LIM homeodomain transkripcijos faktorius Isl1 nukreipia normalų prievarčio plėtrą nukreipiant Gata3

LIM homeodomain transkripcijos faktorius Isl1 nukreipia normalų prievarčio plėtrą nukreipiant Gata3
Anotacija
fone
anomalijos prievarčio plėtros arba kontrakcijos funkcija fazė prievartyje priežastis refliukso dvylikapirštės žarnos turinį į skrandį ir padidinti skrandžio metaplazijos ir vėžio riziką. Anomalija prievarčio regione taip pat yra susijęs su įgimtų defektų, tokių kaip gana bendros naujagimių hipertrofinė prievarčio stenozė ir pradinio duodenogastric refliukso. Todėl, suprasti prievarčio plėtra yra labai kliniškai reikšminga. Čia mes tyrė LIM homeodomain transkripcijos veiksnio Isl1 vaidmenį prievarčio plėtrai.
Rezultatai
nagrinėjimo Isl1 išraiška kuriant pelės skrandį imunohistocheminiu, visas kalnas in situ hibridizacijos
ir realaus laiko kiekybine PGR parodė kad Isl1 yra labai išreikštas kurti pelės skrandį, daugiausia į lygiųjų raumenų sluoksnis fazė prievartyje. Isl1 sąvoka taip pat buvo nagrinėjama imr.rnofluorescencija žmonijos hipertrofinė prievarčio stenozė, kur buvo nustatyta, kad lygiųjų raumenų ląstelių dauguma išreikšti Isl1. Isl1
funkcija embriono skrandžio vystymąsi buvo tiriamas panaudojant tamoksifenas indukuojamas Isl1
nokautas pelės modelį. Isl1
trūkumas lėmė beveik visiškai nesant prievarčio išorinės išilginės raumenų sluoksniu embriono dieną 18,5, kuri yra suderinama su Gata3
null pelės fenotipo. Chromatino imunoprecipitacijos, liuciferazės tyrimai ir elektroforezės mobilumo perjungimo tyrimai parodė, kad Isl1 užtikrina normalų prievarčio plėtrą tiesiogiai skirta Gata3
.
Išvadas
Šis tyrimas rodo, kad Isl1-Gata3
transkripcija reguliavimo ašis yra būtini normalus prievarčio plėtra. Šie duomenys yra labai kliniškai svarbūs ir gali padėti geriau suprasti būdus, leidžiančius prievarčio liga.
Raktiniai žodžiai
α-lygiųjų raumenų aktino Gata3 Isl1 fazė prievartyje Background
stuburinis žarnyne yra puikus struktūra, kuri suvalgo ir virškina maistą, sugeria maistingąsias medžiagas ir šalina atliekas. Žarnyne kilęs iš paprastos kanalėlių struktūrą, sudarytą iš trijų gemalinių sluoksnių įskaitant pagrindinės Endoderma, apsupamąjį visceralinės Mezoderma, ir ectoderm [1-3]. Pelių embrionų, žarnyno tampa raštuotas palei priekinės-užpakalinės, nugaros-pilvo, kairės-dešinės ir radialinių kryptis. Žarnyne vamzdis susideda iš Priekinis žarna, Vidurinė žarna ir hindgut palei jo priekinės-užpakalinės ašies [4, 5]. Kaip vystymasis progresuoja, The Priekinis žarna atsiranda stemplės, skrandžio, kepenų, plaučių, kasos ir. Vidurinė žarna sudaro plonosiose žarnose ir hindgut vystosi į storosios žarnos [1, 5-8].
Skrandis yra kilęs iš užpakalinės Priekinis žarna. Skrandis morfologiškai skiriasi nuo Priekinis žarna vamzdžio netoliese embriono dieną 9,5 (E9.5) ir pasirengimo skrandžio mezenchima plėtra leidžia skrandžio domenas būtų matoma pradžia ne E10.5 [9]. Mezenchiminių ląstelių skrandžio atskirti į keturias atskiras koncentrinių sluoksnių, įskaitant plonų sluoksnių Propria, muscularis gleivinės ir Žiedinės ir išilginės lygiųjų raumenų etapuose embriono vystymuisi [10]. Iki E11.5, skrandis yra ryškiai išsiplėtusios. Skrandis lygiųjų raumenų išskiria ne E13, su atskira sluoksniu alfa-lygiųjų raumenų aktino (α-SMA) -positive ląstelių šmėkšteli ir sukamaisiais raumenų sluoksnio formavimo visoje skrandžio [11]. Lygiųjų raumenų sluoksnis sutirštės į suvaržytas būsimasis prievarčio rauko regione apie E14.5 [2, 9]. Tuo E18.5, The prievarčio sfinkterio pradeda veikti užkertant kelią dvylikapirštės žarnos turinio refliukso į skrandžio [9].
