LIM homeodomæne transskription faktor Isl1 dirigerer normal pylorus udvikling ved at målrette Gata3

LIM homeodomæne transskription faktor Isl1 dirigerer normal pylorus udvikling ved at målrette GATA3
Abstract
Baggrund
abnormaliteter i pylorus udvikling eller i kontraktile funktion af pylorus årsag refluks af duodenal indholdet i maven og øger risikoen for gastrisk metaplasi og kræft. Abnormiteter i pyloric regionen er også knyttet til medfødte defekter såsom forholdsvis almindelig neonatal hypertrofisk pylorusstenose, og primær duodenogastrisk reflux. Derfor forstå pylorus udvikling er af stor klinisk relevans. Her har vi undersøgte rolle LIM homeodomænet transskription faktor Isl1 i pylorus udvikling.
Resultater
Undersøgelse af Isl1 udtryk i udviklingslandene mus maven ved immunhistokemi, hele montere in situ
hybridisering og real-time kvantitativ PCR demonstreret at Isl1 udtrykkes kraftigt i at udvikle mus mave, hovedsagelig i den glatte muskulatur lag af pylorus. Isl1 ekspression blev også undersøgt ved immunofluorescens i human hypertrofisk pylorusstenose hvor størstedelen af ​​glatte muskelceller blev fundet at udtrykke Isl1. Isl1
funktion af fosterudviklingen maven blev undersøgt under anvendelse af en tamoxifen-inducerbar Isl1
knockout musemodel. Isl1
mangel førte til næsten fuldstændigt fravær af pylorus ydre langsgående muskellag på embryonisk dag 18,5, hvilket er konsistent med GATA3
null mus fænotype. Chromatin immunoprecipitation, luciferaseassays, og elektroforetiske mobilitet skift analyser afslørede, at Isl1 sikrer normal pylorus udvikling ved direkte rettet mod GATA3
.
Konklusioner
Denne undersøgelse viser, at Isl1-GATA3
transskription regulatoriske akse er afgørende for normal pyloric udvikling. Disse resultater er meget klinisk relevant og kan bidrage til bedre at forstå, der fører til pyloric sygdom.
Nøgleord
α-glatmuskelactin GATA3 Isl1 pylorus Baggrund
hvirveldyr gut er en bemærkelsesværdig struktur, der indtager og fordøjer mad, absorberer næringsstoffer, og fjerner affaldsprodukter. Tarmen stammer fra en simpel rørformet struktur bestående af tre kim lag, herunder en underliggende endoderm, en omgivende splanknisk mesoderm, og en ektoderm [1-3]. I musefostre, bliver tarmen mønstrede langs anterior-posterior, dorsal-ventral, venstre-højre, og radiale akser. Tarmen rør består af fortarm, mellemtarmen og stortarmen langs dens anteriore-posteriore akse [4, 5]. Som udviklingen skrider frem, fortarm giver anledning til spiserøret, mave, lever, lunger og bugspytkirtel. Mellemtarmen danner tyndtarmen og colon, udvikler sig til tyktarmen [1, 5-8].
Maven er afledt fra den bageste fortarm. Maven morfologisk adskiller fra fortarm røret omkring fosterdag 9,5 (E9.5) og udvidelsen af ​​den præ-gastrisk mesenkym tillader domæne i maven at være synlig begyndende ved E10.5 [9]. Mesenkymale celler af maven differentierer til fire forskellige koncentriske lag, herunder lamina propria, muscularis slimhinden, og cirkulær og langsgående glat muskel på forskellige stadier af fosterudviklingen [10]. Ved E11.5, maven er udpræget forstørret. Maven glatte muskulatur adskiller ved E13, med et særskilt lag af α-glatmuskelactin (α-SMA) -positive celler, der er opført og en cirkulær muskel lag, der danner hele maven [11]. Den glatte muskulatur lag tykkere i den indsnævrede prospektive pyloric sphincter region ved ca. E14.5 [2, 9]. Ved E18.5, pyloric sphincter begynder at fungere til at forhindre refluks af duodenale indhold i maven [9].
