fator de transcrição homeodomain LIM ISL1 dirige o desenvolvimento do piloro normais, visando fator de transcrição homeodomain Gata3

LIM ISL1 dirige o desenvolvimento do piloro normais, visando GATA3 da arte abstracta
Fundo
anormalidades no desenvolvimento do piloro ou em função contrátil da causa refluxo piloro de duodenal conteúdos no estômago e aumentar o risco de metaplasia gástrica e câncer. Anormalidades da região pilórica também estão ligados a defeitos congênitos, como a estenose relativamente comum neonatal hipertrófica do piloro e refluxo duodeno primário. Portanto, a compreensão do desenvolvimento do piloro é de grande relevância clínica. Aqui, nós investigamos o papel do fator LIM homeodomain transcrição ISL1 no desenvolvimento do piloro.
Resultados
Exame de expressão ISL1 no desenvolvimento do estômago do rato por imuno-histoquímica, toda montagem in situ
hibridação e PCR em tempo real quantitativa demonstraram ISL1 que é altamente expressa no desenvolvimento de estômago de rato, principalmente na camada de músculo liso do piloro. ISL1 expressão também foi examinado por imunof luorescência em estenose hipertrófica do piloro humano, onde a maioria das células do músculo liso foram encontrados para expressar ISL1. ISL1 função
no desenvolvimento embrionário estômago foi investigado utilizando um ISL1
modelo de tamoxifeno-inducible do rato knockout. deficiência ISL1
levou a quase completa ausência da camada muscular longitudinal externa do piloro no dia embrionário 18,5, o que é consistente com GATA3
fenótipo nulo mouse. imunoprecipitação da cromatina, ensaios de luciferase, e ensaios de mudança de mobilidade eletroforética revelou que ISL1 garante o desenvolvimento do piloro normais diretamente pela segmentação GATA3
.
Conclusões
Este estudo demonstra que a ISL1-GATA3
eixo regulador da transcrição é essencial para pilórica desenvolvimento normal. Estas descobertas são altamente clinicamente relevante e pode ajudar a compreender melhor as vias que conduzem à doença do piloro.
Palavras-chave
muscular α-suave agindo fundo GATA3 ISL1 Piloro
O intestino de vertebrados é uma estrutura notável que ingere e digere o alimento, absorve nutrientes, e remove os resíduos. O intestino tem origem a partir de uma estrutura tubular simples composto por três camadas germinais incluindo uma endoderme subjacente, uma mesoderme esplânenico circundante, e uma ectoderme [1-3]. Em embriões de camundongos, o intestino torna-se padronizada ao longo da ântero-posterior, dorsal-ventral, esquerda-direita, e os eixos radiais. O tubo digestivo consiste do intestino anterior, intestino médio, intestino grosso e ao longo do seu eixo ântero-posterior [4, 5]. Medida que o desenvolvimento progride, o intestino anterior dá origem ao esófago, estômago, fígado, pulmões, e pâncreas. O intestino médio forma o intestino delgado e intestino grosso desenvolve para o intestino grosso [1, 5-8].
O estômago é derivado do intestino anterior posterior. O estômago morfologicamente diferencia do intestino anterior do tubo em torno do dia embrionário 9,5 (E9.5) e a expansão do mesênquima pré-gástrica permite que o domínio do estômago para ser visível no início E10.5 [9]. As células mesenquimais do estômago diferenciar-se em quatro camadas concêntricas distintos, incluindo a lamina propria, muscular da mucosa, e do músculo liso circular e longitudinal em diferentes fases do desenvolvimento embrionário [10]. Ao E11.5, o estômago é distintamente alargada. O músculo liso do estômago diferencia em E13, com uma camada distinta de actina de músculo liso-α (α-SMA) -positivos que aparecem células e uma camada muscular circular, formando ao longo do estômago [11]. A camada de músculo liso engrossa na região esfíncter pilórico prospectivo restrito a cerca de E14.5 [2, 9]. Ao E18.5, o esfíncter pilórico começa a funcionar na prevenção do refluxo do conteúdo duodenal para o estômago [9].
