LIM Homeodomänen Transkriptionsfaktor ISL1 leitet normale pyloric Entwicklung von Gata3

LIM Homeodomänen Transkriptionsfaktor Targeting ISL1 leitet normale pyloric Entwicklung von Gata3
Zusammenfassung
Hintergrund
Abnormalitäten in pyloric Entwicklung oder in Kontraktionsfunktion des Pylorus Ursache Reflux von Zwölffingerdarm-Targeting Inhalt in den Magen und erhöhen das Risiko von Magen Metaplasie und Krebs. Abnormalitäten des Pylorusgegend werden auch angeborene Defekte wie die relativ häufig Neugeborenen hypertrophe Pylorusstenose verknüpft und primäre duodenogastric Reflux. Daher ist von großer Bedeutung klinischen pyloric Entwicklung zu verstehen. Hier stellen wir die Rolle des LIM Homeodomänen Transkriptionsfaktor ISL1 in pyloric Entwicklung untersucht.
Ergebnisse | Prüfung der ISL1 Ausdruck in der Entwicklung der Maus Magen durch Immunhistochemie, montieren ganze in situ
Hybridisierung und quantitative Echtzeit-PCR nachgewiesen dass ISL1 ist in der Entwicklung der Maus Magen, vor allem in der glatten Muskulatur der Pylorus stark exprimiert. ISL1 Expression wurde auch durch Immunfluoreszenz in humanen hypertrophen Pylorusstenose wo die Mehrheit der Zellen der glatten Muskulatur untersucht auszudrücken ISL1 gefunden wurden. ISL1
Funktion in der embryonalen Magen Entwicklung wurde eine Tamoxifen-induzierbare ISL1
Knockout-Mausmodell unter Verwendung untersucht. ISL1
Mangel führte zu fast vollständigen Fehlen der pyloric äußere Schicht Längsmuskel an embryonalen Tag 18,5, die mit Gata3
null Maus-Phänotyp konsistent ist. Chromatinimmunpräzipitation, Luciferase-Assays und elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assays zeigten, dass ISL1 normalen pyloric Entwicklung gewährleistet durch direkt Gata3
Targeting.
Schlussfolgerungen
Diese Studie, dass die Transkriptionsregulations Achse
ISL1-Gata3 zeigt, ist von wesentlicher Bedeutung für normale pyloric Entwicklung. Diese Ergebnisse sind sehr klinisch relevant und kann helfen, besser zu verstehen, Wege zu pyloric Krankheit führt.
Schlüsselwörter α-Glattmuskelaktin Gata3 ISL1 Pylorus Hintergrund
Der wirbel Darm ist eine bemerkenswerte Struktur, die sich nimmt und verdaut Nahrung, absorbiert Nährstoffe und entfernt Abfallprodukte. Der Darm stammt aus einer einfachen Rohrstruktur besteht aus drei Keimschichten, einschließlich einer darunter liegenden Entoderm, eine umgebende splanchnic Mesoderm und ein ectoderm [1-3]. In Maus-Embryonen, wird der Darm entlang der anterior-posterioren dorsalen-ventralen, links-rechts, und radiale Achsen strukturiert. Der Darm Rohr besteht aus dem Vorderdarm, midgut und Enddarm entlang seiner anterior-posterioren Achse [4, 5]. Die Entwicklung fortschreitet, gibt der foregut Anstieg der Speiseröhre, Magen, Leber, Lunge und Pankreas. Der Mitteldarm bildet den Dünndarm und Enddarm entwickelt in den Dickdarm [1, 5-8].
Der Magen aus dem hinteren foregut abgeleitet wird. Der Magen unterscheidet morphologisch vom foregut Rohr um embryonale Tag 9.5 (E9.5) und die Erweiterung der Pre-Magen-Mesenchym ermöglicht die Domäne des Magens bei E10,5 sichtbar Anfang sein [9]. Mesenchymzellen des Magens differenzieren sich in vier verschiedenen konzentrischen Schichten, einschließlich der Lamina propria, muscularis mucosae und Ring- und Längs glatten Muskulatur in verschiedenen Stadien der embryonalen Entwicklung [10]. Durch E11,5, der Magen deutlich vergrößert. Der Magen glatten Muskulatur unterscheidet bei E13, mit einer deutlichen Schicht aus α-Glattmuskelaktin (α-SMA) -positiven Zellen erscheinen und eine Ringmuskelschicht im gesamten Magen bilden [11]. Die glatte Muskelschicht verdickt sich in den verengten prospektiven pyloric Schließmuskel Region bei etwa E14.5 [2, 9]. Bei E18,5 beginnt die Pylorus Schließmuskel bei der Verhinderung der Rückfluss von Zwölffingerdarminhalt in den Magen zu funktionieren [9].
