale magen på E11.5, E13.5 og E14.5. På E11.5, ble Isl1
lokalisert til bakre halvdel av magen (tilleggsfiler 1: Figur S1b). Men Isl1
WISH signal var mye sterkere og kondensert i pylorus ved E13.5 (figur 1A). Som mage utviklingen gikk fremover, pylorus fortsatte å uttrykke Isl1 Hotell og uttrykk for Isl1
utvidet til potensielle pyloric sphincter ved E14.5 (tilleggsfiler 1: Figur S1b). Men Isl1
WISH signal svekket seg betydelig fra E13.5 til E14.5. Disse Isl1
WISH resultater enig med Isl1
RT-qPCR resultater. Figur 1 Isl1 er uttrykt i utviklingen av mus magen. (A) Embryonic mage WISH-analyse viste at Isl1
ekspresjon var begrenset til pylorus ved E13.5 (pil). (B) Immunhistokjemisk farging for Isl1 i magen. Seksjoner fra embryoer ble arrangert i rostral til kaudal sekvens på E11.5 og E13.5, og Isl1 uttrykk var hovedsakelig lokalisert til mesenchyme av bakre magen. Ved E14.5 og E18.5, ble Isl1 sterkt uttrykt i glatte muskelceller fra pylorus, selv om det var noen Isl1-positive celler i lamina propria (pilspisser). Forstørrede bilder i eske regionene er vist nedenfor originale bilder. D, tolvfingertarm; Liv, leveren; Pa, bukspyttkjertel; St, mage. Skala barer av originalbildene: 100 mikrometer; skala barer av forstørrede bilder:. 50 mikrometer
Vi så vurdert Isl1 protein uttrykk ved immunhistokjemi. Resultatene viste at Isl1 var hovedsakelig lokalisert til bakre magen mesenchyme fra E11.5 til E13.5, så Isl1 ble uttrykt i glatte muskelceller i pylorus (Figur 1B og tilleggsfiler 1: Figur S1c), og var også påvises i lamina propria (figur 1B, pilspisser). I voksen mus magen, ble bare noen få Isl1-positive celler observert i glatt muskulatur lag. (Tilleggsfiler 1: Figur S1c)
Isl1-positive celler er co-uttrykkes med α-glatt muskulatur aktin i embryonale mus magen
for å se om Isl1 uttrykk relatert til glatte muskelutvikling av pylorus, undersøkte vi uttrykket av Isl1 og tidligste glatt muskel markør α-SMA hjelp immunfluorescens. Resultatene viste at andelen av Isl1-positive celler som uttrykker α-SMA gradvis øket (figur 2). Ved E11.5, ble det ikke α-SMA-positive celler detektert, selv om Isl1 var sterkt uttrykt i mesenchyme av den bakre magen. Ved E14.5, en undergruppe av Isl1-positive celler, hovedsakelig de som er i den indre sirkulære muskel (ICM) av pylorus, ble α-SMA-positive. Ved E16.5 har pyloric OLM allerede gjennomgått differensiering [20]. Ved E18.5, de fleste av Isl1-positive celler i pylorus var α-SMA-positive. Isl1 uttrykk vedvarte i moden pyloric ICM og OLM, og lamina propria celler også uttrykt Isl1 (tilleggsfiler 1: Figur S2). I tillegg ble Isl1 uttrykk undersøkt i humane prøver av hypertrofisk pylorusstenose ved immunfluorescens, og resultatene viste at Isl1 ble også uttrykt i humane glatte muskelceller i pylorus (Tilleggs fil 1: Figur S3). Derfor er disse resultatene tyder på at Isl1 kan delta i dannelsen av pyloric sphincter. Figur 2 dobbel immunofarging for Isl1 og α-glattmuskel aktin i mus glatte muskelceller dorsal pylorus. Isl1 og α-SMA co-uttrykk i glatte muskelceller ved E11.5, E14.5 og E18.5. Gule stiplede linjene markerer epithelial basalmembran, hvite tykke stiplede linjene indikerer ICM og OLM grensen, og hvite stiplede linjene indikerer OLM og bukspyttkjertel grense. Red farging er Isl1, grønne flekker er a-SMA, og DAPI atomkontra (DNA) er blå. α-SMA, α-glatt muskulatur aktin; ICM, indre sirkulære muskler; OLM, ytre langsgående muskel; Pa, bukspyttkjertel; St, mage. Skala barer:. 50 mikrometer
