LIM fattore di trascrizione homeodomain Isl1 dirige il normale sviluppo del piloro di mira GATA3

LIM fattore di trascrizione homeodomain Isl1 dirige il normale sviluppo del piloro di mira GATA3
Abstract
sfondo
Anomalie nello sviluppo pilorica o in funzione contrattile della causa reflusso piloro del contenuto duodenale nello stomaco e aumenta il rischio di metaplasia gastrica e cancro. Anomalie della regione pilorica sono anche legati a difetti congeniti, come la stenosi pilorica ipertrofica neonatale relativamente comune, e reflusso duodenogastric primaria. Pertanto, la comprensione dello sviluppo pilorica è di grande rilevanza clinica. Qui, abbiamo studiato il ruolo del fattore di trascrizione LIM homeodomain Isl1 nello sviluppo pilorica.
Risultati
L'esame di espressione Isl1 nello sviluppo di stomaco mouse immunoistochimica, tutto il montaggio in situ
ibridazione e real-time PCR quantitativa dimostrato che Isl1 è altamente espresso nello sviluppo del mouse stomaco, principalmente nello strato di muscolatura liscia del piloro. espressione Isl1 è stato esaminato anche mediante immunofluorescenza in stenosi pilorica ipertrofica umana, dove sono stati trovati ad esprimere Isl1 la maggior parte delle cellule muscolari lisce. Isl1 funzione
nello sviluppo embrionale stomaco è stata studiata utilizzando un tamoxifene-inducibile Isl1
modello di topo knockout. carenza Isl1
ha portato alla quasi totale assenza dello strato muscolare longitudinale esterno pilorica al giorno embrionale 18,5, che è coerente con GATA3
fenotipo nullo mouse. Cromatina immunoprecipitazione, saggi di luciferasi, e saggi di mobilità elettroforetica rivelato che Isl1 assicura il normale sviluppo del piloro di mira direttamente GATA3
.
Conclusioni
Questo studio dimostra che il Isl1-GATA3
trascrizione asse normativo è essenziale per normale sviluppo del piloro. Questi risultati sono estremamente clinicamente rilevanti e possono aiutare a comprendere meglio le vie che portano alla malattia pilorica.
Parole
muscolare α-actina liscia GATA3 Isl1 piloro Sfondo
L'intestino dei vertebrati è una notevole struttura che ingerisce e digerisce il cibo, assorbe i nutrienti, e rimuove i prodotti di scarto. L'intestino ha origine da una semplice struttura tubolare composta da tre strati germinali tra cui un endoderma sottostante, un mesoderma splancnico circostante, e un ectoderma [1-3]. In embrioni di topo, l'intestino diventa modellato lungo la antero-posteriore, dorso-ventrale, sinistra-destra, e gli assi radiali. Il tubo intestinale è costituito dalla foregut, midgut e hindgut lungo il suo asse anteriore-posteriore [4, 5]. Dato che lo sviluppo progredisce, il foregut dà luogo alla esofago, stomaco, fegato, polmoni e pancreas. Il midgut forma il piccolo intestino e hindgut sviluppa nell'intestino crasso [1, 5-8].
Lo stomaco è derivato dal foregut posteriore. Lo stomaco differenzia morfologicamente dal tubo foregut intorno embrionale giorno 9,5 (E9.5) e l'espansione del mesenchima pre-gastrico permette il dominio dello stomaco per essere all'inizio visibile a E10.5 [9]. cellule mesenchimali di stomaco si differenziano in quattro strati concentrici distinti, tra cui lamina propria, muscolare mucose, e muscoli circolari e longitudinali liscia a diversi stadi di sviluppo embrionale [10]. Con E11.5, lo stomaco è decisamente allargata. La muscolatura liscia dello stomaco differenzia a E13, con uno strato distinto di actina α-muscolo liscio (α-SMA) cellule -positive che appaiono e uno strato muscolare circolare che forma tutto lo stomaco [11]. Lo strato di muscolatura liscia addensa nella prospettiva regione pilorica dello sfintere ristretta a circa E14.5 [2, 9]. A E18.5, lo sfintere piloro inizia a funzionare nel prevenire il reflusso del contenuto duodenale nello stomaco [9].