Užpakalinės arba fazė prievartyje dalį skrandžio yra anatominis sandūra tarp skrandžio ir dvylikapirštės žarnos. Tuo fazė prievartyje galo, kad skirtingi širdies vožtuvų juostos iš prievarčio sfinkterio gali būti vertinamas [2]. Esant normalioms fiziologinėms sąlygoms, skrandžio priklauso nuo jos peristaltiniu susitraukimo šlifuoti ir trauka dalinai suvirškintas maistas ir fazė prievartyje remiasi savo pastorintos prievarčio sfinkterio kontroliuoti maisto srautą į plonąją žarną. Anomalijos prievarčio vystymosi arba in the susitraukimo funkcija fazė prievartyje sukelti refliukso dvylikapirštės žarnos turinį į skrandį ir padidinti skrandžio metaplazijos ir vėžio [12, 13] riziką. Anomalijas fazė prievartyje yra susiję su įgimtais defektais [14-16]. Todėl daug dėmesio buvo skiriama reglamentuojantys elementai ir keliai skrandžio vystymąsi, ypač fazė prievartyje ir prievarčio rauko plėtrai.
Ankstesniais duomenimis viščiuko rodo, kad kaulų morfogenezės baltymas (BMP) signalizacijos reguliuoja mezenchiminių išraišką Nkx2.5
ir Sox9
, kuris paveikia prievarčio epitelio charakterį, bet neturi įtakos prievarčio lygiųjų raumenų [5, 17] poveikį, o tai rodo, kad mezenchiminių signalizacijos nežinomų veiksnių įtakos prievarčio epitelio fenotipą. Be pele, molekuliniai mechanizmai prievarčio formavimas yra mažai suprantamas, palyginti nedaugelis iš veiksnių reikalingų normaliai prievarčio vystymasis to, nenustatyta. Tie, kurie buvo įtraukti Sox9
[17], Six2
[9], Bapx1
[18], Nkx2.5
[3, 17], Gremlinas
[9], ir Gata3
[19, 20]. Abliacija iš homeodomain transkripcijos faktorius, Six2
, išreikštas užpakalinės pilvo, sutrikdo sustorėja prievarčio lygiųjų raumenų sluoksnis ir sumažina spazmas fazė prievartyje sfinkterio. Be to, praradimas Six2
pašalina Sox9
išraišką, ir sumažina Nkx2.5 parsisiųsti ir Gremlin
išraišką fazė prievartyje, nors ši išraiška vėliau susitraukia [9], o tai rodo, kad Six2
, Sox9
, Nkx2.5
ir Gremlinas
reikalingi prievarčio plėtrai. Be to, Nkx2.5
, Sox9
ir Gata3
yra bendrai išreikšta nugaros prievarčio išorinis išilginis raumuo (OLM) sluoksnis, kuris bręsta tarp E14.5 ir E16.5. Po ištrynimo Nkx2.5
arba Gata3
Nugaros prievarčio OLM beveik nėra ir susiaurėjimas iš fazė prievartyje sfinkterio yra susilpnintas [20].
LIM homeodomain (LIM-HD) transkripcijos faktorius Isl1 iš pradžių buvo nustatyta, kad veiktų kaip insulino genas stipriklis surišantis baltymas [21]. Isl1 susideda iš dviejų tandemas Lim sričių ir homeodomain. Homeodomain, su savo spiralės posūkis spiralės struktūros, jungiasi prie reguliavimo DNR sekų tikslinių genų, o LIM domenai daugiausia dalyvauja baltymo-baltymo sąveiką, kad reguliuoti Lim-HD [22] veiklą. Isl1 vaidina svarbius vaidmenis ląstelių nustatymo, platinimu, ir diferenciacijos nervų sistema [23, 24], širdį [25] ir hipofizės [26]. Be to, Isl1 išraiška buvo aptikta skrandžio mezenchima [27, 28] ir virškinimo epitelio tiek embriono ir suaugusių pelių [29]. Tačiau Isl1 vaidmuo skrandžio vystymąsi dar reikia ištirti. Šiame tyrime mes išnagrinėjo Isl1 išraišką į skrandį. Isl1 buvo labai išreikštas užpakalinės skrandžio ankstyvuosiuose vystymosi etapuose ir iš esmės buvo tik lygiųjų raumenų ląstelių fazė prievartyje. Išnagrinėti Isl1
funkciją skrandžio plėtrą, mes panaudojo tamoksifenu-indukuojamąją nokautas pelės modelį. Indukuojamą modelis buvo reikalingas, nes Isl1 - /-
mutantai mirti maždaug E10.5 dėl defektų, širdies formavimosi. Mūsų rezultatai rodo, kad Isl1 yra gyvybiškai svarbus formuojant prievarčio Olm sluoksnio metu skrandžio organogenezės.