Der hintere oder Pylorus Teil des Magens ist die anatomische Verbindung zwischen Magen und Zwölffingerdarm. An der Endstation des Pylorus, können die unterschiedlichen valvular Klappen des Magenpförtner gesehen werden [2]. Unter normalen physiologischen Bedingungen hängt der Magen auf seine peristaltische Kontraktion zu schleifen und stieß die teilweise verdaute Nahrung, und der Pylorus verlässt sich auf seine verdickten Schließmuskel pyloric den Fluss der Nahrung in den Dünndarm zu steuern. Abnormalitäten in pyloric Entwicklung oder in der Kontraktionsfunktion des Pylorus verursachen Reflux von Duodenalinhalt in den Magen und erhöhen das Risiko von Magen-Metaplasie und Krebs [12, 13]. Abnormalitäten des Pylorus sind angeborene Defekte im Zusammenhang mit [14-16]. Aus diesem Grund hat viel Aufmerksamkeit auf die Regelelemente und Wege der Magen Entwicklung gegeben worden, vor allem Pylorus und Pylorus Schließmuskel Entwicklung.
Frühere Daten in Küken schlug vor, dass Knochen-morphogenetischen Protein (BMP) Signalisierung mesenchymalen Expression von Nkx2.5
reguliert und Sox9
, die den Charakter des pyloric Epithel beeinflusst hat aber keinen Einfluss auf pyloric glatten Muskulatur [5, 17], was darauf hindeutet, dass mesenchymale Signalisierung durch unbekannte Faktoren beeinflusst die pyloric epithelialen Phänotyp. In der Maus, sind die molekularen Mechanismen der Pylorus Bildung wenig verstanden, mit relativ wenigen der Faktoren für die normale Entwicklung erforderlich pyloric identifiziert wurde. Diejenigen, die gewesen sind enthalten Sox9
[17], Six2
[9], Bapx1
[18], Nkx2.5
[3, 17], Gremlin
[9], und Gata3
[19, 20]. Abtragung des Homeodomänen Transkriptionsfaktor, Six2
, im hinteren Magen ausgedrückt, stört Verdickung der pyloric Schicht der glatten Muskulatur und dämpft Verengung des Pylorus Schließmuskel. Darüber hinaus Verlust von Six2
Sox9
Ausdruck eliminiert und reduziert Nkx2.5
und Gremlin
Ausdruck in den Pylorus, obwohl dieser Ausdruck später erholt [9], dass Six2
was darauf hindeutet, Sox9
, Nkx2.5
und Gremlin Was sind für pyloric Entwicklung erforderlich. Darüber hinaus Nkx2.5
, Sox9
und Gata3 Was sind coexprimiert in der dorsalen pyloric äußeren Längsmuskel (OLM) Schicht, die zwischen E14.5 und E16.5 reift. Nach Streichung von Nkx2.5
oder Gata3
, die dorsale pyloric OLM fast nicht vorhanden ist und Verengung des Pylorus Schließmuskel gedämpft wird [20].
Die LIM Homeodomänen (LIM-HD) Transkriptionsfaktor ISL1 war ursprünglich funktioniert als ein Insulin-Gen-Enhancer-bindendes Protein [21] gefunden. ISL1 besteht aus zwei Tandem-LIM-Domänen und eine Homöodomäne. Die Homöodomäne, mit Helix-Turn-Helix-Struktur, bindet an regulatorische DNA-Sequenzen von Zielgenen, während die LIM-Domänen hauptsächlich in Protein-Protein-Wechselwirkungen beteiligt sind, die die Aktivität des LIM-HD [22] regulieren. ISL1 spielt eine entscheidende Rolle bei der Zellbestimmung, Proliferation und Differenzierung des Nervensystems [23, 24], Herz [25], und der Hypophyse [26]. Darüber hinaus hat ISL1 Expression wurde in Magen Mesenchym detektiert [27, 28] und gastrointestinale Epithel in sowohl embryonalen und adulten Mäusen [29]. Allerdings hat sich die Rolle der ISL1 in Magen Entwicklung noch erforscht werden. In der vorliegenden Studie untersuchten wir ISL1 Ausdruck im Magen. ISL1 wurde im hinteren Magen in frühen Stadien der Entwicklung und wurde in erster Linie begrenzt auf die glatten Muskelzellen der Pylorus stark exprimiert. ISL1
Funktion in Magen Entwicklung zu untersuchen, verwendeten wir eine Tamoxifen-induzierbaren Knockout-Mausmodell. Ein induzierbarer Modell benötigt wurde, weil ISL1 - /-
Mutanten bei die etwa E10,5 zu Defekten in Herzbildung zurückzuführen ist. Unsere Ergebnisse zeigen, dass ISL1 zur Bildung der pyloric OLM Schicht während des Magen organogenesis lebenswichtig ist.