Il posteriore o porzione piloro dello stomaco è la giunzione anatomica tra lo stomaco e il duodeno. Al capolinea del piloro, le distinte lembi valvolari dello sfintere piloro può essere visto [2]. In condizioni fisiologiche normali, stomaco dipende dalla sua contrazione peristaltica per macinare e spinta il cibo parzialmente digerito, e il piloro si basa sul suo ispessito sfintere piloro per controllare il flusso di cibo nel piccolo intestino. Anomalie nello sviluppo pilorica o nella funzione contrattile del piloro causano reflusso del contenuto duodenale nello stomaco e aumentano il rischio di metaplasia gastrica e cancro [12, 13]. Anomalie del piloro sono legati a difetti congeniti [14-16]. Pertanto, molta attenzione è stata data agli elementi di regolazione e percorsi di sviluppo dello stomaco, in particolare piloro e lo sviluppo dello sfintere piloro.
Dati precedenti in pulcino ha suggerito che la proteina morfogenetica dell'osso (BMP) di segnalazione regola l'espressione mesenchimale di Nkx2.5
e Sox9
, che colpisce il carattere dell'epitelio pilorica ma non ha alcun effetto sulla muscolatura liscia pilorica [5, 17], suggerendo che la segnalazione mesenchimali da fattori ignoti influenza il fenotipo epiteliale piloro. Nel topo, meccanismi molecolari di formazione pilorica sono poco comprese, con relativamente pochi dei fattori richiesti per lo sviluppo normale del piloro essendo stato identificato. Coloro che sono stati includono Sox9
[17], SIX2
[9], Bapx1
[18], Nkx2.5
[3, 17], Gremlin
[9], e GATA3
[19, 20]. Ablazione del fattore di trascrizione homeodomain, SIX2
, espresso in stomaco posteriore, sconvolge l'ispessimento dello strato di muscolatura liscia del piloro e attenua costrizione dello sfintere piloro. Inoltre, la perdita di SIX2
elimina Sox9
espressione, e riduce Nkx2.5
e Gremlin
espressione del piloro, anche se questa espressione dopo recupera [9], suggerendo che SIX2
, Sox9
, Nkx2.5
, e Gremlin
sono necessari per lo sviluppo del piloro. Inoltre, Nkx2.5
, Sox9
e GATA3
sono co-espressi nella pilorica strato muscolare longitudinale esterno (OLM) dorsali che matura tra il E14.5 e E16.5. Dopo l'eliminazione di Nkx2.5
o GATA3
, dorsale OLM pilorica è quasi assente e costrizione dello sfintere piloro viene attenuato [20].
Il homeodomain LIM (LIM-HD) fattore di trascrizione Isl1 era in origine trovato la funzione di gene dell'insulina enhancer binding protein [21]. Isl1 si compone di due domini tandem LIM e un homeodomain. Il homeodomain, con la sua struttura elica-giro-elica, si lega a sequenze regolatrici di DNA di geni bersaglio, mentre i domini LIM sono principalmente coinvolti in interazioni proteina-proteina che regolano l'attività del LIM-HD [22]. Isl1 gioca un ruolo critico nella determinazione delle cellule, la proliferazione e la differenziazione del sistema nervoso [23, 24], il cuore [25], e la ghiandola pituitaria [26]. Inoltre, l'espressione Isl1 è stato rilevato nel mesenchima gastrica [27, 28] e dell'epitelio gastrointestinale sia nei topi embrionali e adulte [29]. Tuttavia, il ruolo di Isl1 nello sviluppo stomaco è ancora da esplorare. Nel presente studio, abbiamo esaminato l'espressione Isl1 nello stomaco. Isl1 è stato altamente espresso nello stomaco posteriore nelle prime fasi di sviluppo ed è stata principalmente limitata alle cellule muscolari lisce del piloro. Per esaminare Isl1
funzione nello sviluppo dello stomaco, abbiamo utilizzato un modello di topo knockout tamoxifene-inducibile. Un modello inducibile è stata necessaria perché Isl1 - /-
mutanti muoiono a circa E10.5 a causa di difetti nella formazione del cuore. I nostri risultati mostrano che Isl1 è di vitale importanza per la formazione dello strato di OLM piloro durante l'organogenesi stomaco.