Rezultatai
Isl1 išreiškiamas embriono pelės skrandžio
Mes išnagrinėjome Isl1
iRNR kiekį embriono pelės skrandyje Real- laiko kiekybine PGR (RT-qPCR) ir visas kalnas in situ hibridizacijos
(noras). Isl1
iRNR pradžių buvo aptikta E11.5 RT-qPCR. Isl1
pasiekė aukščiausią lygį E13.5, po staigaus nuosmukio metu E14.5, ir neturėjo jokių reikšmingų pokyčių ir suaugus (Papildoma failų 1: S1a pav.) Šis rezultatas buvo panašus į ankstesnės ataskaitos [29]. Iš Isl1
iRNR išraiškos lokalizacija buvo tiriama naudojant nori. Mes atlikome Isl1
pageidauja embriono skrandį E11.5, E13.5, E14.5 ir. Tuo E11.5, Isl1
buvo lokalizuotas prie užpakalinės pusės skrandžio (papildomas failą 1: S1b pav). Tačiau Isl1
WISH signalas buvo daug stipresnis ir kondensuotas fazė prievartyje iki E13.5 (1a pav.) Kaip skrandis plėtra progresavo, fazė prievartyje toliau išreikšti Isl1 parsisiųsti ir išraišką Isl1
pratęstas būsimam prievarčio sfinkterio ne E14.5 (Papildoma failų 1: S1b pav.) Tačiau Isl1
WISH signalas žymiai susilpnėjo nuo E13.5 į E14.5. Šie Isl1
norą rezultatai sutapo su Isl1
RT-qPCR rezultatus. 1 pav Isl1 išreiškiamas kuriant pelės skrandį. (A), embriono skrandžio WISH analizė parodė, kad Isl1
išraiška buvo apribota fazė prievartyje ne E13.5 (rodyklės kryptimi). (B), imunohistocheminis dažymas Isl1 į skrandį. Profiliai iš embrionų buvo išdėstyti Rostral į uodegos seka ne E11.5 ir E13.5 ir Isl1 išraiška buvo daugiausia lokalizuojasi prie užpakalinės pilvo mezenchima. Tuo E14.5 ir E18.5, Isl1 buvo labai išreikštas lygiųjų raumenų ląstelių fazė prievartyje, nors būta Isl1 teigiamas ląsteles plonų sluoksnių Propria (rodykles). Išsiplėtusios vaizdus supakuota regionų parodyta žemiau originalių vaizdų. D dvylikapirštės žarnos; Liv, kepenų; Pa, kasos; St, skrandį. Mastelis barai originalių paveikslėlių: 100 mkm; masto barų išsiplėtusias vaizdų. 50 mkm
Mes tada įvertino Isl1 baltymo ekspresija imunohistocheminiu. Rezultatai parodė, kad Isl1 daugiausia buvo lokalizuotas prie užpakalinės pilvo mezenchima iš E11.5 į E13.5, tada Isl1 buvo išreikštas lygiųjų raumenų ląstelių fazė prievartyje (1b pav ir papildomų failų 1: S1c paveikslas), o taip pat buvo aptinkamas lamina Propria (pav 1B, antgaliai strėlės). Suaugusiųjų pelės skrandžio, tik keli Isl1 teigiami ląstelės buvo pastebėtas lygiųjų raumenų sluoksnis. (Papildoma failą 1: S1c paveikslas)
Isl1 teigiamas ląstelės bendrai išreikšti alfa-lygiųjų raumenų aktino embriono pelės skrandžio
Norėdami pamatyti, ar Isl1 išraiška buvo susijęs su lygiųjų raumenų vystymąsi fazė prievartyje, mes išnagrinėjo Isl1 išraišką ir anksčiausiai lygiųjų raumenų žymeklis α-SMA, naudojant iMUNOFLUORESCENCIJOS. Rezultatai parodė, kad Isl1 teigiamas ląsteles išreiškė α-SMA dalis palaipsniui didėjo (2 pav.) Tuo E11.5, nėra α-SMA-teigiamų ląstelių buvo aptikta, nors Isl1 buvo labai išreikštas užpakalinės pilvo mezenchima. Tuo E14.5, iš Isl1 teigiamų ląstelių poaibis, daugiausia tiems, vidiniame apskrito raumenį (TCM) iš fazė prievartyje, buvo α-SMA teigiamas. Iki E16.5, prievarčio OLM jau atlikta diferenciaciją [20]. Tuo