Ergebnisse | ISL1 wird in embryonalen Maus Magen ausgedrückt kaufen Wir ISL1
mRNA-Spiegel in der embryonalen Maus Magen untersucht, indem Echt time quantitative PCR (RT-qPCR) und ganze mount in situ Hybridisierung
(WISH). ISL1
mRNA wurde zunächst bei E11,5 mittels RT-qPCR nachgewiesen. ISL1
das höchste Niveau an E13.5 erreicht, durch einen starken Rückgang bei E14,5 gefolgt und hatten keine wesentlichen Änderungen in das Erwachsenenalter (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S1a). Dieses Ergebnis war ähnlich wie bei einem früheren Bericht [29]. Die Lokalisierung von ISL1
mRNA-Expression wurde unter Verwendung von WISH sucht. Wir führten ISL1
WISH in embryonalen Magen bei E11,5, E13.5 und E14.5. Bei E11,5 wurde ISL1
auf der hinteren Hälfte des Magens lokalisiert (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S1b). Allerdings war das ISL1
WISH Signal viel stärker und in den Pylorus von E13.5 (1A) kondensiert. Als Magen Entwicklung fortgeschritten ist, setzten die Pylorus ISL1
und die Expression von ISL1 auszudrücken
bei E14,5 (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S1b) dem potenziellen pyloric Schließmuskel verlängert. Allerdings schwächte sich die ISL1
WISH Signal erheblich von E13.5 bis E14.5. Diese ISL1
WISH Ergebnisse zustimmend ISL1
RT-qPCR Ergebnisse. Abbildung 1 ISL1 ist in der Entwicklung der Maus Magen ausgedrückt. (A) Embryonale Magen WISH-Analyse zeigte, dass ISL1
Ausdruck in den Pylorus bei E13.5 (Pfeil) beschränkt war. (B) Immunhistochemische Färbung für ISL1 im Magen. Abschnitte von Embryonen wurden in rostral Schwanz Sequenz bei E11,5 und E13.5 angeordnet und ISL1 Expression wurde vor allem auf die Mesenchym des hinteren Magen lokalisiert. Bei E14.5 und E18.5 wurde ISL1 hoch in glatten Muskelzellen der Pylorus ausgedrückt, obwohl es einige ISL1-positive Zellen in der Lamina propria waren (Pfeilspitzen). Vergrößerte Bilder in boxed Regionen sind im folgenden Originalbilder gezeigt. D, Duodenum; Liv, Leber; Pa, der Bauchspeicheldrüse; St, Magen. Maßstabsbalken von Originalbildern: 100 &mgr; m; Maßstabsbalken vergrößerter Bilder:. 50 &mgr; m kaufen Wir dann ISL1 Protein-Expression mittels Immunhistochemie bewertet. Ergebnisse zeigten, dass ISL1 hauptsächlich auf den posterior Magen Mesenchym von E11.5 an E13.5 lokalisiert wurde, dann wurde ISL1 in glatten Muskelzellen des Pylorus (1B und zusätzliche Datei 1: Figure S1c) ausgedrückt, und war auch feststellbar in der lamina propria (1B, Pfeilspitzen). . Bei erwachsenen Maus Magen, nur wenige ISL1-positiven Zellen wurden in der glatten Muskulatur beobachtet (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S1c)
ISL1-positive Zellen co-exprimiert mit α-Glattmuskelaktin in embryonalen Maus Magen
um zu sehen, ob wurde ISL1 Ausdruck in Bezug auf die Entwicklung der Muskulatur des Pylorus glätten, untersuchten wir die Expression von ISL1 und den frühest glatten Muskulatur Marker α-SMA mit Immunofluoreszenz. Ergebnisse zeigten, dass der Anteil der ISL1-positive Zellen α-SMA allmählich erhöht (Abbildung 2) ausdrückt. Bei E11,5, keine α-SMA-positiven Zellen nachgewiesen wurden, obwohl ISL1 hoch im Mesenchym des hinteren Magen ausgedrückt wurde. Bei E14,5, eine Teilmenge von ISL1-positiven Zellen, vor allem diejenigen, die in der inneren Ringmuskel (ICM) des Pylorus, waren α-SMA positiv. Von E16.5 hat pyloric OLM bereits Differenzierung