Bageste eller pylorus del af maven er den anatomiske forbindelse mellem mavesækken og tolvfingertarmen. Fra endepunktet for pylorus, kan de særskilte valvulær flapper af pylorus sphincter ses [2]. Under normale fysiologiske betingelser, maven afhænger af dens peristaltisk sammentrækning til at slibe og stak den delvist fordøjet mad, og pylorus afhængig af sin fortykkede pylorus sphincter at styre strømmen af ​​fødevarer i tyndtarmen. Abnormiteter i pyloric udvikling eller i den kontraktile funktion af pylorus forårsage refluks af duodenale indhold i maven og øge risikoen for gastrisk metaplasi og cancer [12, 13]. Abnormaliteter af pylorus er relateret til medfødte defekter [14-16]. Derfor har megen opmærksomhed været rettet mod de regulerende elementer og veje for mave udvikling, især pylorus og pylorus lukkemuskel udvikling.
Tidligere data i chick foreslog, at knoglemorfogenetisk protein (BMP) signalering regulerer mesenkymale udtryk for Nkx2.5
og Sox9
, som påvirker karakteren af ​​pyloric epitel men har ingen effekt på pylorus glatte muskulatur [5, 17], hvilket antyder, at mesenkymale signalering af ukendte faktorer påvirker pylorus epitel fænotype. I mus, er molekylære mekanismer for pyloric dannelse lidt forstået, med relativt få af de faktorer, der kræves for normal pyloric udvikling blevet identificeret. De, der har været inkluderer Sox9
[17], Six2
[9], Bapx1
[18], Nkx2.5
[3, 17], Gremlin
[9], og GATA3
[19, 20]. Ablation af homeodomænet transskriptionsfaktoren, Six2
, udtrykt i posterior mave, forstyrrer fortykkelse af pylorus glatte muskellag og dæmper konstriktion af pylorus sphincter. Desuden tab af Six2
eliminerer Sox9
ekspression, og reducerer Nkx2.5
og Gremlin
ekspression i pylorus, selv om dette udtryk senere genvinder [9], hvilket antyder, at Six2
, Sox9
, Nkx2.5
, og Gremlin
er nødvendige for pylorus udvikling. Desuden Nkx2.5
, Sox9
, og GATA3
er co-udtrykkes i den dorsale pyloric ydre langsgående muskel (OLM) lag, der modnes mellem E14.5 og E16.5. Efter sletning af Nkx2.5
eller GATA3
, den dorsale pyloric OLM er næsten fraværende og konstriktion af pylorus lukkemuskel dæmpes [20].
LIM homeodomæne (LIM-HD) transskription faktor Isl1 var oprindeligt sig at fungere som en insulin-gen forstærker bindende protein [21]. Isl1 består af to tandem LIM domæner og en homeodomæne. Homeodomænet, med sin helix-turn-helix struktur, binder til regulatoriske DNA-sekvenser af målgener, mens LIM domæner hovedsagelig er involveret i protein-protein interaktioner, der regulerer aktiviteten af ​​LIM-HD [22]. Isl1 spiller kritiske roller i celle beslutsomhed, proliferation og differentiering i nervesystemet [23, 24], hjerte [25], og hypofysen [26]. Desuden har Isl1 ekspression blevet detekteret i gastrisk mesenchyme [27, 28] og gastrointestinal epitel i både embryonale og voksne mus [29]. Men den rolle Isl1 i maven udvikling har endnu at blive udforsket. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi Isl1 ekspression i maven. Isl1 var stærkt til udtryk i den bageste maven i tidlige stadier af udvikling og var primært begrænset til de glatte muskelceller i pylorus. At undersøge Isl1
funktion i maven udvikling, vi udnyttet en tamoxifen-inducerbar knockout musemodel. En inducerbare model blev nødvendig, fordi Isl1 - /- Restaurant mutanter die ved ca. E10.5 på grund af fejl i hjerte formation.