Risultati
Isl1 è espresso nello stomaco embrionali di topo
Abbiamo esaminato Isl1
livelli di mRNA a stomaco embrionali di topo da reale time PCR quantitativa (RT-qPCR) e montare tutto ibridazione in situ
(WISH). Isl1
mRNA è stato inizialmente rilevato E11.5 mediante RT-qPCR. Isl1
raggiunto il livello più alto a E13.5, seguito da un brusco calo a E14.5, e non ha avuto variazioni significative in età adulta (sui file 1: Figura S1a). Questo risultato è stato simile a una precedente relazione [29]. La localizzazione di Isl1
espressione di mRNA è stata studiata usando WISH. Abbiamo eseguito Isl1
WISH nello stomaco embrionali a E11.5, E13.5 e E14.5. A E11.5, Isl1
è stato localizzato per la metà posteriore dello stomaco (sui file 1: Figura S1b). Tuttavia, il Isl1
segnale desiderio era molto più forte e condensato in piloro da E13.5 (Figura 1A). Dato che lo sviluppo stomaco progredito, il piloro hanno continuato a esprimere
Isl1 ed espressione di Isl1
esteso al sfintere pilorico prospettico a E14.5 (sui file 1: Figura S1b). Tuttavia, il Isl1
segnale WISH indebolito considerevolmente da E13.5 a E14.5. Questi Isl1
risultati WISH hanno concordato con i risultati Isl1
RT-qPCR. Figura 1 Isl1 è espressa nello sviluppo del mouse stomaco. (A) embrionali analisi stomaco WISH ha dimostrato che Isl1
espressione è stata limitata al piloro a E13.5 (freccia). (B) La colorazione immunoistochimica per Isl1 nello stomaco. Le sezioni di embrioni sono stati disposti in rostrale a caudale sequenza a E11.5 e E13.5, e l'espressione Isl1 è stato principalmente localizzate al mesenchima dello stomaco posteriore. A E14.5 e E18.5, Isl1 è stata altamente espressa nelle cellule muscolari lisce del piloro, anche se c'erano alcune cellule Isl1-positivi nella lamina propria (punte di freccia). immagini ingrandite nelle regioni in scatola Di seguito sono riportati immagini originali. D, duodeno; Liv, il fegato; Pa, del pancreas; St, stomaco. Barre di scala di immagini originali: 100 m; barre di scala di immagini ingrandite:. 50 micron
Abbiamo poi valutato l'espressione della proteina Isl1 mediante immunoistochimica. I risultati hanno dimostrato che Isl1 è stata localizzata principalmente al mesenchima posteriore stomaco da E11.5 a E13.5, poi Isl1 è stato espresso nelle cellule muscolari lisce del piloro (Figura 1B e sui file 1: Figura S1C), ed è stato anche rilevabile nel lamina propria (Figura 1B, punte di freccia). Nel stomaco di topo adulto, solo poche cellule Isl1-positivi sono stati osservati nello strato di muscolatura liscia. (Sui file 1: Figura S1c)
cellule Isl1-positivi sono co-espressi con α-actina del muscolo liscio in stomaco embrionali di topo
per vedere se l'espressione Isl1 era legato a smussare lo sviluppo muscolare del piloro, abbiamo esaminato l'espressione del Isl1 e primi marcatori muscolari lisce α-SMA mediante immunofluorescenza. I risultati hanno dimostrato che la percentuale di cellule positive Isl1-esprimono α-SMA gradualmente aumentata (Figura 2). A E11.5, non sono stati rilevati cellule α-SMA-positivi, anche se Isl1 era altamente espresso nel mesenchima dello stomaco posteriore. A E14.5, un sottogruppo di cellule Isl1-positivi, soprattutto quelli nel muscolo circolare interna (ICM) del piloro, erano α-SMA positive. Con E16.5, pilorica OLM ha già subito una differenziazione [20]. A E18.5, la maggioranza delle cellule Isl1-positivi piloro erano α-SMA positive. espressione