E18.5, kad Isl1 teigiamų ląstelių fazė prievartyje dauguma buvo α-SMA teigiamas. Isl1 išraiška išliko brandaus prievarčio IKM ir Olm ir Lamina propria ląstelės taip pat išreiškė Isl1 (Papildoma failą 1: S2 pav.) Be to, Isl1 išraiška buvo nagrinėjamas žmogaus pavyzdžių hipertrofinė prievarčio stenozė imr.rnofluorescencija ir rezultatai parodė, kad Isl1 taip pat buvo išreikštas žmogaus lygiųjų raumenų ląstelių fazė prievartyje (Papildoma failų 1: S3 pav). Todėl, šie rezultatai rodo, kad Isl1 gali dalyvauti prievarčio sfinkterio formavimas. 2 pav Dvivietis imunodažymu už Isl1 ir α-lygiųjų raumenų aktino pelių lygiųjų raumenų ląstelių nugaros fazė prievartyje. Isl1 ir α-SMA bendrai išraiška lygiųjų raumenų ląsteles E11.5, E14.5, E18.5 ir. Įmonių punktyrinės linijos žymi epitelio pamatinės membranos, baltos storio punktyrinės linijos rodo ICM ir Olm ribą, o baltas punktyrinės linijos rodo Olm ir kasos ribos. Raudona spalva yra Isl1, žalia dažymo alfa-SMA ir DAPI atominės counterstaining (DNR) yra mėlyna. α-SMA, α-lygiųjų raumenų aktino; TCM, vidinis žiedinis raumuo; OLM, išorinis išilginis raumuo; Pa, kasos; St, skrandį. Mastelis barai. 50 mkm
Isl1 išraiška efektyviai išgarina į Isl1
MCM /F
-inducible pelç
Ištirti poveikį Isl1
abliacija dėl skrandžio plėtrą, mes naudojamas Isl1
MCM /F
-inducible Cre (Isl1
MCM /Trinti
) pelės (3A pav) ir Isl1
F /+ m
ledo buvo naudojamas kaip kontrolės [30, 31]. Embrionai buvo genotipą E18.5 (Papildoma failų 1: S4 paveikslas) PGR ir nesugadintos arba mutantas Isl1
iRNR išsiskyrė pusiau kiekybinis PCR (3b pav.) 3 pav efektyvumas Isl1 abliacijos į skrandžius Isl1 MCM /del mutantų pelės skrandžiai ne E18.5. (A) kai tamoksifenas indukuojamas Cre rekombinazės pašalintų DNR sekos supa du loxP
vietų. (B) Isl1
RNR koncentracija buvo išgarina į Isl1
MCM /Del
mutantas skrandžius kaip matyti pusiau kiekybiniam PGR. Isl1
F /+ M
ledo parodė 592 bazių porų produktą o Isl1
MCM /Del
pelėms sukėlė 303 bazių porų produktą. (C) Isl1 buvo gerokai žemyn reguliuojama baltymų lygį Isl1
MCM /Del
mutantas skrandžiai, kaip parodė Vakarų dėmė. Išraiška embrionams E11.5 buvo naudojamas kaip teigiama kontrole. (D), Isl1 baltymų ekspresija Isl1 pervežimas F /+ per
asis Isl1
MCM /Del
embriono fazė prievartyje. Isl1 išraiška buvo žymiai sumažintas Isl1
MCM /Del
embriono skrandžiai, kaip matyti imr.rnofluorescencija. Vaizdai Isl1
f /+ A
oji Isl1
MCM /Del
buvo apdoroti tą pačią skaidrę ir nufotografuoti tuo pačiu poveikiu. Išsiplėtusios atvaizdai supakuota sričių rodomi dešinėje pusėje sujungtų nuotraukų. Įmonių antgaliai strėlės rodo atstovybes Isl1 teigiamas ląsteles, ir baltos antgaliai strėlės rodo atstovybes Isl1 neigiamas ląsteles. Įmonių punktyrinės linijos žymi epitelio pamatinės membranos. Mastelis barai. 50 mkm
Vakarų dėmė analizė parodė, kad Isl1 baltymų kiekiai embriono skrandžio ir Isl1
MCM /Del
pelėms buvo žymiai mažesnis nei Isl1
F /+ m
ledo (3C pav.) IMUNOFLUORESCENCIJOS rezultatai parodė, žymiai sumažino Isl1 dažymo ir fazė prievartyje iš Isl1
MCM /Del
pelėms, palyginti su kontrole (3D pav.) Šie duomenys rodo, kad Isl1