Vores resultater viser, at Isl1 er afgørende for dannelsen af ​​pylorus OLM lag under maven organogenese. Resultater
Isl1 udtrykkes i embryonale mus mave
Vi undersøgte Isl1
mRNA-niveauer i embryonale mus maven ved real- tid kvantitativ PCR (RT-qPCR) og hele mount in situ
hybridisering (WISH). Isl1
mRNA blev oprindeligt detekteret ved E11.5 ved RT-qPCR. Isl1
nåede det højeste niveau ved E13.5, efterfulgt af et kraftigt fald på E14.5, og havde ingen væsentlige ændringer i voksenalderen (Yderligere fil 1: Figur S1A). Dette resultat var ligner en tidligere rapport [29]. Lokaliseringen af ​​Isl1
mRNA-ekspression blev undersøgt ved anvendelse af WISH. Vi udførte Isl1
WISH i embryonale mave på E11.5, E13.5 og E14.5. Ved E11.5 blev Isl1
lokaliseret til den bageste halvdel af maven (Yderligere fil 1: Figur S1b). Imidlertid Isl1
WISH signalet var meget stærkere og kondenseres i pylorus ved E13.5 (figur 1A). Som mave udvikling skred frem, pylorus fortsatte med at udtrykke Isl1
udtryk for Isl1
udvides til den potentielle pyloric lukkemuskel på E14.5 (Yderligere fil 1: Figur S1b). Men Isl1
WISH signal svækket betydeligt fra E13.5 til E14.5. Disse Isl1
WISH resultater enige med Isl1
RT-qPCR resultater. Figur 1 Isl1 udtrykkes i udviklingen muse maven. (A) Embryonale mave WISH analyse viste, at Isl1
udtryk var begrænset til pylorus på E13.5 (pil). (B) Immunhistokemisk farvning for Isl1 i maven. Sektioner fra embryoner blev anbragt i rostralt til kaudal sekvens ved E11.5 og E13.5, og Isl1 ekspression blev primært lokaliseret til mesenkym af den bageste maven. På E14.5 og E18.5, blev Isl1 stærkt udtrykt i glatte muskelceller af pylorus, selv om der var nogle Isl1-positive celler i lamina propria (pilespidser). Forstørrede billeder i boxed regioner er vist nedenfor originale billeder. D, duodenum; Liv, lever; Pa, pancreas; St, mave. Scale stænger af originale billeder: 100 um; skala stænger af forstørrede billeder:. 50 um
Vi derefter vurderet Isl1 proteinekspression ved immunhistokemi. Resultaterne viste, at Isl1 hovedsagelig var lokaliseret til den bageste maven mesenkym fra E11.5 til E13.5, derefter Isl1 blev udtrykt i glatte muskelceller i pylorus (figur 1B og yderligere fil 1: Figur S1c), og var også detekterbar i lamina propria (figur 1B, pilespidser). I voksne mus mave, blev kun nogle få Isl1-positive celler observeret i den glatte muskulatur lag. (Yderligere fil 1: Figur S1c)
Isl1-positive celler co-udtrykkes med α-glat muskulatur actin i embryonale mus mave
for at se, om Isl1 udtryk var relateret til glat muskel udvikling af pylorus, undersøgte vi ekspressionen af ​​Isl1 og tidligste glatte muskelceller markør α-SMA hjælp immunofluorescens. Resultaterne viste, at andelen af ​​Isl1-positive celler, der udtrykker α-SMA gradvist (figur 2). Ved E11.5, blev påvist nogen α-SMA-positive celler, selv om Isl1 blev højt udtrykt i mesenchym af den bageste maven. Ved E14.5, en delmængde af Isl1-positive celler, hovedsageligt dem i den indre cirkulære muskel (ICM) af pylorus, var α-SMA positiv. Ved E16.5, har pylorus OLM allerede gennemgået differentiering [20]. Ved E18.5, at størstedelen af ​​Isl1-positive celler i pylorus blev α-SMA positiv. Isl1 udtryk varet i moden pylorus ICM og OLM og lamina propria celler også udtrykt Isl1 (Yderligere fil 1: Figur S2). Derudover blev Isl1 udtryk undersøgt i humane prøver af hypertrofisk pylorusstenose ved immunfluorescens, og resultaterne viste, at Isl1 også blev udtrykt i humane glatte muskelceller af pylorus (Yderligere fil 1: Figur S3). Derfor er disse resultater antyder, at Isl1 kan deltage i dannelsen af ​​pyloric