Isl1 ostinava a matura ICM pilorica e OLM, e le cellule della lamina propria anche espresso Isl1 (sui file 1: Figura S2). Inoltre, l'espressione Isl1 è stato esaminato in campioni umani di stenosi ipertrofica del piloro mediante immunofluorescenza, ed i risultati hanno dimostrato che Isl1 è stata espressa anche in cellule umane muscolari lisce del piloro (file aggiuntivo 1: Figura S3). Pertanto, questi risultati suggeriscono che Isl1 può partecipare alla formazione dello sfintere piloro. Figura 2 Doppio immunostaining per Isl1 e α-actina del muscolo liscio in topo cellule muscolari lisce del piloro dorsale. Isl1 e α-SMA co-espressione nelle cellule muscolari lisce a E11.5, E14.5 e E18.5. linee tratteggiate gialle segnano la membrana epiteliale seminterrato, bianche spesse linee tratteggiate indicano ICM e OLM confine, e le linee tratteggiate bianche indicano OLM e di confine del pancreas. colorazione rosso è Isl1, colorazione verde è alfa-SMA, e DAPI di contrasto nucleare (DNA) è blu. α-SMA, α-actina del muscolo liscio; ICM, muscolo circolare interna; OLM, muscolo longitudinale esterno; Pa, del pancreas; St, stomaco. Barre di scala:. 50 micron
espressione Isl1 è effettivamente ablated in Isl1
MCM /F
topi knockout -inducible
Per studiare gli effetti di Isl1
ablazione sullo sviluppo stomaco, abbiamo utilizzato Isl1
MCM /F
-inducible Cre (Isl1
MCM /Del
) topi (figura 3A) e Isl1
F /+ m
ghiaccio erano utilizzati come controlli [30, 31]. Gli embrioni sono stati genotipizzati mediante PCR a E18.5 (sui file 1: figura S4) ed intatto o mutante Isl1
mRNA si è caratterizzato per semi-PCR quantitativa (Figura 3B). Figura 3 Efficienza di Isl1 ablazione a stomaci di Isl1 MCM /Del stomaco di topo mutante a E18.5. (A) Tamoxifen-inducibile Cre ricombinasi asportato sequenze di DNA affiancato da due siti loxP
. (B) Isl1
livelli di RNA sono state asportate in Isl1
MCM /Del
stomaci mutanti visto da PCR semi-quantitativa. Isl1
F /+ m
ghiaccio ha mostrato un paio di prodotti di base 592 mentre Isl1
MCM /Del
topi ha generato un paio di prodotti 303 di base. (C) Isl1 era significativamente down-regolato ai livelli di proteine ​​nel Isl1
MCM /Del
stomaci mutanti come mostrato da Western Blot. Espressione di embrioni a E11.5 stato utilizzato come controllo positivo. (D) l'espressione della proteina Isl1 in Isl1
F /+
a ND Isl1
MCM /Del
piloro embrionale. espressione Isl1 era significativamente ridotta in Isl1
MCM /Del
stomaci embrionali, come si è visto con immunofluorescenza. Immagini in Isl1
F /+
a ND Isl1
MCM /Del
sono stati elaborati sulla stessa diapositiva e fotografato con la stessa esposizione. immagini ingrandite delle aree in scatola sono mostrati sul lato destro delle immagini unite. Giallo frecce indicano le cellule Isl1-positivi rappresentativi, e frecce bianche indicano le cellule Isl1-negativo rappresentativi. linee tratteggiate gialle segnano la membrana basale epiteliale. Barre di scala:. analizza 50 micron
Western Blot hanno mostrato che i livelli di proteina Isl1 in embrionale stomaco di Isl1
MCM /Del
topi erano significativamente più bassi rispetto a quelli Isl1
F /+ m
ghiaccio (Figura 3C). risultati immunofluorescenza dimostrato significativamente ridotti Isl1 colorazione in piloro di Isl1
MCM /Del
topi rispetto ai controlli (Figura 3D). Questi dati dimostrano che Isl1
espressione era effettivamente down-regolato in Isl1
MCM /Del
stomaci mutanti.