unterzogen [20]. Bei E18,5, war die Mehrheit der ISL1-positiven Zellen in den Pylorus α-SMA positiv. ISL1 Ausdruck beharrte in reifen pyloric ICM und OLM und Lamina propria Zellen auch ISL1 (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S2) ausgedrückt. Darüber hinaus wurde ISL1 Expression in menschlichen Proben von hypertrophen Pylorusstenose durch Immunofluoreszenz untersucht, und die Ergebnisse zeigten, dass ISL1 auch in menschlichen Zellen der glatten Muskulatur des Pylorus (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S3) zum Ausdruck gebracht wurde. Deshalb legen diese Ergebnisse nahe, dass ISL1 in der Bildung von Pylorus Sphincter teilnehmen. Abbildung 2 Doppelimmunfärbung für ISL1 und α-Glattmuskelaktin in Maus glatten Muskelzellen der dorsalen Pylorus. ISL1 und α-SMA Coexpression in glatten Muskelzellen bei E11.5, E14.5 und E18.5. Gelb punktierten Linien die Epithelbasalmembran markieren, dicke weiße gepunkteten Linien ICM und OLM Grenze, und weiß gepunkteten Linien OLM und Pankreas-Grenze. Rote Färbung ist ISL1, grüne Färbung ist a-SMA und DAPI Kern Gegenfärbelösung (DNA) ist blau. α-SMA, α-Glattmuskelaktin; ICM, innere Ringmuskel; OLM, äußeren Längsmuskel; Pa, der Bauchspeicheldrüse; St, Magen. Maßstabsbalken:. 50 &mgr; m
ISL1 Expression in ISL1 effektiv abgetragenen
MCM /F
-induzierbaren Knockout-Mäuse
Effekte von ISL1
Ablation auf Magen Entwicklung zu untersuchen, verwendeten wir ISL1
MCM /F
-induzierbaren Cre (ISL1
MCM /Del
) Mäuse (3A) und ISL1
F /+ m
Eis waren als Kontrollen verwendet [30, 31]. und intakten oder mutierten ISL1
mRNA wurde zeichnet sich durch semi-quantitative PCR (3B): Die Embryonen wurden durch PCR bei E18,5 (Abbildung S4 Weitere Datei 1) genotypisiert. Abbildung 3 Effizienz von ISL1 Ablation in Mägen von ISL1 MCM /Del-Mausmutante Mägen bei E18,5. (A) Tamoxifen-induzierbare Cre-Rekombinase ausgeschnittene DNA-Sequenzen von zwei loxP
Stellen flankiert. (B) ISL1
RNA-Spiegel wurden in ISL1
MCM /Del
Mutant Mägen abgetragenen wie durch semi-quantitative PCR gesehen. ISL1
F /+ m
Eis zeigte ein 592 Basenpaar-Produkt während ISL1
MCM /Del
Mäuse, die ein 303-Basenpaar-Produkt erzeugt. (C) ISL1 war signifikant herunterreguliert auf den Proteinspiegel in ISL1
MCM /Del
Mutant Mägen wie durch Western-Blot gezeigt. Expression von Embryos bei E11.5 wurde als positive Kontrolle verwendet. (D) ISL1 Proteinexpression in ISL1
F /+ a
nd ISL1
MCM /Del
embryonale Pylorus. ISL1 Expression wurde in ISL1
MCM /Del
embryonale Mägen deutlich reduziert, wie durch Immun gesehen. Bilder in ISL1
F /+ a
nd ISL1
MCM /Del
bei der gleichen Belichtung auf derselben Folie und fotografiert verarbeitet wurden. Vergrößerte Bilder der boxed Bereiche werden auf der rechten Seite der fusionierten Bilder gezeigt. Gelbe Pfeile zeigen repräsentative ISL1-positive Zellen und weißen Pfeile zeigen repräsentative ISL1-negativen Zellen. Gelb gepunkteten Linien markieren die epithelialen Basalmembran. Maßstabsbalken:. 50 &mgr; m
Western-Blot-Analysen zeigten, dass ISL1 Proteinspiegel in der embryonalen Magen von ISL1
MCM /Del
Mäuse waren deutlich niedriger als die in ISL1
F /+ m
Eis (3C). Immunofluoreszenz Ergebnisse zeigten eine signifikant ISL1 Färbung in Pylorus von ISL1
MCM /Del
Mäuse im Vergleich zu den Kontrollen (3D) reduziert. Diese Daten zeigen, dass ISL1
Ausdruck war effektiv herunterreguliert in ISL1
MCM /Del
Mutant Mägen.