sphincter. Figur 2 Dobbelt immunfarvning for Isl1 og α-glatmuskelactin i muse glatte muskelceller i dorsale pylorus. Isl1 og α-SMA co-ekspression i glatmuskelceller ved E11.5, E14.5, og E18.5. Gule stiplede linjer markerer epitelbasalmembranen, hvide tykke stiplede linjer angiver ICM og OLM grænse, og hvide stiplede linjer angiver OLM og bugspytkirtel grænse. Rød farvningen er Isl1, grøn farvning er a-SMA, og DAPI nukleare kontrastfarvning (DNA) er blå. α-SMA, α-glatmuskelactin; ICM, indre cirkulær muskel; OLM, ydre langsgående muskel; Pa, pancreas; St, mave. Scale barer:. 50 um
Isl1 udtryk effektivt poleres i Isl1
MCM /F
inducerbare knockout-mus
For at undersøge effekten af ​​Isl1
ablation på maven udvikling, vi udnyttet Isl1
MCM /F
-inducerbare Cre (Isl1
MCM /Del
) mus (figur 3A) og Isl1
F /+ m
is var anvendt som kontroller [30, 31]. Embryoner blev genotypet ved PCR på E18.5 (Yderligere fil 1: Figur S4) og intakt eller mutant Isl1
mRNA blev kendetegnet ved semi-kvantitativ PCR (figur 3B). Figur 3 Effektivitet af Isl1 ablation i maver Isl1 MCM /Del mutant mus maver på E18.5. (A) Tamoxifen-inducerbare Cre rekombinase skåret DNA-sekvenser flankeret af to loxP
sites. (B) Isl1
RNA-niveauer blev poleres i Isl1
MCM /Del
mutant maver set af semi-kvantitativ PCR. Isl1
F /+ m
is viste en 592 basepar, hvorimod Isl1
MCM /Del
mus genererede et 303 basepar produkt. (C) Isl1 var signifikant nedreguleret på protein niveauer i Isl1
MCM /Del
mutant maver som det fremgår af western blot. Ekspression af embryoner på E11.5 blev anvendt som positiv kontrol. (D) Isl1 proteinekspression i Isl1
F /+ a
nd Isl1
MCM /Del
embryonale pylorus. Isl1 udtryk blev reduceret betydeligt i Isl1
MCM /Del
embryonale maver, som det ses ved immunfluorescens. Billeder i Isl1
F /+ a
nd Isl1
MCM /Del
blev behandlet på samme glas og fotograferet på samme eksponering. Forstørrede billeder af boxed områder er vist på højre side af de fusionerede billeder. Gule pilespidser viser repræsentative Isl1-positive celler, og hvide pilespidser viser repræsentative Isl1-negative celler. Gule stiplede linjer markerer epitelbasalmembranen. Scale barer:. 50 um
Western blot analyser viste, at Isl1 protein niveauer i embryonale mave Isl1
MCM /Del
mus var væsentligt lavere end i Isl1
F /+ m
is (figur 3C). Immunofluorescens resultater demonstrerede væsentligt reduceret Isl1 farvning i pylorus af Isl1
MCM /Del
mus sammenlignet med kontroller (figur 3D). Disse data viser, at Isl1
udtryk var effektivt nedreguleret i Isl1
MCM /Del
mutant maver.
Pylorus abnormiteter i Isl1
MCM /F
mutanter
at undersøge effekten af ​​Isl1
ablation på maven udvikling, vi sammenlignet morfologiske og histologiske forskelle mellem Isl1
MCM /Del
Isl1
F /+ s
tomachs ved E18.5. Ved E18.5 blev gul væske observeret i Isl1
MCM /Del
maver, men ikke i maver Isl1
F /+ l
ittermates (figur 4A, stjerne) . Histologisk undersøgelse viste, at dorsale pylorus glatte muskulatur lag var meget tyndere i pylorus af Isl1
MCM /Del
mus sammenlignet med kontroller (figur 4B). Vi undersøgte udtryk og distribution af α-SMA i både Isl1
MCM /Del
mutanter og Isl1
F /+ p
ylorus. Immunofluorescens resultater viste, at Isl1 mangel førte til næsten fuldstændigt fravær af pylorus OLM lag på E18.5, og de resterende celler blev løst organiseret (figur 5A, asterisk). Desuden blev konstriktion af pylorus lukkemuskel svækket i Isl1
MCM /Del
mutant maver sammenlignet med forsnævring i Isl1
F /+ r