Isl1 uttrykk effektivt ablated i Isl1
MCM /F
-inducible knockout mus
å undersøke effektene av Isl1
ablasjon på magen utvikling, benyttet vi Isl1
MCM /F
-inducible Cre (Isl1
MCM /Del
) mus (figur 3A) og Isl1
F /+ m
isen var anvendt som kontroller [30, 31]. Embryoene ble genotypet ved PCR ved E18.5 (tilleggsfiler 1: Figur S4) og intakt eller mutant Isl1
mRNA ble preget av semi-kvantitativ PCR (figur 3B). Figur 3 Effektivitet av Isl1 ablasjon i magen på Isl1 MCM /Del mutant mus magene på E18.5. (A) Tamoxifen-induserbar Cre rekombinase skåret DNA-sekvenser flankert av to loxP
nettsteder. (B) Isl1
RNA-nivå ble ablated i Isl1
MCM /Del
mutante mager som sett av semi-kvantitativ PCR. Isl1
F /+ m
isen viste en 592 basepar produkt mens Isl1
MCM /Del
mus generert en 303 basepar produkt. (C) Isl1 var signifikant nedregulert på protein nivåer i Isl1
MCM /Del
mutante mager som vist ved western blot. Uttrykk av embryoer ved E11.5 ble brukt som positiv kontroll. (D) Isl1 protein uttrykk i Isl1
F /+ en
nd Isl1
MCM /Del
embryonale pylorus. Isl1 uttrykk ble betydelig redusert i Isl1
MCM /Del
embryonale mager, som sett av immunfluorescens. Bilder i Isl1
F /+ en
nd Isl1
MCM /Del
ble behandlet på samme lysbilde og fotografert på samme eksponering. Forstørrede bilder av eske områdene vises på høyre side av de fusjonerte bilder. Gule pilspisser viser representative Isl1-positive celler, og hvite pilspisser viser representative Isl1-negative celler. Gule stiplede linjene markerer epithelial basalmembran. Skala barer:. 50 mikrometer
Western blot analyser viste at Isl1 protein nivåer i embryonale magen av Isl1
MCM /Del
mus var betydelig lavere enn i Isl1
F /+ m
is (Figur 3C). Immunofluorescence resultater viste signifikant redusert Isl1 flekker i pylorus av Isl1
MCM /Del
mus sammenlignet med kontroller (Figur 3D). Disse dataene viser at Isl1
uttrykk var effektivt nedregulert i Isl1
MCM /Del
mutante mager.
Pyloriske unormalt i Isl1
MCM /F
mutanter
for å undersøke effekten av Isl1
ablasjon på magen utvikling, sammenlignet vi morfologiske og histologiske forskjeller mellom Isl1
MCM /Del Hotell og Isl1
F /+ s
tomachs på E18.5. På E18.5, ble gul væske observert i Isl1
MCM /Del
magen, men ikke i magen på Isl1
F /+ l
ittermates (figur 4A, asterisk) . Histologisk undersøkelse viste at ryggsekken glatt muskulatur lag var mye tynnere i pylorus av Isl1
MCM /Del
mus sammenlignet med kontroller (figur 4B). Vi undersøkte uttrykk og distribusjon av α-SMA både Isl1
MCM /Del
mutanter og Isl1
F /+ p
ylorus. Immunofluorescence Resultatene viste at Isl1 mangel førte til nesten fullstendig fravær av pyloric OLM lag på E18.5, og gjenværende celler ble løst organisert (figur 5A, stjernetegn). I tillegg ble innsnevring av pyloric sphincter svekkes i Isl1
MCM /Del
mutante mager sammenlignet med innsnevring i Isl1
F /+ s
tomachs (figur 5B) . Videre, analyserte vi ekspresjon av glatt muskulatur spesifikt protein Calponin-1 ved E18.5, og immunofluorescens-resultatene viste at tap av Isl1 resulterte også i nesten fravær av Calponin-1-ekspresjon i dorsal pyloriske OLM lag, tilsvarende resultat med α- SMA (tilleggsfiler 1: Figur S5). Sox9 er uttrykt i både epitel og mesenchyme [9] og er nødvendig for utvikling av OLM og dannelse av pyloriske ringmuskelen sammensnøring [20]. Våre immunfluorescens Resultatene viste at Sox9 holdt seg normale nivåer i mage epitel Isl1