Pyloric Anomalien in ISL1
MCM /F
Mutanten
Um die Effekte von ISL1
Ablation auf Magen Entwicklung zu untersuchen, verglichen wir morphologische und histologische Unterschiede zwischen ISL1
MCM /Del
und ISL1
F /+ s
tomachs bei E18,5. Bei E18.5 wurde gelbe Flüssigkeit in ISL1 beobachtet
MCM /Del
Mägen, aber nicht in Mägen von ISL1
F /+ l
ittermates (4A, Sternchen) . Die histologische Untersuchung zeigte, dass die dorsale pyloric glatten Muskulatur war viel dünner im Pylorus von ISL1
MCM /Del
Mäuse im Vergleich mit den Kontrollen (4B). Wir untersuchten die Expression und Verteilung von α-SMA in beide ISL1
MCM /Del
Mutanten und ISL1
F /+ p
ylorus. Immunofluoreszenz Ergebnisse zeigten, dass ISL1 Mangel an fast vollständigen Fehlen der pyloric OLM Schicht bei E18,5 geführt, und die verbleibenden Zellen wurden lose organisiert (5A, Sternchen). Darüber hinaus Verengung des Magenpförtner in ISL1 abgeschwächt wurde
MCM /Del
Mutant Mägen im Vergleich mit Verengung ISL1
F /+ s
tomachs (5B) . Ferner untersuchten wir die Expression des glatten Muskelzellen spezifische Protein Calponin-1 bei E18.5 und Immunofluoreszenz-Ergebnisse zeigten, dass der Verlust von ISL1 auch in Abwesenheit von in der Nähe Calponin-1-Expression in dorsalen pyloric OLM Schicht ergab, ähnlich mit α- führen SMA (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S5). Sox9 wird sowohl in Epithel und Mesenchym exprimiert [9] und ist für die Entwicklung von OLM und die Bildung von Magenpförtner Verengung erforderlich [20]. Unsere Ergebnisse zeigten, dass Immunofluoreszenz Sox9 auf normalem Niveau im Magen Epithel ISL1 blieb
MCM /Del
Mäusen bei E14.5 und E18.5 (Figur 6, Pfeilspitzen), aber der Bereich der Pylorus glatten Muskulatur Sox9 exprimierte, wurde in ISL1
MCM /Del
Mutanten bei E14,5 (6A, Sternchen) und abwesend bei E18,5 (6B, Sternchen) deutlich reduziert. So wurde ISL1
für Zellen Sox9
Expression in dorsalen pyloric OLM erforderlich. Diese Ergebnisse zeigen, dass ISL1 entscheidend ist für die Entwicklung der Maus pyloric glatten Muskulatur zu regulieren. Abbildung 4 Morphologische und histologische Veränderungen bei der Entwicklung von Magen von ISL1 MCM /Del Mutanten. (A) Gross und mikroskopischen Nachweis für Magen Defekte in ISL1
MCM /Del
Mäuse. Ganze Berge Blick auf E18,5 in ISL1
F /+ a
nd ISL1
MCM /Del
Maus Mägen. ISL1
MCM /Del
Mutant Mägen fehlte eine funktionelle Magenpförtner (Pfeilspitze), wodurch Rückfluss von Flüssigkeit ermöglicht, wie in mutanten Embryonen beobachtet. Gelbe Flüssigkeit wird durch Sternchen gekennzeichnet. (B) Hämatoxylin und Eosin-Färbung von ISL1
F /+ a
nd ISL1
MCM /Del
Maus Pylorus bei E18,5. Die dorsale pyloric glatten Muskulatur (schwarze Box-Region) war prominent in ISL1
F /+ e
mbryos, war aber viel dünner in ISL1
MCM /Del
Embryonen. Der Rest der Pylorus wurde histologisch normal. Grüne gepunkteten Linien markieren die epithelialen Basalmembran. Vergrößerte Bilder in boxed Regionen sind unter den ursprünglichen Fotos gezeigt. Maßstabsbalken von Original-Fotos: 200 &mgr; m; Maßstabsbalken vergrößerter Bilder: 50 &mgr; m. H &. E, Hämatoxylin und Eosin