išraiška buvo efektyviai žemyn reguliuojama Isl1
. MCM /Trinti
mutantas skrandžiai
prievarčio anomalijos Isl1
MCM /F
mutantų
Norėdami ištirti poveikį Isl1
abliacija dėl skrandžio plėtrą, mes palyginti morfologines ir histologinius skirtumus Isl1
MCM /Trinti parsisiųsti ir Isl1
F /+ s
tomachs ne E18.5. Tuo E18.5, geltona skystis buvo pastebėtas Isl1
MCM /Del
skrandžiai, bet ne skrandžius Isl1
F /+ L
ittermates (4A pav žvaigždutė) , Histologinis ištyrimas parodė, kad nugaros prievarčio lygiųjų raumenų sluoksnis daug plonesnis į Isl1 fazė prievartyje
MCM /Del
pelės palyginti su kontroline grupe (4B pav.) Mes išnagrinėjome išraiška ir pasiskirstymas alfa-SMA tiek Isl1
MCM /Del
mutantai ir Isl1
F /+ P
ylorus. IMUNOFLUORESCENCIJOS rezultatai parodė, kad Isl1 trūkumas lėmė beveik visiškai nesant prievarčio Olm sluoksniu E18.5 ir likusios ląstelės buvo silpnai organizuotas (5a pav, žvaigždutes). Be to, susiaurėjimas iš prievarčio sfinkterio buvo susilpnintas į Isl1
MCM /Del
mutantas skrandžius, palyginti su susiaurėjimo Isl1
F /+ S
tomachs (5b pav) , Be to, mes analizuojami išraiška lygiųjų raumenų konkretaus baltymo Calponin-1 E18.5 ir imunofluorescencines rezultatai parodė, kad nuostoliai Isl1 pat lėmė beveik nėra Calponin-1 išraiškos nugaros prievarčio Olm sluoksnis, panašus į atsirasti su a- SMA (Papildoma failą 1: S5 pav.) Sox9 išreiškiamas tiek epitelio ir mezenchima [9], reikalingas plėtoti Olm ir formavimas prievarčio rauko susiaurėjimas [20]. Mūsų imunofluorescencines rezultatai parodė, kad Sox9 išliko normalių lygių skrandžio epitelio Isl1
MCM /Del
pelių E14.5 ir E18.5 (6 pav, strėlių antgalių), bet prievarčio lygiųjų raumenų plotas raišką Sox9 buvo žymiai sumažintas Isl1
MCM /del
mutantai at E14.5 (6a pav žvaigždutes) ir neatvykę į E18.5 (6b pav, žvaigždutes). Taigi, Isl1
reikėjo Sox9
raiškos nugarinius prievarčio Olm ląsteles. Šie rezultatai rodo, kad Isl1 yra ypač svarbus reguliuojant plėtrą pelės prievarčio lygiųjų raumenų ląsteles. 4 pav morfologines ir histologiniai pokyčiai kuriant skrandį iš Isl1 MCM /del mutantų. (A) Bruto ir mikroskopinis įrodymų skrandžio defektų Isl1
MCM /Del
pelių. Visas kalnas nuomonėmis E18.5 į Isl1 pervežimas F /+ A
ND Isl1
MCM /Del
pelės skrandžiai. Isl1
MCM /Del
mutantas skrandžiai trūko funkcinį prievarčio sfinkterio (Arrowhead), tokiu būdu leidžiant refliukso skysčio, kaip pastebėta mutantas embrionų. Geltona skystis žymimas žvaigždute. (B), hematoksilinu ir eozinas dažymo Isl1 pervežimas F /+ per
ND Isl1
MCM /Del
pelės fazė prievartyje ne E18.5. Nugaros prievarčio lygiųjų raumenų (juoda Boxed regionas) buvo ryškus Isl1 pervežimas F /+ e
mbryos, bet buvo daug plonesni Isl1
MCM /Del
embrionų. Iš fazė prievartyje likusi histologiškai buvo normalu. Žalieji punktyrinės linijos žymi epitelio pamatinės membranos. Išsiplėtusios vaizdus supakuota regionų parodyta žemiau originalių nuotraukų. Mastelis barai originalių nuotraukų: 200 mkm; masto barų išsiplėtusias vaizdai: 50 mkm. "H &. E hematoksilinu ir eozinas