MCM /Del
mus ved E14.5 og E18.5 (figur 6, pilspisser), men arealet av pyloric glatt muskulatur uttrykker Sox9 ble betydelig redusert i Isl1
MCM /Del
mutanter ved E14.5 (Figur 6A, stjernetegn) og fraværende på E18.5 (figur 6B, stjernetegn). Dermed ble Isl1
nødvendig for Sox9
uttrykk i ryggsekken OLM celler. Disse resultatene indikerer at Isl1 er kritisk for å regulere utviklingen av mus pyloriske glatt muskulatur. Figur 4 morfologiske og histologiske forandringer i utviklingen magen av Isl1 MCM /Del mutanter. (A) Brutto og mikroskopiske bevis for mage defekter i Isl1
MCM /Del
mus. Hele montere visninger på E18.5 i Isl1
F /+ en
nd Isl1
MCM /Del
muse mager. Isl1
MCM /Del
mutant magene manglet en funksjonell pyloric sphincter (pilspiss), og dermed lar reflux av væske som observert i mutant embryoer. Gul væske er angitt med asterisk. (B) Hematoxylin og eosin farging av Isl1
F /+ en
nd Isl1
MCM /Del
mus pylorus på E18.5. Rygg pyloric glatt muskulatur (sort eske region) var fremtredende i Isl1
F /+ e
mbryos, men var mye tynnere i Isl1
MCM /Del
embryoer. Resten av pylorus var histologisk normale. Grønne stiplede linjene markerer epithelial basalmembran. Forstørrede bilder i eske regionene er vist nedenfor originale bilder. Skala barer av originale bilder: 200 mikrometer; skala barer av forstørrede bilder: 50 mikrometer. H &. E, hematoxylin og eosin
Figur 5 Tap av Isl1 forstyrrer dannelsen av den dorsale pyloric ytre langsgående muskel. (A) Immunofluorescensanalyse av Isl1 og α-SMA i Isl1
F /+ en
nd Isl1
MCM /Del
embryonale pylorus på E18.5. Tap av Isl1 resulterte i nesten fullstendig tap av a-SMA-positive celler i den dorsale pyloric OLM (stjerne). Gule stiplede linjene markerer den epiteliale basalmembran og hvite stiplede linjene indikerer ICM og OLM grense. Red farging er Isl1, grønne flekker er a-SMA, og DAPI atomkontra (DNA) er blå. Skala barer: 50 mikrometer. (B) α-SMA immunfluorescens av Isl1
F /+ en
nd Isl1
MCM /Del
embryonale pylorus på E18.5. Sammenlignet med Isl1
F /+ e
mbryos, pyloric sphincter innsnevring var bredere i Isl1
MCM /Del
dyr. Sphincter innsnevring målinger er vist. Gule barer avgrense pylorus og markere markant forskjell i bredden mellom Isl1
F /+ A
nd Isl1
MCM /Del
prøver. Dataene er gjennomsnitt ± SEM (n
= 6 mus per gruppe), * P
< 0,05 (Student t
-test). Skala barer: 50 mikrometer. α-SMA, α-glatt muskulatur aktin; ICM, indre sirkulære muskler; OLM, ytre langsgående muskel.
Figur 6 Tap av Isl1 eliminerer ryggsekken ytre langsgående muskel Sox9 uttrykk. (A) Double farging for Isl1 og Sox9 i rygg pylorus på E14.5. I fravær av Isl1, domenet av mesodermal celler (stjerne) som uttrykker Sox9 var mindre. (B) Double farging for Isl1 og Sox9 i rygg pylorus på E18.5. Induserbar Isl1 knockout effektivt eliminert Isl1 uttrykk, med samtidig tap av Sox9 uttrykk i dorsal OLM celler (stjerne). Sox9 uttrykk var vanlig i magen epitel på begge trinn (pilspisser). Gule stiplede linjene markerer den epiteliale basalmembran og hvite stiplede linjer separat ICM og OLM. Red farging er Isl1, er grønn farging Sox9, og DAPI atomkontra (DNA) er blå. Skala barer: 50 mikrometer. ICM, indre sirkulære muskler; OLM, ytre langsgående muskel.