Posterior ou uma porção do piloro do estômago é a junção entre anatómica do estômago e do duodeno. No terminal do piloro, as abas valvulares distintas do esfíncter pilórico pode ser visto [2]. Sob condições fisiológicas normais, o estômago depende da sua contracção peristáltica para moer e empurrou a comida parcialmente digerida, e o piloro baseia-se na sua esfíncter pilórico espessada para controlar o fluxo de alimentos para o intestino delgado. Anormalidades no desenvolvimento do piloro ou na função contráctil do piloro causar refluxo do conteúdo duodenal para dentro do estômago e aumentar o risco de cancro gástrico e metaplasia [12, 13]. Anormalidades do piloro estão relacionados com defeitos congênitos [14-16]. Portanto, muita atenção tem sido dada aos elementos reguladores e os caminhos do desenvolvimento do estômago, especialmente piloro e desenvolvimento esfíncter pilórico.
Dados anteriores em pinto sugeriu que a proteína morfogenética óssea (BMP) de sinalização regula a expressão mesenquimais de Nkx2.5
e Sox9
, que afecta o carácter do epitélio do piloro, mas não tem nenhum efeito sobre o músculo liso do piloro [5, 17], sugerindo que a sinalização mesenquimais por factores desconhecidos afecta o fenótipo epitelial pilórica. No rato, os mecanismos moleculares da formação pilórica são pouco compreendidas, com relativamente poucos dos factores necessários para o desenvolvimento do piloro normal tendo sido identificados. Aqueles que têm sido incluem Sox9
[17], SIX2
[9], Bapx1
[18], Nkx2.5
[3, 17], Gremlin
[9], e GATA3
[19, 20]. A ablação do factor de transcrição homeodom�io, SIX2
, expressa em estômago posterior, perturba o espessamento da camada de músculo liso do piloro e atenua a constrição do esfíncter do piloro. Além disso, a perda de SIX2
elimina Sox9
expressão, e reduz Nkx2.5
e Gremlin
expressão no piloro, embora esta expressão recupera mais tarde [9], sugerindo que SIX2
, Sox9
, Nkx2.5
e Gremlin
são necessários para o desenvolvimento do piloro. Além disso, Nkx2.5
, Sox9
e GATA3 Quais são co-expressos na camada do piloro músculo longitudinal exterior (OLM) dorsal que amadurece entre E14.5 e E16.5. Seguindo a exclusão de Nkx2.5
ou GATA3
, o dorsal OLM piloro é quase ausente e constrição do esfíncter do piloro é atenuada [20].
O homeodomain LIM fator de transcrição (LIM-HD) ISL1 era originalmente encontrado para funcionar como uma proteína de ligação potenciador do gene da insulina [21]. ISL1 é composto por dois domínios em tandem Lim e um homeodominio. O homeodom�io, com a sua estrutura de hélice-volta-hélice, liga-se a sequências de ADN reguladoras de genes-alvo, enquanto os domínios LIM estão envolvidos principalmente em interacções proteína-proteína que regulam a actividade do LIM-HD [22]. ISL1 desempenha um papel crítico na determinação de células, proliferação e diferenciação no sistema nervoso [23, 24], coração [25], e hipófise [26]. Além disso, a expressão ISL1 foi detectado no mesênquima gástrica [27, 28] e epitélio gastrointestinal em ratos adultos e embrionários ambos [29]. No entanto, o papel de ISL1 no desenvolvimento do estômago ainda está para ser explorado. No presente estudo, examinamos a expressão ISL1 no estômago. ISL1 foi altamente expressa no estômago posterior em estágios precoces do desenvolvimento e foi principalmente restringida às células do músculo liso do piloro. Para examinar a função ISL1
no desenvolvimento do estômago, utilizamos um modelo de camundongo knockout tamoxifeno induzível. Um modelo inducible foi necessária porque ISL1 - /-
mutantes morrem em aproximadamente E10.5 devido a defeitos na formação do coração. Nossos resultados mostram que ISL1 é vital para a formação da camada de OLM piloro durante a organogénese estômago.