Anomalie pilorica in Isl1
MCM /F
mutanti
Per studiare gli effetti di Isl1
ablazione sullo sviluppo stomaco, abbiamo confrontato le differenze morfologiche e istologiche tra Isl1
MCM /del
e Isl1
F /+ s
tomachs a E18.5. A E18.5, liquido giallo è stato osservato in Isl1
MCM /Del
stomaco, ma non in stomaci di Isl1
F /+ l
ittermates (Figura 4A, asterisco) . L'esame istologico ha dimostrato che il livello della muscolatura liscia dorsale pilorica era molto più sottile del piloro di Isl1
MCM /Del
topi rispetto ai controlli (Figura 4B). Abbiamo esaminato l'espressione e la distribuzione di α-SMA sia Isl1
MCM /Del
mutanti e Isl1
F /+ p
ylorus. i risultati hanno dimostrato che la carenza di immunofluorescenza Isl1 ha portato alla quasi totale assenza dello strato OLM pilorica a E18.5, e le cellule restanti sono stati liberamente organizzati (Figura 5A, asterischi). Inoltre, la costrizione dello sfintere pilorico è stato attenuato nel Isl1
MCM /Del
stomaco mutanti se confrontato con costrizione Isl1
F /+ s
tomachs (Figura 5B) . Inoltre, abbiamo analizzato espressione della proteina specifica muscolo liscio Calponin-1 a E18.5 e immunofluorescenza risultati hanno dimostrato che la perdita di Isl1 portato anche in quasi assenza di Calponin-1 nello strato OLM pilorica dorsale, simile ai risultati con α- SMA (file di informazioni 1: Figura S5). Sox9 è espresso sia in epitelio e mesenchima [9] ed è necessario per lo sviluppo di OLM e formazione di costrizione dello sfintere piloro [20]. I nostri risultati hanno mostrato che immunofluorescenza Sox9 è rimasto a livelli normali dell'epitelio stomaco di Isl1
MCM /Del
topi a E14.5 e E18.5 (figura 6, punte di freccia), ma l'area della muscolatura liscia pilorica esprimendo Sox9 era significativamente ridotta in Isl1
MCM /Del
mutanti a E14.5 (Figura 6A, asterischi) e assente al E18.5 (Figura 6B, asterischi). Così, Isl1
era necessario per Sox9
espressione in cellule OLM pilorica dorsali. Questi risultati indicano che Isl1 è fondamentale per regolare lo sviluppo della muscolatura liscia del mouse piloro. Figura 4 morfologica e cambiamenti istologici per lo sviluppo di stomaco di Isl1 MCM /Del mutanti. (A) Gross e prove microscopico per difetti di stomaco in Isl1
MCM /Del
topi. Tutta montare viste a E18.5 in Isl1
F /+
a ND Isl1
MCM /Del
stomaci mouse. Isl1
MCM /Del
stomaci mutanti mancava uno sfintere piloro funzionale (punta di freccia), consentendo in tal modo il reflusso di liquidi, come osservato in embrioni mutanti. liquido giallo è indicata con asterisco. (B) ematossilina e eosina di Isl1
F /+
a ND Isl1
MCM /Del
piloro del mouse E18.5. La dorsale del piloro muscolo liscio (nero regione in scatola) era prominente in Isl1
F /+ e
mbryos, ma era molto più sottile in Isl1
MCM /Del
embrioni. Il resto del piloro era istologicamente normale. linee tratteggiate verdi segnano la membrana basale epiteliale. immagini ingrandite nelle regioni in scatola Di seguito sono riportati foto originali. Barre di scala di foto originali: 200 m; barre di scala di immagini ingrandite: 50 micron. H &. E, ematossilina e eosina