Expression og distribusjon av protein genprodukt 9,5 (PGP9.5), en enteric nervesystemet markør [32], var intakt ved E18.5 i Isl1
MCM /Del
mutant magene (tilleggsfiler 1: Figur S6). Pankreas og duodenal homeobox gen 1 (Pdx1) uttrykkes i epitel-celler i antral-pyloriske segment og den rostrale duodenum [33]. Våre immunofluorescence Resultatene viste at Pdx1 uttrykk var lik i Isl1
MCM /Del
mus sammenlignet med kontroller ved E18.5 (tilleggsfiler 1: Figur S7). I tillegg ble musemagesekken og tolvfinger epitelial grense etablert mellom E14.5 og E16.5 [34], denne perioden faller sammen med utviklingen av OLM sjiktet [20]. Vi testet integriteten til mage-tynntarmen epitelial pyloric grensen ved E18.5 ved å undersøke ekspresjon av en tarm-spesifikk markør epitelial Cdx2 [19]. Våre immunhistokjemi Resultatene viste at plasseringen av epitel pyloric grensen i Isl1
MCM /Del
mus var lik som kontroller (tilleggsfiler 1: Figur S8). Disse resultater indikerer at tapet av Isl1 ikke påvirker innervasjon eller epitelial utvikling av pylorus.
Tap av Isl1 ikke påvirker proliferasjon eller apoptose av pyloric indre sirkulære muskel og ytre langsgående muskel celler
å se om Isl1 ekspresjon var beslektet til celle spredning av pylorus, undersøkte vi samlokalisering av Isl1 og proliferativ markør bromdeoksyuridin (BrdU) ved hjelp av immunfluorescens i Isl1
F /+ m
is. Våre resultater viste at BrdU-positive celler var tett på E11.5 og spredt over hele ICM og OLM regioner på E14.5 og E18.5 (tilleggsfiler 1: Figur S9A). I tillegg har andelen av prolifererende ICM og OLM celler var ikke signifikant forskjellig mellom Isl1
MCM /Del Hotell og Isl1
F /+ m
isen på E18.5 ( Tilleggs fil. 1: Figur S9b)
å vurdere en potensiell innvirkning på apoptose, undersøkte vi kløyvet caspase 3 uttrykk ved E18.5, og våre immunofluorescence resultatene viste at det var ingen caspase 3-positive celler i pyloriske ICM eller OLM lag av Isl1
MCM /Del Hotell og Isl1
F /+ m
is (tilleggsfiler 1: Figur S10). Disse dataene indikerer at Isl1 ablasjon ikke påvirker spredning eller apoptose av pyloric ICM og OLM celler.
Tap av Isl1 resultater i redusert uttrykk for Gata3
, Gremlin
, og Nkx2.5
siden et antall faktorer, inkludert Bapx1 product: [18], Barx1 product: [35], Gata3 product: [19, 36], Gremlin product: [5], Nkx2.5 product: [2] og Six2 product: [9], har blitt rapportert å være involvert i reguleringen av pyloric utvikling, undersøkte vi effekten av tap av Isl1 på uttrykket av disse genene på E14.5 og E18.5. RT-qPCR resultatene viste at tap av Isl1
påvirket ikke uttrykk for Bapx1
eller Barx1
på enten E14.5 eller E18.5 (figur 7A, B). På E18.5, α-SMA Hotell og Six2
mRNA nivåene var signifikant lavere i Isl1
MCM /Del
mus sammenlignet med kontroller (figur 7B). At både E14.5 og E18.5, Nkx2.5
, Gata3
, og Gremlin
mRNA nivåer i magen av Isl1
MCM /Del
mus var lavere enn kontroller (figur 7A, B). Gata3
mRNA nivåer var ca 70% redusert på begge trinn undersøkt (Figur 7A, B). Basert på disse resultatene, vi undersøkt Isl1
, Gata3
, Gremlin
, og Nkx2.5
uttrykk i Isl1
MCM /F
mutant og Isl1
F /+ s
tomachs hjelp WISH. Resultatene viste at ekspresjon av hvert av disse genene var hovedsakelig begrenset til den sekken, som forventet; Gata3
uttrykket ble mer redusert i mutant mager; og Gremlin Hotell og Nkx2.5
hadde bare små endringer (figur 7E, F). Isl1 Hotell og Gata3
uttrykk var sterkest berørt (figur 7C, D). Disse resultatene var konsistente med RT-qPCR data og foreslår at Isl1 regulerer uttrykket av Gata3
, Gremlin
, og Nkx2.5
. Figur 7 Aberrant genuttrykk i hindstomach i Isl1 MCM /Del mutanter. (A) RT-qPCR analyse av mRNA nivåer av hindstomach-beriket transkripsjonsfaktorer ved E14.5 viser betydelig reduksjon av α-SMA
, Six2 Nkx2.5
, Gata3
, og Gremlin
mRNA i Isl1
MCM /Del
mutant magene (n
= 4). Alle resultater ble normalisert til nivåer av GAPDH-mRNA
. (B) RT-qPCR analyse av mRNA nivåer av hindstomach-beriket transkripsjonsfaktorer ved E18.5 indikerer en betydelig reduksjon av Nkx2.5
, Gata3
, og Gremlin
mRNA i Isl1
MCM /Del
mutant magene (n
= 4). Alle resultater ble normalisert til nivåer av GAPDH-mRNA
. Dataene er gjennomsnitt ± SEM (n = 6
mus pr gruppe). * P
< 0,05 versus Isl1
F /+
; ** P
< 0,01 versus Isl1
F /+ plakater (Student t
-test). (CF) WISH mRNA-analyse bekreftet tap av Isl1
, Gata3
, Gremlin
, og Nkx2.5
mRNA uttrykk ved E14.5 i Isl1
MCM /Del
mutant magene. Isl1 Hotell og Gata3
mRNA ble alvorlig nedregulert i Isl1
MCM /Del
mus, mens Gremlin Hotell og Nkx2.5
uttrykk ble noe redusert. Piler peker til pyloric sphincter.