5 paveikslas netekimas Isl1 sutrikdo formavimąsi nugaros prievarčio išorinės išilginės raumenų. (A), Imunofluorescentinis iš Isl1 ir alfa-SMA Isl1 pervežimas F /+ per
asis Isl1
MCM /Del
embriono fazė prievartyje ne E18.5. Praradimas Isl1 lėmė beveik visišką praradimą alfa-SMA-teigiamas ląstelių nugaros prievarčio Olm (žvaigždutes). Įmonių punktyrinės linijos žymi epitelio pamatinės membranos ir baltos punktyrinės linijos rodo ICM ir Olm ribos. Raudona spalva yra Isl1, žalia dažymo alfa-SMA ir DAPI atominės counterstaining (DNR) yra mėlyna. Mastelis barai: 50 mkm. (B), α-SMA imunofluorescencinio iš Isl1 pervežimas F /+ per
asis Isl1
MCM /Del
embriono fazė prievartyje ne E18.5. Palyginti su Isl1
F /+ E
mbryos, The prievarčio sfinkterio spazmas buvo platesnis Isl1
MCM /Del
gyvūnams. Sfinkterio spazmas matavimai parodė. Įmonių barai atskiria fazė prievartyje ir pabrėžti gerokai skiriasi plotis tarp Isl1
F /+ A
asis Isl1
MCM /Del
pavyzdžius. Duomenys vidurkis ± SEM (N
= 6 pelių kiekvienai grupei), * p
< 0,05 (Stjudento t
-test). Mastelis barai: 50 mkm. α-SMA, α-lygiųjų raumenų aktino; TCM, vidinis žiedinis raumuo; OLM, išorinis išilginis raumuo.
Pav 6 praradimas Isl1 pašalina nugaros prievarčio išorinį išilginį raumenų Sox9 išraiška. (A), dvivietis imunodažymu už Isl1 ir Sox9 į nugaros fazė prievartyje ne E14.5. Atsižvelgiant į Isl1 nėra, mesodermal ląstelių domenas (žvaigždutes) išreikšti Sox9 buvo mažesnis. (B) Dvivietis imunodažymu už Isl1 ir Sox9 į nugaros fazė prievartyje ne E18.5. Indukuojamąją Isl1 nokautas efektyviai pašalinamas Isl1 išraišką, jei kartu su nuostolių Sox9 raiškos nugaros Olm ląstelių (žvaigždutes). Sox9 išraiška buvo normalus skrandžio epitelio abiejuose etapuose (rodykles). Įmonių punktyrinės linijos žymi epitelio pamatinės membranos ir baltos punktyrinės linijos atskiras IKM ir Olm. Raudona spalva yra Isl1, žalia spalva yra Sox9 ir DAPI atominės counterstaining (DNR) yra mėlyna. Mastelis barai: 50 mkm. TCM, vidinis žiedinis raumuo; Olm, išorinis išilginis raumenų.
Išraiška ir pasiskirstymas baltymų genų produktas 9,5 (PGP9.5), enteriniu nervų sistemos persekiotoją [32], buvo nesugadintos E18.5 į Isl1
MCM /Trinti
mutantas skrandžiai (Papildoma failą 1: S6 pav.) Kasos ir dvylikapirštės žarnos homeozinis genas genas 1 (Pdx1) išreiškiamas epitelinių ląstelių antralinių-prievarčio segmente ir Rostral dvylikapirštėje žarnoje [33]. Mūsų imunofluorescencines rezultatai parodė, kad Pdx1 išraiška buvo panaši Isl1
MCM /Del
pelėms, palyginti su kontrolės prie E18.5 (Papildoma failų 1: S7 pav.) Be to, pelės skrandžio ir dvylikapirštės žarnos epitelio riba buvo įkurta tarp E14.5 ir E16.5 [34], šiuo laikotarpiu sutampa su plėtros Olm sluoksniu [20]. Mes išbandėme skrandžio-žarnyno epitelio mažas prievarčio sienos vientisumą E18.5 nagrinėjant išraiška yra žarnyno konkrečių epitelio žymeklio Cdx2 [19]. Mūsų imunohistocheminis rezultatai parodė, kad epitelio prievarčio sienos Isl1 pozicija
MCM /Del
pelėms buvo panašus į kontrolės (Papildoma failų 1: P8 pav). Šie rezultatai rodo, kad nuostoliai Isl1 neturi įtakos inervacija ar epitelio vystymąsi fazė prievartyje.