Resultados
ISL1 é expressa no estômago embrionárias de rato
Examinamos ISL1
níveis de mRNA no estômago embrionárias de rato por real PCR em tempo quantitativa (RT-qPCR) e toda montagem de hibridização in situ
(desejo). ISL1
ARNm foi inicialmente detectada em E11.5 por RT-qPCR. ISL1
atingiu o maior nível em E13.5, seguido por um declínio acentuado na E14.5, e não tiveram mudanças significativas na vida adulta (arquivo adicionais 1: Figura S1A). Este resultado foi semelhante a um relatório anterior [29]. A localização de ISL1
expressão de mRNA foi investigado utilizando desejo. Foi realizada ISL1
DESEJO no estômago embrionária em E11.5, E13.5 e E14.5. No E11.5, ISL1
foi localizada para a metade posterior do estômago (arquivo adicionais 1: Figura S1b). No entanto, o sinal ISL1
desejo foi muito mais forte e condensado no piloro por E13.5 (Figura 1A). Como o desenvolvimento de estômago progrediu, o piloro continuaram a expressar ISL1
e expressão de ISL1
estendido para o esfíncter pilórico prospectivo em E14.5 (arquivo adicionais 1: Figura S1b). No entanto, o ISL1
sinal DESEJO enfraqueceu consideravelmente a partir E13.5 a E14.5. Estes ISL1
resultados DESEJO concordou com resultados ISL1
RT-qPCR. A Figura 1 ISL1 é expressa no desenvolvimento do estômago do rato. (A) Análise DESEJOS estômago embrionárias demonstrado que ISL1
expressão foi limitada ao piloro em E13.5 (seta). (B) coloração imuno-histoquímica para ISL1 no estômago. As secções de embriões foram dispostos em sequência rostral para caudal em E11.5 e E13.5, e expressão ISL1 foi localizada principalmente para o mesênquima posterior do estômago. Em E14.5 e E18.5, ISL1 foi altamente expressa em células de músculo liso do piloro, embora houvesse algumas células ISL1-positiva na lâmina própria (setas). imagens ampliadas em regiões enquadradas são mostrados abaixo imagens originais. D, duodeno; Liv, fígado; Pa, pâncreas; St, estômago. Barras de escala de imagens originais: 100 m; barras de escala de imagens ampliadas:. 50 mm
Nós então avaliada a expressão da proteína ISL1 por imuno-histoquímica. Os resultados demonstraram que ISL1 foi localizada principalmente para o estômago mesênquima posterior de E11.5 E13.5 para, em seguida, ISL1 foi expresso em células de músculo liso do piloro (Figura 1B e arquivo adicional 1: Figura S1C), e também foi detectável no lâmina própria (Figura 1B, pontas de seta). No estômago do rato adulto, apenas algumas células ISL1-positivos foram observados na camada de músculo liso. (Arquivo adicionais 1: Figura s1c)
células ISL1-positivos são co-expressa com actina de músculo α-suave no estômago embrionárias de rato
para ver se a expressão ISL1 foi relacionado para suavizar o desenvolvimento muscular do piloro, examinamos a expressão de ISL1 eo primeiros marcadores de músculo liso α-SMA utilizando imunofluorescência. Os resultados demonstraram que a proporção de células positivas que expressam ISL1-α-SMA gradualmente aumentada (Figura 2). Ao E11.5, não há células α-SMA positivos foram detectados, embora ISL1 foi altamente expressa no mesênquima posterior do estômago. Ao E14.5, um subconjunto de células ISL1-positivas, principalmente os do músculo circular interna (ICM) do piloro, foram α-SMA positivos. Ao E16.5, pilórica OLM já sofreu diferenciação [20]. Ao E18.5, a maioria das células ISL1-positivas no piloro foram α-SMA positivos. expressão ISL1 persistiu em ICM piloro maduro e OLM, e as células da lâmina própria também expressou ISL1 (arquivo adicionais 1: Figura S2). Além disso, a expressão ISL1 foi examinada em amostras humanas de estenose hipertrófica do piloro por imunofluorescência, e os resultados demonstraram que ISL1 também foi expresso em células de músculo liso humanas do piloro ficheiro adicional (1: Figura S3). Portanto, estes resultados sugerem que ISL1 podem participar na formação do esfíncter pilórico. Figura 2 imunocoloração Duplo para ISL1 e actina muscular α-suave no rato células musculares lisas do piloro dorsal. ISL1 e co-expressão α-SMA em células de músculo liso em E11.5, E14.5, E18.5 e. linhas pontilhadas amarelas marcar a membrana basal epitelial, linhas pontilhadas grossas brancas indicam ICM e OLM limite, e linhas pontilhadas brancas indicam OLM e limite do pâncreas. coloração vermelha é ISL1, coloração verde é a-SMA, e de contraste nuclear DAPI (DNA) é azul. α-SMA, actina de músculo liso-α; ICM, músculo circular interna; OLM, músculo longitudinal exterior; Pa, pâncreas; St, estômago. Barras de escala:. 50 mm