Isl1 rettet Gata3 Hotell og aktiverer sin transkripsjon
Gata3
selektivt uttrykt i pylorus i utviklingsmuseembryo [19, 20]. Uttrykk for både Isl1 Hotell og Gata3
mRNA ble observert i pylorus på E14.5, men om Gata3 og Isl1 er uttrykt i de samme cellene har ikke blitt utforsket. Derfor undersøkte vi uttrykk for Isl1 og Gata3 ved immunfluorescens analyser. Resultatene viste at Isl1 og Gata3 proteiner ble ko-uttrykt i de samme cellene i pylorus ved E14.5 og E18.5 i Isl1
F /+ c
-regulering magene (figur 8). I tillegg er det område som uttrykker Gata3 var signifikant mindre i Isl1
MCM /Del
mutant pyloric glattmuskellaget ved E14.5 (figur 8A) og det var tapt ved E18.5 i pyloric OLM sjiktet (Figur 8B). Dermed ble Isl1
nødvendig for Gata3
uttrykk i ryggsekken OLM lag. For å undersøke om Isl1 regulerer pyloric utvikling ved direkte å regulere Gata3
utførte vi bioinformatikk analyse av Gata3 genomisk locus. Musen Gata3
genet inneholder flere mulige Isl1 responselementer (ATTA /TAAT) på -2,832 basepar (bp) til 1002 bp fra transkripsjonsinitieringsseter områder [37]. Vi identifiserte 10 områder som inneholdt en antatt Isl1 bindingssete (figur 9A), og 10 par av tilsvarende primere ble konstruert for å amplifisere disse regionene følgende kromatin immunoutfelling (chip) studier med antistoff mot Isl1. Immunopresipitert genomisk DNA ble innhentet fra pyloriske regioner av mus embryoer ved E14.5. Av de 10 antatte Isl1 bindende områder, to adskilte områder, i -2558 bp til -2303 bp (P1 region) og -1081 bp til -855 bp (P6 region), ble okkupert av Isl1 protein. Dette resultatet ble bekreftet ved semi-kvantitativ PCR (figur 9B) og folden berikelse metode (figur 9C). Figur 8 Tap av Isl1 eliminerer ryggsekken ytre langsgående muskel Gata3 uttrykk. (A) Double farging for Isl1 og Gata3 i rygg pylorus på E14.5. Regionen mesodermal celler (stjernetegn) uttrykker Gata3 var mindre i Isl1
MCM /Del
pylorus enn Isl1 hoteller, FL +
. (B) Double farging for Isl1 og Gata3 i rygg pylorus på E18.5. Induserbar Isl1 knockout effektivt eliminert Isl1 uttrykk, med samtidig tap av Gata3 uttrykk i dorsal OLM celler (stjerne). Gule stiplede linjene markerer den epiteliale basalmembran og hvite stiplede linjer indikerer ICM og OLM grense. Hvit pilhode angir ikke-spesifikk flekk. Red farging er Isl1, er grønn farging Gata3, og DAPI atomkontra (DNA) er blå. Skala barer: 50 mikrometer. Alle forfattere lese og godkjent den endelige manuskriptet.

• En sjelden årsak til gastrointestinale phytobezoars: diospyros lotus
• Transkripsjonsfaktor FOXO4 er nedregulert og hemmer tumor spredning og metastase i magekreft