Abbildung 5 Verlust von ISL1 Bildung des dorsalen pyloric äußeren Längsmuskel stört. (A) Immunofluoreszenz von ISL1 und α-SMA in ISL1
F /+ a
nd ISL1
MCM /Del
embryonale Pylorus bei E18,5. Der Verlust der ISL1 führte zu fast vollständigen Verlust der α-SMA-positiven Zellen im dorsalen pyloric OLM (Sternchen). Gelb gepunkteten Linien markieren die epithelialen Basalmembran und weiß gepunkteten Linien ICM und OLM Grenze. Rote Färbung ist ISL1, grüne Färbung ist a-SMA und DAPI Kern Gegenfärbelösung (DNA) ist blau. Maßstabsbalken: 50 &mgr; m. (B) α-SMA Immunofluoreszenz von ISL1
F /+ a
nd ISL1
MCM /Del
embryonale Pylorus bei E18,5. Im Vergleich mit ISL1
F /+ e
mbryos war der Magenpförtner Verengung breiter in ISL1
MCM /Del
Tiere. Sphincter Einschnürung Messungen sind gezeigt. Gelbe Balken abgrenzen den Pylorus und markieren Sie den deutlichen Unterschied in der Breite zwischen ISL1
F /+ a
nd ISL1
MCM /Del
Proben. Daten sind Mittelwerte ± SEM (n
= 6 Mäuse pro Gruppe), * P
< 0,05 (Student t
-Test). Maßstabsbalken: 50 &mgr; m. α-SMA, α-Glattmuskelaktin; ICM, innere Ringmuskel; OLM, äußeren Längsmuskel.
6 Verlust der ISL1 Abbildung die dorsale pyloric äußeren Längsmuskel Sox9 Ausdruck eliminiert. (A) Doppel-Immunfärbung für ISL1 und Sox9 im dorsalen Pylorus bei E14,5. In Abwesenheit von ISL1, die Domäne von mesodermalen Zellen (Sternchen) Sox9 exprimierte, wurde kleiner. (B) Doppelimmunfärbung für ISL1 und Sox9 im dorsalen Pylorus bei E18,5. Induzierbare ISL1 Knockout effektiv ISL1 Ausdruck, mit gleichzeitigem Verlust von Sox9 Expression in den dorsalen OLM Zellen (Sternchen) eliminiert. Sox9 Ausdruck war normal in Magenepithels in beiden Phasen (Pfeilspitzen). Gelb gepunkteten Linien markieren die epithelialen Basalmembran und weiß gepunkteten Linien getrennt ICM und OLM. Rote Färbung ist ISL1, grüne Färbung ist Sox9 und DAPI Kern Gegenfärbelösung (DNA) ist blau. Maßstabsbalken: 50 &mgr; m. ICM, innere Ringmuskel; OLM, äußeren Längsmuskel.
Expression und Verteilung von Protein-Genprodukt 9.5 (PGP9.5), eine enterale Nervensystem Marker [32], war intakt bei E18,5 in ISL1
MCM /Del
Mutant Mägen (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S6). Pankreas- und Duodenal-Homeobox-Gen 1 (Pdx1) in Epithelzellen des Antrum-Pylorus-Segment und dem rostral Duodenum [33] ausgedrückt. Unsere Immun Ergebnisse zeigten, dass Pdx1 Expression war ähnlich in ISL1
MCM /Del
Mäuse im Vergleich zu den Kontrollen bei E18,5 (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S7). Darüber hinaus wurde die Maus Magen und Zwölffingerdarm-Epithelzellen Grenze zwischen E14,5 etabliert und E16.5 [34], diesen Zeitraum fällt mit der Entwicklung der OLM Schicht [20]. Wir testeten die Integrität des Magen-Dünndarm epithelialen pyloric Grenze bei E18,5 durch Expression einer darmspezifischen epithelialen Marker Cdx2 untersuchen [19]. Unsere Immunhistochemie Ergebnisse zeigten, dass die Position des epithelialen pyloric Grenze in ISL1
MCM /Del
Mäusen, die der Kontrollen ähnlich war (Zusatzdatei 1: Abbildung S8). Diese Ergebnisse zeigen, dass der Verlust von ISL1 nicht Innervation oder epitheliale Entwicklung des Pylorus beeinflussen.