expressão ISL1 é efetivamente ablacionadas em ISL1
MCM /F
camundongos knockout -inducible
Para investigar os efeitos de ISL1
ablação no desenvolvimento do estômago, utilizamos ISL1
MCM /F
-inducible Cre (ISL1
MCM /Del
) ratos (Figura 3A) e ISL1
F /+ m
gelo eram utilizados como controlos [30, 31]. Os embriões foram genotipados por PCR em E18.5 (arquivo adicionais 1: Figura S4) e intacto ou mutante ISL1
mRNA foi distinguido pela PCR semi-quantitativo (Figura 3B). Figura 3 Eficiência da ISL1 ablação em estômagos de ISL1 MCM /Del estômagos de rato mutante em E18.5. sequências de (a) ADN que tamoxifeno induzível Cre recombinase excisado flanqueado por dois locais loxP
. (B) ISL1
níveis de RNA foram ablacionadas em ISL1
MCM /Del
estômagos mutantes como visto por PCR semi-quantitativa. ISL1
F /+ m
gelo mostrou um produto par 592 de base enquanto ISL1
MCM /Del
ratos gerado um produto par 303 base. (C) ISL1 foi significativamente regulada para baixo nos níveis de proteína em ISL1
MCM /Del
estômagos mutantes como mostrado por western blot. Expressão de embriões em E11.5 foi utilizado como controlo positivo. (D) a expressão da proteína ISL1 em ​​ISL1
F /+ uma
nd ISL1
MCM /Del
piloro embrionário. expressão ISL1 foi significativamente reduzida em ISL1
MCM /Del
estômagos embrionárias, como visto por imunofluorescência. Imagens em ISL1
F /+ uma
nd ISL1
MCM /Del
foram processados ​​no mesmo slide e fotografado com a mesma exposição. imagens ampliadas das áreas em caixa são mostrados no lado direito das imagens fundidas. setas amarelas mostram células representativas ISL1-positivo, e setas brancas mostram células representativas ISL1-negativo. linhas pontilhadas amarelos marcar a membrana basal epitelial. Barras de escala:. analisa 50 mm
Western blot mostrou que os níveis de proteína ISL1 no estômago embrionário de ISL1
MCM /Del
ratos foram significativamente menores do que aqueles em ISL1
F /+ m
gelo (Figura 3C). resultados de imunofluorescência demonstraram reduziu significativamente coloração ISL1 no piloro de ISL1
MCM /Del
ratos, em comparação com os controles (Figura 3D). Estes dados demonstram que ISL1
expressão era efetivamente regulados negativamente em ISL1
MCM /Del
estômagos mutantes.
Anormalidades piloro em ISL1
MCM /F
mutantes
Para investigar os efeitos de ISL1
ablação no desenvolvimento do estômago, comparou diferenças morfológicas e histológicas entre ISL1
MCM /Del Comprar e ISL1
F /+ s
tomachs em E18.5. No E18.5, líquido amarelo foi observada em ISL1
MCM /Del
estômagos, mas não em estômagos de ISL1
F /+ l
ittermates (Figura 4A, asterisco) . O exame histológico demonstrou que a camada de músculo liso dorsal do piloro foi muito mais fina no piloro de ISL1
MCM /Del
ratos em comparação com os controles (Figura 4B). Nós examinamos a expressão e distribuição de α-SMA em ambos os ISL1
MCM /Del
mutantes e ISL1
F /+ p
ylorus. resultados de imunofluorescência demonstraram que a deficiência ISL1 levou à quase completa ausência da camada OLM pilórico em E18.5, e as células restantes foram frouxamente organizada (Figura 5A, asteriscos). Além disso, a constrição do esfíncter pilórico foi atenuada em ISL1
MCM /Del
estômagos mutantes quando comparado com constrição no ISL1
F /+ s