Praradimas Isl1 neturi įtakos platinimo rizika, arba apoptozę prievarčio vidinio apskrito raumenų ir išorinių išilginių raumenų ląstelėse
Norėdami patikrinti, ar Isl1 išraiška buvo susijęs į ląstelių proliferacijos fazė prievartyje, mes išnagrinėjo bendradarbiavimą lokalizacijos Isl1 ir proliferacijos žymens bromodeoxyuridine (BrdU) naudodami iMUNOFLUORESCENCIJOS į Isl1
F /+ m
ledo. Mūsų rezultatai parodė, kad BrdU teigiamas ląstelės buvo tankus ne E11.5 ir išsibarsčiusios visoje IKM ir Olm regionuose E14.5 ir E18.5 (papildomas failą 1: S9a pav). Be to, plinta IKM ir Olm ląsteles dalis buvo reikšmingai nesiskyrė Isl1
MCM /Trinti parsisiųsti ir Isl1
F /+ M
ledas E18.5 ( Papildoma failą 1:. S9b paveikslas)
Siekiant įvertinti galimą poveikį apoptozės, mes išanalizavome suskaldyti kaspazės 3 išraiška E18.5, ir mūsų imunofluorescencines rezultatai parodė, nebuvo kaspazės 3-teigiamas ląsteles prievarčio IKM ar Olm sluoksniu iš Isl1
MCM /Trinti parsisiųsti ir Isl1
F /+ m
ledo (Papildoma failą 1: S10 pav.) Šie duomenys rodo, kad Isl1 abliacija neturi įtakos platinimo rizika, arba apoptozę prievarčio IKM ir Olm ląsteles.
Praradimas Isl1, sumažėja išraiška Gata3
, Gremlin
ir Nkx2.5
nuo daugelio veiksnių skaičių, įskaitant Bapx1
[18], Barx1
[35], Gata3
[19, 36], Gremlinas
[5], Nkx2.5
[2] ir [9], buvo pranešta Six2
dalyvauti reguliuojant prievarčio plėtrą, mes išnagrinėjome praradimo Isl1 apie išraiškos šių genų poveikį ne E14.5 ir E18.5. AT-qPCR rezultatai parodė, kad nuostolių Isl1
neturėjo įtakos išraiška Bapx1
arba Barx1
čia arba E14.5 ar E18.5 (7a pav B). Tuo E18.5, α-SMA parsisiųsti ir Six2
iRNR kiekis buvo žymiai mažesnis Isl1
MCM /Del
pelėms, palyginti su kontroline grupe (7b pav.) Tiek E14.5 ir E18.5, Nkx2.5
, Gata3
ir Gremlin
mRNR lygių iš Isl1 skrandžio
MCM /Del
pelėms buvo mažesnė nei kontrolė (pav 7A, B). Gata3
iRNR koncentracija buvo maždaug 70% sumažėjo per abu etapus tikrinto (Pav 7A, B). Remiantis šiais rezultatais, mes ištirti Isl1
, Gata3
, Gremlinas
ir Nkx2.5
išraišką Isl1 pervežimas MCM /F pervežimas mutantas ir Isl1
F /+ s
tomachs naudojant nori. Rezultatai parodė, kad išraiška kiekvienos iš šių genų buvo daugiausia tik prievarčio regione, kaip numatyta, ir Gata3
išraiška buvo daugiau sumažintas mutantas skrandžiams; ir Gremlinas parsisiųsti ir Nkx2.5
turėjo tik subtilių pokyčių (pav 7E, M). Isl1 parsisiųsti ir Gata3
išraiška buvo labiausiai paveiktas (Pav 7C, D). Šie rezultatai atitiko RT-qPCR duomenis ir rodo, kad Isl1 reguliuoja išraišką Gata3
, Gremlin
ir Nkx2.5
. 7 pav Aberrant genų ekspresija hindstomach į Isl1 MCM /del mutantų. (A), RT-qPCR analizė mRNR lygių hindstomach prisodrinto transkripcijos faktorių, E14.5 rodo žymiai sumažinti α-SMA
, Six2 Nkx2.5
, Gata3
ir Gremlin
iRNR į Isl1
MCM /del
mutantas skrandžiai (N
= 4). Visi rezultatai buvo standartizuoti lygių GAPDH
mRNR. (B), RT-qPCR analizė mRNR lygių hindstomach prisodrinto transkripcijos faktorių, E18.5 rodo žymiai sumažinti Nkx2.5
, Gata3
ir Gremlin
mRNR į Isl1 pervežimas MCM /del
mutantas skrandžiai (N
= 4). Visi rezultatai buvo standartizuoti lygių GAPDH
mRNR. Duomenys vidurkis ± SEM (n = 6
pelės kiekvienai grupei). * P
< 0,05, lyginant su Isl1 pervežimas F /+
; ** P
< 0,01, lyginant su Isl1 pervežimas F /+
(Stjudento t
-test). (SF) nori iRNR analizė patvirtino praradimą Isl1
, Gata3
, Gremlinas
ir Nkx2.5
iRNR išraiška E14.5 Į Isl1
MCM /Del
mutantas skrandžiai. Isl1 parsisiųsti ir Gata3
iRNR buvo smarkiai žemyn reguliuojama Isl1
MCM /Del
pelėmis, o Gremlinas parsisiųsti ir Nkx2.5
išraiška buvo šiek tiek sumažintas. Rodyklės rodo į prievarčio sfinkterio.