tomachs (figur 5B) . Derudover analyserede vi udtryk for den glatte muskulatur specifikke protein Calponin-1 ved E18.5, og immunofluorescens resultater viste, at tab af Isl1 resulterede også i nær fravær af Calponin-1-ekspression i dorsale pyloric OLM lag, svarende til resultatet med α- SMA (Yderligere fil 1: Figur S5). Sox9 udtrykkes i både epitel og mesenkym [9] og er nødvendig for udvikling af OLM og dannelse af pylorus sphincter konstriktion [20]. Vores immunofluorescens Resultaterne viste, at Sox9 forblev på et normalt niveau i maven epitel Isl1
MCM /Del
mus ved E14.5 og E18.5 (figur 6, pilespidser), men området af pylorus glat muskulatur udtrykker Sox9 blev reduceret betydeligt i Isl1
MCM /Del
mutanter på E14.5 (figur 6A, asterisk) og fraværende på E18.5 (figur 6B, asterisk). Således blev Isl1
nødvendig for Sox9
udtryk i dorsale pylorus Olm celler. Disse resultater indikerer, at Isl1 er kritisk for regulering udvikling af muse pylorus glatte muskulatur. Figur 4 morfologiske og histologiske forandringer i udviklingen mave Isl1 MCM /Del mutanter. (A) Gross og mikroskopiske beviser for mave defekter i Isl1
MCM /Del
mus. Hele montere synspunkter på E18.5 i Isl1
F /+ en
nd Isl1
MCM /Del
mus maver. Isl1
MCM /Del
mutant maver manglede en funktionel pylorus lukkemuskel (pilespids), hvorved refluks af væske som observeret i mutant embryoner. Gul væske er angivet med asterisk. (B) Hematoxylin og eosin farvning af Isl1
F /+ a
nd Isl1
MCM /Del
mus pylorus på E18.5. Den dorsale pylorus glatte muskulatur (sort indrammede område) var fremtrædende i Isl1
F /+ e
mbryos, men var meget tyndere i Isl1
MCM /Del
embryoner. Den resterende del af pylorus histologisk normalt. Grønne stiplede linjer markerer epitelbasalmembranen. Forstørrede billeder i boxed regioner er vist nedenfor originale fotos. Scale barer af originale fotos: 200 um; skala stænger af forstørrede billeder: 50 pm. H &. E, hematoxylin og eosin
Figur 5 Tab af Isl1 forstyrrer dannelsen af ​​den dorsale pyloric ydre langsgående muskel. (A) Immunofluorescens af Isl1 og α-SMA i Isl1
F /+ a
nd Isl1
MCM /Del
embryonale pylorus på E18.5. Tab af Isl1 resulterede i næsten fuldstændig tab af a-SMA-positive celler i dorsale pyloric OLM (asterisk). Gule stiplede linjer markerer epitelbasalmembranen og hvide stiplede linjer angiver ICM og OLM grænse. Rød farvningen er Isl1, grøn farvning er a-SMA, og DAPI nukleare kontrastfarvning (DNA) er blå. Scale barer: 50 pm. (B) α-SMA immunfluorescens af Isl1
F /+ a
nd Isl1
MCM /Del
embryonale pylorus på E18.5. Sammenlignet med Isl1
F /+ e
mbryos, pylorus lukkemuskel konstriktion var bredere i Isl1
MCM /Del
dyr. Sphincter konstriktion målinger er vist. Gule søjler afgrænse pylorus og fremhæve den markante forskel i bredden mellem Isl1
F /+ A
nd Isl1
MCM /Del
prøver. Dataene er gennemsnit ± SEM (n
= 6 mus per gruppe), * P
< 0,05 (Students t
-test). Scale barer: 50 pm. α-SMA, α-glatmuskelactin; ICM, indre cirkulær muskel; OLM, ydre langsgående muskel.
Figur 6 Tab af Isl1 eliminerer den dorsale pyloric ydre langsgående muskel Sox9 ekspression. (A) Dobbelt immunfarvning for Isl1 og Sox9 i dorsale pylorus på E14.5. I fravær af Isl1, domæne mesodermale celler (asterisker), der udtrykker Sox9 var mindre. (B) Dobbelt immunfarvning for Isl1 og Sox9 i dorsale pylorus på E18.5. Inducerbar Isl1 knockout effektivt elimineret Isl1 udtryk, med samtidig tab af Sox9 udtryk i dorsale Olm celler (asterisk). Sox9 udtryk var normal i maven epitel i begge etaper (pilespidser). Gule stiplede linjer markerer epitelbasalmembranen og hvide punkterede linjer separat ICM og OLM. Rød farvningen er Isl1, grøn farvning er Sox9, og DAPI nukleare kontrastfarvning (DNA) er blå. Scale barer: 50 pm. ICM, indre cirkulær muskel; OLM, ydre langsgående muskel.