tomachs (Figura 5B) . Além disso, analisou-se a expressão da proteína específica do músculo liso calponina-1 em E18.5, e imunofluorescência resultados demonstraram que a perda de ISL1 também resultou na quase ausência de expressão calponina-1 na camada OLM pilórica dorsal, semelhante a resultar com α- SMA (arquivo adicionais 1: Figura S5). Sox9 é expresso tanto em epitélio e mesênquima [9] e é necessária para o desenvolvimento de OLM e formação de constrição esfíncter pilórico [20]. Os nossos resultados mostraram que imunofluorescência Sox9 permaneceu em níveis normais no epitélio do estômago de ISL1
MCM /Del
em ratinhos E14.5 e E18.5 (Figura 6, pontas de seta), mas a área de músculo liso pilórica expressando Sox9 foi significativamente reduzida em ISL1
MCM /Del
mutantes em E14.5 (Figura 6A, asteriscos) e ausentes em E18.5 (Figura 6B, asteriscos). Assim, ISL1
foi necessária para a expressão Sox9
em células OLM pilóricas dorsais. Estes resultados indicam que ISL1 é crítico para a regulação do desenvolvimento de músculo liso de rato pilórica. Figura 4 morfológica e alterações histológicas no desenvolvimento de estômago de ISL1 MCM /Del mutantes. (A) Bruto e evidências microscópicas para defeitos no estômago em ISL1
MCM /Del
ratos. Whole montagem vistas em E18.5 em /+ uma
nd ISL1
MCM /Del
estômagos de rato ISL1
F. ISL1
MCM /Del
estômagos mutantes faltava um esfíncter pilórico funcionais (seta), permitindo assim o refluxo de fluido como observado em embriões mutantes. líquido amarelo é denotada por um asterisco. (B) de hematoxilina e eosina de ISL1
F /+ uma
nd ISL1
MCM /Del
piloro do mouse em E18.5. O dorsal do músculo liso do piloro (preto região boxed) foi destaque no ISL1
F /+ E
mbryos, mas era muito mais fino em ISL1
MCM /Del
embriões. O restante do piloro era histologicamente normal. linhas pontilhadas verdes marcar a membrana basal epitelial. imagens ampliadas em regiões enquadradas são mostrados abaixo fotos originais. Barras de escala de fotos originais: 200 m; barras de escala de imagens ampliadas: 50 um. H &. E, hematoxilina e eosina
Figura 5 Perda de ISL1 interrompe a formação do músculo longitudinal exterior dorsal do piloro. (A) Imunofluorescência de ISL1 e α-SMA na ISL1
F /+ uma
nd ISL1
MCM /Del
piloro embrionária em E18.5. Perda de ISL1 resultou na perda quase completa das células alfa-SMA positivos no OLM piloro dorsal (asteriscos). linhas pontilhadas amarelas marcar a membrana basal epitelial e linhas pontilhadas brancas indicam ICM e OLM limite. coloração vermelha é ISL1, coloração verde é a-SMA, e de contraste nuclear DAPI (DNA) é azul. Barras de escala: 50 mm. (B) α-SMA imunofluorescência de ISL1
F /+ uma
nd ISL1
MCM /Del
piloro embrionária em E18.5. Comparado com ISL1
F /+ E
mbryos, a constrição do esfíncter pilórica foi maior em ISL1
MCM /Del
animais. medições do esfíncter de constrição são mostrados. barras amarelas demarcam o piloro e destacar a acentuada diferença na largura entre /+ uma
nd ISL1
MCM /Del
amostras ISL1
F. Os dados são média ± SEM (n =
6 ratinhos por grupo), * P
< 0,05 (teste t de Student
-teste). Barras de escala: 50 mm. α-SMA, actina de músculo liso-α; ICM, músculo circular interna; OLM, muscular longitudinal exterior.
Figura 6 Perda de ISL1 elimina a expressão do piloro Sox9 muscular longitudinal exterior dorsal. (A) imunocoloração Duplo para ISL1 e Sox9 no piloro dorsal em E14.5. Na ausência de ISL1, o domínio de células mesodérmicas (asteriscos) expressando Sox9 foi menor. (B) imunocoloração Duplo para ISL1 e Sox9 no piloro dorsal em E18.5. Inducible knockout ISL1 eficazmente eliminado expressão ISL1, com concomitante perda de expressão Sox9 nas células dorsal OLM (asteriscos). expressão Sox9 era normal no epitélio do estômago em ambas as fases (setas). linhas pontilhadas amarelas marcar a membrana basal epitelial e linhas pontilhadas brancas ICM separada e OLM. coloração vermelha é ISL1, coloração verde é Sox9, e de contraste nuclear DAPI (DNA) é azul. Barras de escala: 50 mm. ICM, músculo circular interna; OLM, músculo longitudinal externa.