Figura 5 Perdita di Isl1 sconvolge formazione della dorsale pilorica muscolo longitudinale esterno. (A) immunofluorescenza di Isl1 e α-SMA in Isl1
F /+
a ND Isl1
MCM /Del
piloro embrionale a E18.5. Perdita di Isl1 provocato perdita di quasi completa delle cellule alfa-SMA-positivi nel OLM pilorica dorsale (asterischi). linee tratteggiate gialle segnano la membrana epiteliale seminterrato e linee tratteggiate bianche indicano ICM e OLM confine. colorazione rosso è Isl1, colorazione verde è alfa-SMA, e DAPI di contrasto nucleare (DNA) è blu. Barre di scala: 50 micron. (B) α-SMA immunofluorescenza di Isl1
F /+
a ND Isl1
MCM /Del
piloro embrionale a E18.5. Rispetto Isl1
F /+ e
mbryos, lo sfintere costrizione pilorica è stato più ampio in Isl1
MCM /Del
animali. misure sfintere costrizione sono mostrati. Le barre gialle delimitano il piloro e evidenziano la marcata differenza di larghezza tra Isl1
F /+
a nd Isl1
MCM /Del
campioni. I dati sono media ± SEM (n = 6
topi per gruppo), * P
< 0,05 (t di Student
-test). Barre di scala: 50 micron. α-SMA, α-actina del muscolo liscio; ICM, muscolo circolare interna; OLM, muscolo longitudinale esterno.
Figura 6 Perdita di Isl1 elimina la dorsale pilorica esterno longitudinale espressione Sox9 muscolare. (A) Doppio immunostaining per Isl1 e Sox9 nel piloro dorsali a E14.5. In assenza di Isl1, il dominio di cellule mesodermiche (asterischi) che esprime Sox9 era più piccola. (B) Doppio immunostaining per Isl1 e Sox9 nel piloro dorsali a E18.5. Inducibile Isl1 knockout eliminato efficacemente espressione Isl1, con la perdita contemporanea di espressione Sox9 nelle cellule dorsali OLM (asterischi). espressione Sox9 era normale nell'epitelio stomaco in entrambe le fasi (frecce). linee tratteggiate gialle segnano la membrana epiteliale seminterrato e bianche linee tratteggiate ICM separato e OLM. colorazione rosso è Isl1, colorazione verde è Sox9, e DAPI di contrasto nucleare (DNA) è blu. Barre di scala: 50 micron. ICM, muscolo circolare interna; OLM, muscolo longitudinale esterno.
Espressione e la distribuzione del prodotto del gene della proteina 9.5 (PGP9.5), un marker sistema nervoso enterico [32], era intatto a E18.5 in Isl1
MCM /Del
stomaci mutanti (sui file 1: Figura S6). Pancreatica e duodenale homeobox gene 1 (Pdx1) è espresso in cellule epiteliali del segmento antro-piloro e il duodeno rostrale [33]. I nostri risultati hanno dimostrato che l'espressione immunofluorescenza Pdx1 era simile in Isl1
MCM /Del
topi rispetto ai controlli a E18.5 (sui file 1: Figura S7). Inoltre, è stato istituito lo stomaco del mouse e di confine epiteliale duodenale tra E14.5 e E16.5 [34], questo periodo coincide con lo sviluppo dello strato OLM [20]. Abbiamo testato l'integrità dell'intestino confine piloro epiteliali stomaco-piccola a E18.5 esaminando espressione di un marcatore Cdx2 epiteliale specifico dell'intestino [19]. I nostri risultati di immunoistochimica hanno dimostrato che la posizione del confine pilorica epiteliale in Isl1
MCM /Del
topi era simile a quello dei controlli (file aggiuntivo 1: Figura S8). Questi risultati indicano che la perdita di Isl1 non influisce innervazione o lo sviluppo epiteliale del piloro.