Expression og distribution af protein gen-produkt 9,5 (PGP9.5), en enterisk nervesystem markør [32], var intakt på E18.5 i Isl1
MCM /Del
mutant maver (Yderligere fil 1: Figur S6). Pancreas og duodenal homeobox gen 1 (Pdx1) udtrykkes i epitelceller i antrale-pyloric segment og rostral duodenum [33]. Vores immunofluorescens Resultaterne viste, at Pdx1 udtryk var ens i Isl1
MCM /Del
mus sammenlignet med kontrollen ved E18.5 (Yderligere fil 1: Figur S7). Desuden blev musen maven og duodenal epitelial grænse etableret mellem E14.5 og E16.5 [34], denne periode falder sammen med udviklingen af ​​OLM lag [20]. Vi testede integriteten af ​​maven-tyndtarmen epithelial pyloric grænse ved E18.5 ved at undersøge ekspression af en tarm-specifik epithelial markør CDX2 [19]. Vores immunhistokemi resultater viste, at placeringen af ​​epitelial pylorus grænse i Isl1
MCM /Del
mus var ligner kontrol (Yderligere fil 1: Figur S8). Disse resultater viser, at tabet af Isl1 ikke påvirker innervation eller epitelial udvikling af pylorus.
Tab af Isl1 påvirker ikke proliferation eller apoptose af pylorus indre cirkulær muskel og ydre langsgående muskelceller
vil se, om Isl1 ekspression var relateret til celle spredning af pylorus, vi undersøgte co-lokalisering af Isl1 og den proliferative markør bromdeoxyuridin (BrdU) ved hjælp af immunofluorescens i Isl1
F /+ m
is. Vores resultater viste, at BrdU-positive celler var tæt på E11.5 og spredt over hele ICM og OLM regioner i E14.5 og E18.5 (Yderligere fil 1: Figur S9A). Hertil kommer, at andelen af ​​prolifererende ICM og OLM celler var ikke signifikant forskellig mellem Isl1
MCM /Del
Isl1
F /+ m
is på E18.5 ( Yderligere fil 1:. Figur S9b)
at vurdere en potentiel indvirkning på apoptose, vi undersøgte kløvet caspase 3 udtryk ved E18.5, og vores immunofluorescens resultaterne viste der var ingen Caspase 3-positive celler i pylorus ICM eller OLM lag af Isl1
MCM /Del
Isl1
F /+ m
is (Yderligere fil 1: Figur S10). Disse data indikerer, at Isl1 ablation ikke påvirker proliferation eller apoptose af pylorus ICM og OLM celler.
Tab af Isl1 resultater i nedsat udtryk for GATA3
, Gremlin
, og Nkx2.5
da en række faktorer, herunder Bapx1
[18], Barx1
[35], GATA3
[19, 36], Gremlin
[5], Nkx2.5
[2] og Six2
[9], er blevet rapporteret at være involveret i regulering af pylorus udvikling, vi undersøgt virkningerne af tab af Isl1 på ekspressionen af ​​disse gener på E14.5 og E18.5. RT-qPCR Resultaterne viste, at tab af Isl1
påvirkede ikke udtryk for Bapx1
eller Barx1 dele på enten E14.5 eller E18.5 (figur 7A, B). Ved E18.5, α-SMA
Six2
mRNA niveauer var signifikant lavere i Isl1
MCM /Del
mus i forhold til kontroller (Figur 7B). På både E14.5 og E18.5, Nkx2.5
, GATA3
, og Gremlin
mRNA-niveauer i maven af ​​Isl1
MCM /Del
mus var lavere end kontroller (figur 7A, B). GATA3
mRNA niveauer var ca. 70% faldt ved begge undersøgte faser (figur 7A, B). Baseret på disse resultater, undersøgte vi Isl1
, GATA3
, Gremlin
, og Nkx2.5
udtryk i Isl1
MCM /F
mutant og Isl1
F /+ s
tomachs hjælp WISH. Resultaterne viste, at ekspression af hvert af disse gener hovedsagelig var begrænset til pyloric region, som forventet; GATA3
ekspression blev mere reduceret i mutante maver; og Gremlin
Nkx2.5
kun havde subtile ændringer (figur 7E, F). Isl1
og GATA3
udtryk var den mest stærkt påvirket (Figur 7C, D). Disse resultater var i overensstemmelse med RT-qPCR data tyder på, at Isl1 regulerer ekspressionen af ​​GATA3
, Gremlin
, og Nkx2.5
. Figur 7 Afvigende genekspression i hindstomach i Isl1 MCM /Del mutanter. (A) RT-qPCR-analyse af mRNA-niveauer af hindstomach beriget transkriptionsfaktorer på E14.5 indikerer betydelig reduktion af α-SMA
, Six2 Nkx2.5
, GATA3
, og Gremlin
mRNA i Isl1
MCM /Del
mutant maver (n
= 4). Alle resultater blev normaliseret til niveauer på GAPDH
mRNA. (B) RT-qPCR-analyse af mRNA-niveauer af hindstomach beriget transkriptionsfaktorer ved E18.5 indikerer en signifikant reduktion af Nkx2.5
, GATA3
, og Gremlin
mRNA i Isl1
MCM /Del
mutant maver (n
= 4). Alle resultater blev normaliseret til niveauer på GAPDH
mRNA. Data er gennemsnit ± SEM (n = 6 fotos mus pr gruppe). * P
< 0,05 versus Isl1
F /+
; ** P
< 0,01 versus Isl1
F /+ Hotel (Students t
-test). (CF) WISH mRNA analyse bekræftede tab af Isl1
, GATA3
, Gremlin
, og Nkx2.5
mRNA-ekspression på E14.5 i Isl1
MCM /Del
mutant maver. Isl1
og GATA3
mRNA blev alvorligt nedreguleret i Isl1
MCM /Del
mus, mens Gremlin
og Nkx2.5
udtryk lidt blev reduceret. Pile peger på pylorus lukkemuskel.