Verlust von ISL1 nicht Proliferation oder Apoptose von pyloric inneren Ringmuskel und äußeren Längs Muskelzellen beeinflussen
Um zu sehen, ob ISL1 Ausdruck war verwandte auf die Zellproliferation des Pylorus, untersuchten wir die Co-Lokalisierung von ISL1 und die proliferative Marker bromodeoxyuridine (BrdU) Immunofluoreszenz in ISL1
F /+ m
Eis verwenden. Unsere Ergebnisse zeigten, dass BrdU-positiven Zellen bei E11,5 und verstreut in den ICM und OLM Regionen bei E14,5 und E18,5 (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S9a) dicht waren. Darüber hinaus ist der Anteil der wuchernden ICM und OLM Zellen unterschied sich nicht signifikant zwischen ISL1
MCM /Del
und ISL1
F /+ m
Eis bei E18,5 ( Weitere Datei. 1: Abbildung S9b)-Mail an einen potenziellen Auswirkungen auf die Apoptose zu bewerten, untersuchten wir Caspase 3 Expression bei E18,5 gespalten, und unsere Immun Ergebnisse zeigten keine Caspase waren 3-positive Zellen in pyloric ICM oder der OLM Schicht von ISL1
MCM /Del
und ISL1
F /+ m
Eis (Weitere Datei 1: Abbildung S10). Diese Daten zeigen, dass ISL1 Ablation hat keine Auswirkungen auf die Proliferation oder Apoptose von pyloric ICM und OLM Zellen.
Verlust von ISL1 führt zu einer verminderten Expression von Gata3
, Gremlin
und Nkx2.5
da eine Anzahl von Faktoren, einschließlich Bapx1
[18], Barx1
[35], Gata3
[19, 36], Gremlin
[5], Nkx2.5
[2] und Six2
[9], wurde berichtet, dass bei der Regulierung der Pylorus Entwicklung einbezogen werden, untersuchten wir die Effekte von Verlust von ISL1 auf die Expression dieser Gene bei E14.5 und E18.5. RT-qPCR Ergebnisse zeigten, dass der Verlust von ISL1
nicht Ausdruck bei der Bapx1
oder Barx1
nicht beeinträchtigte entweder E14,5 oder E18,5 (7A, B). Bei E18,5, α-SMA
und Six2
mRNA-Spiegel waren signifikant niedriger in ISL1
MCM /Del
Mäuse im Vergleich mit den Kontrollen (7B). Bei beiden E14,5 und E18,5, Nkx2.5
, Gata3
und Gremlin
mRNA-Spiegel im Magen von ISL1
MCM /Del
Mäuse waren niedriger als Kontrollen (7A, B). GATA3
mRNA-Spiegel waren ungefähr 70% in beiden Phasen verringert sucht (7A, B). Basierend auf diesen Ergebnissen untersuchten wir ISL1
, Gata3
, Gremlin
und Nkx2.5
Ausdruck in ISL1
MCM /F
Mutante und ISL1
F /+ s
tomachs WISH verwenden. Ergebnisse zeigten, dass die Expression von jedem dieser Gene hauptsächlich auf die Pylorusgegend beschränkt war, wie erwartet; Gata3
wurde Ausdruck mehr in mutierten Mägen reduziert; und Gremlin
und Nkx2.5
hatte nur subtile Veränderungen (7E, F). ISL1
und Gata3
Ausdruck waren die am stärksten betroffen (7C, D). Diese Ergebnisse waren konsistent mit RT-qPCR-Daten und legen nahe, dass ISL1 reguliert die Expression von Gata3
, Gremlin
und Nkx2.5
. 7 anomale Genexpression in hindstomach in ISL1 MCM /Del Mutanten. (A) RT-qPCR-Analyse von mRNA-Spiegel von hindstomach angereicherten Transkriptionsfaktoren bei E14,5 zeigt signifikante Reduktion von α-SMA
, Six2 Nkx2.5
, Gata3
und Gremlin
mRNA in ISL1
MCM /Del
Mutant Mägen (n
= 4). Alle Ergebnisse wurden auf ein Niveau von GAPDH
mRNA normalisiert. (B) RT-qPCR-Analyse von mRNA-Spiegel von hindstomach angereicherten Transkriptionsfaktoren an E18.5 zeigt eine signifikante Reduktion der Nkx2.5
, Gata3
und Gremlin
mRNA im ISL1
MCM /Del
Mutant Mägen (n
= 4). Alle Ergebnisse wurden auf ein Niveau von GAPDH
mRNA normalisiert. Daten sind Mittelwerte ± SEM (n = 6
Mäuse pro Gruppe). * P
< 0,05 gegenüber ISL1
F /+
; ** P
< 0,01 im Vergleich zu ISL1
F /+
(Student t
-Test). (CF) WISH mRNA-Analyse bestätigt Verlust von ISL1
, Gata3
, Gremlin
und Nkx2.5
mRNA-Expression bei E14,5 in der ISL1
MCM /Del
Mutante Mägen. ISL1
und Gata3
mRNA wurden stark herunterreguliert in ISL1
MCM /Del
Mäuse, während Gremlin
und Nkx2.5
Ausdruck leicht reduziert wurden. Die Pfeile zeigen auf die Magenpförtner.