Expressão e distribuição do produto do gene da proteína 9,5 (PGP9.5), um marcador de sistema nervoso entérico [32], estava intacto em E18.5 em ISL1
MCM /Del
estômagos mutantes (arquivo adicionais 1: Figura S6). gene homeobox pancreático e duodenal 1 (Pdx1) é expressa em células epiteliais do segmento antral-piloro e o duodeno rostral [33]. Nossos resultados de imunofluorescência mostraram que a expressão Pdx1 foi semelhante em ISL1
MCM /Del
ratos, quando comparados com os controles em E18.5 (arquivo adicionais 1: Figura S7). Além disso, o estômago do rato e do duodeno limite epitelial foi estabelecida entre E14.5 e E16.5 [34], este período coincidente com o desenvolvimento da camada de OLM [20]. Foi testada a integridade da fronteira epitelial do piloro do estômago intestino-pequeno em E18.5 examinando a expressão de um marcador Cdx2 epitelial específica do intestino [19]. Nossos resultados imuno-histoquímica demonstrou que a posição da fronteira piloro epitelial em ISL1
MCM /Del
camundongos foi semelhante à dos controles (arquivo adicional 1: Figura S8). Estes resultados indicam que a perda de ISL1 não afecta inervação ou desenvolvimento epitelial do piloro.
Perda de ISL1 não afectar a proliferação ou a apoptose de músculo circular interna do piloro e células musculares longitudinais exteriores
Para ver se a expressão estava relacionado ISL1 a proliferação de células do piloro, examinamos co-localização de ISL1 eo bromodeoxiuridina proliferativa marcador (BrdU) usando imunofluorescência em ISL1
F /+ m
gelo. Nossos resultados mostraram que as células positivas para BrdU foram densas em E11.5 e dispersos pelas regiões ICM e OLM em E14.5 e E18.5 (arquivo adicionais 1: Figura S9A). Além disso, a proporção de proliferação de células ICM e OLM não foi significativamente diferente entre ISL1
MCM /Del Comprar e ISL1
F /+ m
gelo em E18.5 ( arquivo adicional. 1: Figura S9b)
Para avaliar um impacto potencial sobre a apoptose, examinamos caspase 3 expressão no E18.5, e nossos resultados de imunofluorescência mostrou que não havia caspase 3-positivos células ICM piloro ou a camada OLM de ISL1
MCM /Del Comprar e ISL1
F /+ m
gelo (arquivo adicionais 1: Figura S10). Estes dados indicam que ISL1 ablação não afeta a proliferação ou apoptose da ICM piloro e células OLM.
Perda de resultados ISL1 na diminuição da expressão do GATA3
, Gremlin
e Nkx2.5
desde um número de fatores, incluindo Bapx1
[18], Barx1
[35], GATA3
[19, 36], Gremlin
[5], Nkx2.5
[2] , e SIX2
[9], têm sido referida como estando envolvida na regulação do desenvolvimento do piloro, examinámos os efeitos da perda de ISL1 na expressão destes genes em E14.5 e E18.5. Os resultados de RT-qPCR mostraram que a perda de ISL1
não afectou a expressão de Bapx1
ou Barx1
em qualquer E14.5 E18.5 ou (Figura 7A, B). No E18.5, α-SMA Comprar e SIX2
níveis de mRNA foram significativamente menores no ISL1
MCM /Del
ratos, em comparação com os controles (Figura 7b). Em ambos os E14.5 e E18.5, Nkx2.5
, GATA3
e Gremlin
níveis de mRNA no estômago de ISL1
MCM /Del
ratos foram inferiores controlos (Figura 7A, B). GATA3
níveis de mRNA foram de aproximadamente 70% de diminuição em ambas as fases examinados (Figura 7A, B). Com base nestes resultados, nós investigamos ISL1
, GATA3
, Gremlin
, e expressão Nkx2.5
em ISL1
MCM /F
mutante e ISL1
F /+ s
tomachs usando desejo. Os resultados demonstraram que a expressão de cada um destes genes foi confinada principalmente à região pilórica, como esperado; GATA3
expressão foi mais reduzida nos estômagos mutantes; e Gremlin Comprar e Nkx2.5 única
teve mudanças sutis (Figura 7E, F). ISL1 Comprar e GATA3
expressão foram os mais fortemente afetada (Figura 7C, D). Estes resultados foram consistentes com os dados RT-qPCR e sugerem que ISL1 regula a expressão de GATA3