Isl1 henvender GATA3
og aktiverer sin transskription
GATA3
selektivt udtrykkes i pylorus i udviklingslandene mus embryo [19, 20]. Ekspression af både Isl1
og GATA3
mRNA blev observeret i pylorus ved E14.5, men om GATA3 og Isl1 udtrykkes i de samme celler er ikke blevet undersøgt. Derfor undersøgte vi udtryk for Isl1 og GATA3 ved immunfluorescens analyser. Resultaterne viste, at Isl1 og GATA3 proteiner co-udtrykt inden for de samme celler i pylorus på E14.5 og E18.5 i Isl1
F /+ c
ontrol maver (figur 8). Derudover området udtrykker GATA3 var signifikant mindre i Isl1
MCM /Del
mutant pylorus glat lag muskler på E14.5 (figur 8A) og det blev tabt ved E18.5 i pylorus OLM lag (figur 8B). Således blev Isl1
nødvendig for GATA3
udtryk i dorsale pyloric OLM lag. For at undersøge om Isl1 regulerer pylorus udvikling ved direkte at regulere GATA3
, vi udførte bioinformatik analyse af GATA3 genomiske locus. Musen GATA3
gen indeholder flere formodede Isl1 respons elementer (ATTA /TAAT) på -2.832 basepar (bp) til 1002 bp fra transskription initieringssteder [37]. Vi identificerede 10 områder, der indeholdt et formodet Isl1 bindingssted (figur 9A), og 10 par tilsvarende primere blev udformet til amplifikation disse regioner følgende chromatin immunoprecipitation (chip) forsøg med antistof mod Isl1. Immunpræcipiteret genomisk DNA opnåedes fra pylorus regioner af musefostre ved E14.5. Af de 10 formodede Isl1 bindende områder, to adskilte områder, i -2558 bp til -2303 bp (P1-regionen) og -1081 bp til -855 bp (P6-regionen), blev besat af Isl1 protein. Dette resultat blev bekræftet ved semi-kvantitativ PCR (figur 9B) og folden berigelse fremgangsmåden (figur 9C). Figur 8 Tab af Isl1 eliminerer den dorsale pyloric ydre langsgående muskel GATA3 ekspression. (A) Dobbelt immunfarvning for Isl1 og GATA3 i dorsale pylorus på E14.5. Regionen mesodermale celler (asterisk), der udtrykker GATA3 var mindre i Isl1
MCM /Del
pylorus end Isl1
Fl +
. (B) Dobbelt immunfarvning for Isl1 og GATA3 i dorsale pylorus på E18.5. Inducerbar Isl1 knockout effektivt elimineret Isl1 udtryk, med samtidig tab af GATA3 udtryk i dorsale Olm celler (asterisk). Gule stiplede linjer markerer epitelbasalmembranen og hvide stiplede linjer angiver ICM og OLM grænse. Hvid pilespids indikerer ikke-specifik farvning. Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

• En sjælden årsag til gastrointestinale phytobezoars: diospyros lotus
• Transskriptionsfaktoren FOXO4 er nedreguleret og hæmmer tumor spredning og metastaser i gastrisk kræft