ISL1 Ziele Gata3
und aktiviert seine transcription Gata3
selektiv in den Pylorus der Entwicklungsmausembryo exprimiert wird [19, 20]. Expression beider ISL1
und Gata3
mRNA wurde in den Pylorus bei E14,5 beobachtet, aber ob Gata3 und ISL1 sind in den gleichen Zellen exprimiert wurde nicht untersucht worden. Daher untersuchten wir die Expression von ISL1 und Gata3 durch Immunofluoreszenz analysiert. Ergebnisse zeigten, dass ISL1 und Gata3 Proteine ​​in den gleichen Zellen des Pylorus bei E14.5 und E18.5 in ISL1 coexprimiert wurden
F /+ c
ontrol Mägen (Abbildung 8). Darüber hinaus wurde der Bereich Gata3 ausdrückt deutlich kleiner in ISL1
MCM /Del
Mutant pyloric glatten Muskulatur bei E14,5 (8A), und es wurde bei E18,5 in der pyloric OLM Schicht verloren (8B). So wurde ISL1
für Gata3
Ausdruck in der dorsalen pyloric OLM Schicht erforderlich. Um zu untersuchen, ob ISL1 pyloric Entwicklung reguliert, indem es direkt Regulierung Gata3
, führten wir bioinformatische Analyse des Gata3 genomischen Lokus. Die Maus Gata3
Gen enthält mehrere mutmaßliche ISL1-Response-Elemente (ATTA /TAAT) bei -2832 Basenpaare (bp) auf 1.002 bp von der Transkriptionsinitiationsstellen [37]. Wir identifizierten 10 Bereiche, die eine mutmaßliche ISL1 Bindungsstelle (9A) enthalten sind, und 10 Paare entsprechender Primer entworfen wurden, um diese Regionen folgende Chromatinimmunpräzipitation (Chip-) Studien zu verstärken Antikörper gegen ISL1 verwendet. Immunpräzipitiert genomische DNA wurde aus pyloric Regionen von Maus-Embryos bei E14.5 erhalten. Von den 10 mutmaßlichen ISL1 Bindungsbereiche, zwei getrennte Bereiche, in dem -2558 bp bis -2303 bp (P1-Region) und -1081 bp bis -855 bp (P6 Region) wurden von ISL1 Protein besetzt. Dieses Ergebnis wurde durch semi-quantitative PCR (9B) und der Falte Anreicherungsverfahren (Abbildung 9C) bestätigt. Abbildung 8 Verlust von ISL1 beseitigt die dorsale pyloric äußeren Längsmuskel Gata3 Ausdruck. (A) Doppel-Immunfärbung für ISL1 und Gata3 im dorsalen Pylorus bei E14,5. Die Region von mesodermalen Zellen (Sternchen) zum Ausdruck Gata3 war kleiner in der ISL1
MCM /Del
Pylorus als ISL1
Fl +
. (B) Doppelimmunfärbung für ISL1 und Gata3 im dorsalen Pylorus bei E18,5. Induzierbare ISL1 Knockout effektiv ISL1 Ausdruck, mit gleichzeitigem Verlust von Gata3 Expression in den dorsalen OLM Zellen (Sternchen) eliminiert. Gelb gepunkteten Linien markieren die epithelialen Basalmembran und weiß gepunkteten Linien des ICM und OLM Grenze angeben. Weiß Pfeilspitze zeigt unspezifische Fleck. Alle Autoren gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.

• Eine seltene Ursache für Magen-Darm-Phytobezoare: diospyros Lotus
• Der Transkriptionsfaktor FOXO4 herunterreguliert und hemmt das Tumorproliferation und Metastasierung bei Magenkrebs