Perdita di Isl1 non influenza la proliferazione o l'apoptosi delle pilorica muscolo circolare interna e cellule muscolari longitudinali esterne
per vedere se l'espressione Isl1 era correlata alla proliferazione delle cellule del piloro, abbiamo esaminato co-localizzazione di Isl1 e bromodeossiuridina proliferativa marcatore (BrdU) utilizzando immunofluorescenza in Isl1
F /+ m
ghiaccio. I nostri risultati hanno mostrato che le cellule BrdU-positive sono state dense a E11.5 e sparsi in tutte le regioni ICM e OLM a E14.5 e E18.5 (sui file 1: Figura S9A). Inoltre, la proporzione di cellule proliferanti ICM e OLM non era significativamente differente tra Isl1
MCM /Del
e Isl1
F /+ m
ghiaccio a E18.5 ( file aggiuntivo. 1: Figura S9b)
Per valutare un potenziale impatto sulla apoptosi, abbiamo esaminato spaccati caspasi 3 espressione a E18.5, ed i nostri risultati hanno mostrato immunofluorescenza non c'erano caspasi 3-positivo cellule in ICM pilorica o lo strato OLM di Isl1
MCM /del
e Isl1
F /+ m
ghiaccio (sui file 1: Figura S10). Questi dati indicano che l'ablazione Isl1 non influenza la proliferazione o l'apoptosi di ICM pilorica e cellule OLM.
Perdita di risultati Isl1 nel diminuita espressione di GATA3
, Gremlin
, e Nkx2.5
Dal momento che un numero di fattori, tra cui Bapx1
[18], Barx1
[35], GATA3
[19, 36], Gremlin
[5], Nkx2.5
[2] e SIX2
[9], sono stati segnalati per essere coinvolti nella regolazione dello sviluppo del piloro, abbiamo esaminato gli effetti della perdita di Isl1 sulla espressione di questi geni a E14.5 e E18.5. risultati RT-qPCR hanno dimostrato che la perdita di Isl1
non ha influenzato l'espressione di Bapx1
o Barx1
sia a E14.5 o E18.5 (Figura 7A, B). A E18.5, α-SMA
e SIX2
livelli di mRNA erano significativamente più bassi nel Isl1
MCM /Del
topi rispetto ai controlli (Figura 7B). Sia a E14.5 e E18.5, Nkx2.5
, GATA3
, e Gremlin
livelli di mRNA nello stomaco di Isl1
MCM /Del
topi erano inferiori controlli (Figura 7A, B). GATA3
livelli di mRNA erano circa il 70% è diminuita in entrambe le fasi esaminate (Figura 7A, B). Sulla base di questi risultati, abbiamo indagato Isl1
, GATA3
, Gremlin
, e Nkx2.5
espressione in Isl1
MCM /F
mutante e Isl1
F /+ s
tomachs utilizzando WISH. I risultati hanno dimostrato che l'espressione di ciascuno di questi geni è principalmente confinata alla regione pilorica, come previsto; GATA3
espressione è stata più ridotta in stomaci mutanti; e Gremlin
e Nkx2.5
aveva solo lievi modifiche (Figura 7E, F).
Isl1 e GATA3
espressione sono stati i più fortemente influenzato (Figura 7C, D). Questi risultati sono coerenti con i dati RT-qPCR e suggeriscono che Isl1 regola l'espressione di GATA3
, Gremlin
, e Nkx2.5
. Figura 7 l'espressione del gene aberrante in hindstomach in Isl1 MCM /Del mutanti. (A) RT-qPCR dei livelli di mRNA di fattori di trascrizione hindstomach arricchito a E14.5 indica una significativa riduzione di α-SMA
, SIX2 Nkx2.5
, GATA3
, e Gremlin
mRNA in Isl1
MCM /Del
stomaci mutanti (n
= 4). Tutti i risultati sono stati normalizzati a livelli di GAPDH
mRNA. (B) Analisi RT-qPCR dei livelli di mRNA di fattori di trascrizione hindstomach arricchito a E18.5 indica una significativa riduzione dei Nkx2.5
, GATA3
, e Gremlin
mRNA nel Isl1
MCM /Del
stomaci mutanti (n
= 4). Tutti i risultati sono stati normalizzati a livelli di GAPDH
mRNA. I dati sono media ± SEM (n = 6
topi per gruppo). * P
< 0,05 vs Isl1
F /+
; ** P
< 0,01 contro Isl1
F /+
(t di Student
-test). (CF) analisi WISH mRNA ha confermato la perdita di Isl1
, GATA3
, Gremlin
, e l'espressione di mRNA Nkx2.5
a E14.5 nel Isl1
MCM /Del
mutante stomaci. Isl1
e GATA3
mRNA sono stati gravemente down-regolato in Isl1
MCM /Del
topi, mentre Gremlin
e Nkx2.5
espressione sono stati leggermente ridotti. Le frecce indicano lo sfintere piloro.