, Gremlin
e Nkx2.5
. Figura 7 expressão génica aberrante, em hindstomach em ISL1 MCM /Del mutantes. (A) Análise RT-qPCR dos níveis de mRNA de fatores de transcrição enriquecido com hindstomach em E14.5 indica redução significativa da α-SMA
, SIX2 Nkx2.5
, GATA3
e Gremlin
mRNA em ISL1
MCM /Del
estômagos mutantes (n
= 4). Todos os resultados foram normalizados para níveis de ARNm de GAPDH
. (B) Análise de RT-qPCR dos níveis de ARNm dos factores de transcrição enriquecido-hindstomach em E18.5 indica uma redução significativa de Nkx2.5
, GATA3
, e Gremlin
ARNm no ISL1
MCM /Del
estômagos mutantes (n
= 4). Todos os resultados foram normalizados para níveis de ARNm de GAPDH
. Os dados são média ± SEM (n = 6 ratinhos por grupo
). * P Art < 0,05 em relação ISL1
F /+
; ** P Art < 0,01 versus ISL1
F /+
(t de Student
-teste). (CF) Análise de mRNA DESEJO confirmou a perda de ISL1
, GATA3
, Gremlin
, e expressão Nkx2.5
mRNA em E14.5 na ISL1
MCM /Del
mutante estômagos. ISL1 Comprar e GATA3
mRNA foram severamente regulada em ISL1
MCM /Del
ratos, enquanto Gremlin Comprar e Nkx2.5
expressão foram ligeiramente reduzida. Setas apontam para o esfíncter pilórico.
ISL1 alvo GATA3
e ativa a sua transcrição
GATA3
é expresso selectivamente no piloro do embrião de rato em desenvolvimento [19, 20]. A expressão de ambos ISL1
e GATA3
ARNm foi observada no piloro em E14.5, mas se GATA3 e ISL1 são expressas nas mesmas células não tem sido explorado. Portanto, nós examinamos a expressão de ISL1 e GATA3 por análises de imunofluorescência. Os resultados demonstraram que as proteínas ISL1 e GATA3 foram co-expressos nas mesmas células do piloro em E14.5 e E18.5 em ISL1
F /+ C
ONTROLE estômagos (Figura 8). Além disso, a área de expressar GATA3 foi significativamente menor no ISL1
MCM /Del
camada lisa piloro mutante muscular em E14.5 (Figura 8A) e foi perdido no E18.5 na camada OLM piloro (Figura 8B). Assim, ISL1
foi necessária para a expressão do GATA3
na camada OLM piloro dorsal. Para investigar se ISL1 regula o desenvolvimento do piloro, regulando directamente GATA3
, foi realizada a análise bioinformática do locus genómico GATA3. O gene GATA3 rato
contém vários elementos de resposta ISL1 putativos (ATTA /Taat) a -2,832 pares de bases (pb) para 1002 bp dos locais de iniciação da transcrição [37]. Foram identificadas 10 áreas que continham um ISL1 putativo local de ligação (Figura 9A) e 10 pares de primers correspondentes foram concebidos para amplificar essas regiões seguintes imunoprecipitação da cromatina (ChIP) estudos utilizando anticorpo para ISL1. DNA genômico imunoprecipitado foi obtido a partir de regiões pilóricas de embriões de camundongos em E14.5. Das 10 áreas de ligação ISL1 putativos, duas regiões distintas, na -2558 pb para -2303 pb (região P1) e -1081 pb para -855 pb (região P6), foram ocupadas por proteínas ISL1. Este resultado foi confirmado por PCR semi-quantitativo (Figura 9B) e o método de enriquecimento de dobragem (Figura 9C). Figura 8 Perda de ISL1 elimina o músculo longitudinal exterior expressão pilórica GATA3 dorsal. (A) imunocoloração Duplo para ISL1 e GATA3 no piloro dorsal em E14.5. A região de células mesodermal (asteriscos) expressando GATA3 foi menor no ISL1
MCM /Del
piloro do que ISL1
Fl +
. (B) imunocoloração Duplo para ISL1 e GATA3 no piloro dorsal em E18.5. Inducible knockout ISL1 eficazmente eliminado expressão ISL1, com concomitante perda de expressão do GATA3 nas células dorsal OLM (asteriscos). linhas pontilhadas amarelas marcar a membrana basal epitelial e linhas pontilhadas brancas indicam o limite ICM e OLM. seta branca indica mancha não-específica. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

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