Isl1 skirta Gata3 parsisiųsti ir aktyvuoja jo transkripciją
Gata3
selektyviai išreikštą iš besivystančių pelės embriono [19, 20] fazė prievartyje. Išraiška tiek Isl1
ir Gata3
mRNR buvo pastebėtas, kai E14.5 fazė prievartyje, bet ar Gata3 ir Isl1 yra išreiškiami tais pačiais ląstelių nebuvo ištirta. Todėl mes išnagrinėjo išraišką Isl1 ir Gata3 imr.rnofluorescencija analizes. Rezultatai parodė, kad Isl1 ir Gata3 baltymai buvo bendrai išreiškė tose pačiose ląstelėse esant E14.5 fazė prievartyje ir E18.5 į Isl1
F /+ c
ontrol skrandžiai (8 pav.) Be to, plotas išreikšti Gata3 buvo žymiai mažesnis Isl1
MCM /Del
mutantas prievarčio lygiųjų raumenų sluoksnis E14.5 (8a pav) ir ji buvo prarasta E18.5 į prievarčio Olm sluoksniu (8B pav.) Taigi, Isl1
reikėjo Gata3
raiškos nugaros prievarčio Olm sluoksniu. Ištirti, ar Isl1 reguliuoja prievarčio plėtrą tiesiogiai reglamentuoti Gata3
, mes atliekame bioinformatikos analizę Gata3 genomo lokuso. Pelės Gata3
genas yra keletas tariamą Isl1 reagavimo elementai (ATTA /TAAT) ne -2,832 bazių porų (bp) iki +1,002 bp nuo transkripcijos iniciacijos svetainių [37]. Mes nustatė 10 sritis, esančias tariamą Isl1 privalomas svetainės (9a paveikslą), ir 10 porų atitinkančių pradmenų buvo siekiama sustiprinti šiuos regionus šiuos chromatino Imunoprecipitacijos (Chip) tyrimų naudojant antikūną Isl1. Immunoprecipitated genomo DNR buvo gauta iš prievarčio regionuose pelės embrionų ne E14.5. Iš 10 spėjamo Isl1 privalomas srityse, du diskretieji regionai, į -2,558 -2,303 BP BP (P1 regionas) ir -1,081 BP -855 bp (P6 regionas), užėmė Isl1 baltymų. Šis rezultatas buvo patvirtinta pusiau kiekybinė PGR (9b pav) ir kartų sodrinimo metodu (9c pav). 8 pav praradimas Isl1 pašalina nugaros prievarčio išorinis išilginis raumenų Gata3 išraiška. (A), dvivietis imunodažymu už Isl1 ir Gata3 į nugaros fazė prievartyje ne E14.5. Iš mesodermal ląstelių regionas (žvaigždutes) išreikšti Gata3 buvo mažesnis Į Isl1
MCM /Del
fazė prievartyje nei Isl1 pervežimas Fl + pervežimas. (B) Dvivietis imunodažymu už Isl1 ir Gata3 į nugaros fazė prievartyje ne E18.5. Indukuojamąją Isl1 nokautas efektyviai pašalinamas Isl1 išraišką, jei kartu su nuostolių Gata3 raiškos nugaros Olm ląstelių (žvaigždutes). Įmonių punktyrinės linijos žymi epitelio pamatinės membranos ir baltos punktyrinės linijos rodo ICM ir Olm ribos. Balta Antgaliai rodo nespecifinį dėmę. Visi autoriai skaityti ir patvirtino galutinį rankraštį.

• Retas priežastis virškinimo phytobezoars: Diospyros lotus
• Transkripcijos faktorius FOXO4 yra žemyn reguliuojama ir slopina naviko proliferaciją ir metastazes skrandžio vėžio