Isl1 obiettivi GATA3
e attiva la sua trascrizione
GATA3
è selettivamente espresso in piloro del mouse embrione in via di sviluppo [19, 20]. L'espressione di entrambi Isl1
e GATA3
mRNA è stata osservata nel piloro a E14.5, ma se GATA3 e Isl1 sono espressi nelle stesse cellule non è stata esplorata. Pertanto, abbiamo esaminato l'espressione di Isl1 e GATA3 da analisi di immunofluorescenza. I risultati hanno dimostrato che Isl1 e GATA3 proteine ​​sono stati co-espressi all'interno delle stesse cellule del piloro a E14.5 e E18.5 in Isl1
F /+ c
ontrollo stomaco (Figura 8). Inoltre, l'area che esprime GATA3 era significativamente più piccolo in Isl1
MCM /Del
mutante strato della muscolatura liscia del piloro a E14.5 (Figura 8A) e si è perso in E18.5 nello strato OLM pilorica (Figura 8B). Così, Isl1
era necessario per GATA3
espressione nello strato OLM pilorica dorsale. Per studiare se Isl1 regolano sviluppo del piloro regolando direttamente GATA3
, abbiamo effettuato l'analisi bioinformatica del locus genomico GATA3. Il mouse GATA3
gene contiene diversi elementi di risposta Isl1 putativi (ATTA /Taat) a -2,832 paia di basi (bp) a 1002 bp dai siti di trascrizione iniziazione [37]. Abbiamo identificato 10 aree che contenevano un Isl1 putativo sito di legame (Figura 9A), e 10 paia di primer corrispondenti sono stati progettati per amplificare queste regioni seguenti immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) studi che utilizzano anticorpi per Isl1. DNA genomico immunoprecipitato è stato ottenuto dalle regioni pilorica di embrioni di topo a E14.5. Dei 10 putativi aree vincolanti Isl1, due regioni distinte, nel -2558 bp a -2303 bp (regione P1) e -1081 bp a -855 bp (regione P6), sono stati occupati da proteine ​​Isl1. Questo risultato è stato confermato da semi-quantitativa PCR (Figura 9B) e il metodo di arricchimento piega (Figura 9C). Figura 8 Perdita di Isl1 elimina la pilorica muscolo longitudinale esterno GATA3 espressione dorsale. (A) Doppio immunostaining per Isl1 e GATA3 nel piloro dorsali a E14.5. La regione di cellule mesodermiche (asterischi) che esprime GATA3 era più piccolo nel Isl1
MCM /Del
piloro di Isl1 hotels, FL +
. (B) Doppio immunostaining per Isl1 e GATA3 nel piloro dorsali a E18.5. Inducibile Isl1 knockout eliminato efficacemente espressione Isl1, con la perdita contemporanea di espressione GATA3 nelle cellule dorsali OLM (asterischi). linee tratteggiate gialle segnano la membrana epiteliale seminterrato e linee tratteggiate bianche indicano il confine ICM e OLM. freccia bianca indica macchia non specifico. colorazione rosso è Isl1, colorazione verde è GATA3, e DAPI di contrasto nucleare (DNA) è blu. Barre di scala: 50 micron. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

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