LIM homeodomain transkriptiotekijä Isl1 ohjaa normaali pyloric kehitystä suuntaamalla Gata3

LIM homeodomain transkriptiotekijä Isl1 ohjaa normaali pyloric kehitystä suuntaamalla GATA3
tiivistelmä
tausta
poikkeavuudet mahaportin kehitykseen tai supistuvien funktiona pylorus syy refluksi pohjukaissuolihaavojen sisältö vatsaan ja lisäävät mahalaukun metaplasiaa ja syöpä. Poikkeavuuksia mahanportin alueella liittyvät myös synnynnäisiä vikoja kuten suhteellisen yleinen vastasyntyneen hypertrofinen mahanportin ahtauma, ja ensisijainen duodenogastric refluksi. Siksi ymmärtäminen mahanportin kehittäminen on suuri kliininen merkitys. Täällä, tutkimme rooli LIM homeodomeenin transkriptiotekijä Isl1 sisään mahaportin kehittämiseen.
Tulokset
tutkiminen Isl1 ilmaisun kehittämisessä hiiren vatsassa immunohistokemiallisesti, koko mount in situ
hybridisaatio- ja reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR osoitti että Isl1 ilmentyy erittäin kehitettäessä hiiren vatsassa, pääasiassa sileän lihaksen kerros pylorus. Isl1 ilmentyminen tutkittiin myös immunofluoresenssilla ihmisen hypertrofinen mahaportin ahtauma, jossa suurin osa sileälihassolujen havaittiin ilmentävän Isl1. Isl1
toiminto alkion vatsassa kehitykseen tutkittiin käyttäen tamoksifeenia-indusoituva Isl1
tyrmäyksellä hiirimallissa. Isl1
puute johti lähes täydelliseen puuttumiseen mahanportin ulomman pitkittäisen lihaksen kerros alkion päivänä 18,5, mikä on sopusoinnussa GATA3
null hiiren fenotyyppi. Kromatiini immunosaostus Lusiferaasimäärityksiä ja elektroforeettisen liikkuvuuden muutos määritykset paljastivat, että Isl1 varmistetaan normaali pyloric kehitystä suoraan kohdentamalla GATA3
.
Johtopäätökset
Tämä tutkimus osoittaa, että Isl1-GATA3
transkription sääntely akseli on olennaista normaali mahanportin kehitystä. Nämä havainnot ovat erittäin kliinisesti merkittäviä, ja ne voivat auttaa ymmärtämään paremmin johtavia reittejä mahanportin tauti.
Avainsanat
α-sileän lihaksen aktiini GATA3 Isl1 pylorus Taustaa
selkärankainen suolistossa on merkittävä rakenne, joka syö ja sulattaa ruokaa, imee ravinteita ja poistaa kuona-aineita. Suolistossa peräisin yksinkertaisesta putkimainen rakenne, joka koostuu kolmesta alkio kerrosta mukaan lukien taustalla Endodermi, ympäröivän splanknista Mesodermi, ja ektodermi [1-3]. Hiiren alkioiden, suolen tulee kuviollinen pitkin etu-taka-, selkä-vatsa-, vasen-oikea, ja radial akselit. Suolistossa putki koostuu foregut, keskisuolen ja hindgut pitkin etu-taka-akseli [4, 5]. Kehityksen edetessä foregut aiheuttaa ruokatorven, mahalaukun, maksan, keuhkojen, ja haima. Keskisuolen muodostaa ohutsuolessa ja hindgut kehittyy paksusuoleen [1, 5-8].
Mahassa on peräisin posterior foregut. Vatsa morfologisesti erottaa päässä foregut putkea alkion päivä 9,5 (E9.5) ja laajentamista ennalta mahalaukun mesenkyymiin mahdollistaa toimialueen vatsan näkyisi alkuun at E10.5 [9]. Mesenkyymisolujen mahan erilaistuvat neljään eri samankeskistä kerrosta, kuten lamina propriaa musculariksesta limakalvoille, ja pyöreä ja pitkittäinen sileän lihaksen eri vaiheissa alkionkehityksen [10]. Vuoteen E11.5, vatsa on selvästi laajentunut. Vatsa sileän lihaksen erottaa klo E13, jossa on erillinen kerros α-sileän lihaksen aktiini (α-SMA) positiivisia soluja näkymisen ja pyöreä lihas, joka muodostaa koko vatsa [11]. Sileän lihaksen paksuuntuu on ahdas mahdollisille mahaportin sulkijalihaksen alueella noin E14.5 [2, 9]. Tällä E18.5, mahanportin sulkijalihaksen alkaa toimia estämään palautusjäähdytyslämpötilassa pohjukaissuolen sisällön vatsaan [9].
Taka tai mahanportin osa vatsa on anatominen välinen liitos mahassa ja pohjukaissuolessa. Päätepysäkillä mahaportissa, erillisten valvular läpät mahanportin sulkijalihaksen voidaan nähdä [2]. Normaaleissa fysiologisissa olosuhteissa, mahalaukun riippuu sen peristalttisen supistuminen jauhaa ja pisti osittain sulavaa ruokaa, ja pylorus vetoaa paksuuntunut mahaportin sulkijalihaksen ohjaamaan ruoan ohutsuoleen. Poikkeavuuksia mahaportin kehitykseen tai supistuvien toiminto pylorus aiheuttavat refluksi pohjukaissuolikasvainten sisältö vatsaan ja lisäävät mahalaukun metaplasiaa ja syöpä [12, 13]. Poikkeavuuksia pylorus liittyvät vaurioiden [14-16]. Siksi paljon huomiota on kiinnitetty säätö- elementtejä ja polkuja vatsa kehitystä erityisesti pylorus ja mahaportin sulkijalihaksen kehittämiseen.
Edelliset tiedot poikasen ehdotti, että luun morfogeneettinen proteiini (BMP) signalointi säätelee mesenkymaalisten ilmentymistä Nkx2.5
ja Sox9
, joka vaikuttaa luonne mahanportin epiteelin, mutta sillä ei ole vaikutusta mahanportin sileän lihaksen [5, 17], mikä viittaa siihen, että mesenkymaaliset signalointi tuntemattomia tekijöitä vaikuttaa mahanportin epiteelin fenotyyppi. Hiiressä, molekyylimekanismeihin mahaportin muodostumista vähän ymmärretty, suhteellisen harvat niistä tekijöistä tarvitaan normaaliin pyloric kehityksen ne on tunnistettu. Ne, jotka ovat olleet muun muassa Sox9
[17], Six2
[9], Bapx1
[18], Nkx2.5
[3, 17], Gremlin
[9], ja GATA3
[19, 20]. Ablaation homeodomeenin transkriptiotekijän, Six2
ilmaistuna taka vatsassa, häiritsee paksuuntuminen mahanportin sileän lihaksen kerros ja vaimentaa kurouma pylorus sulkijalihaksen. Lisäksi menetys Six2
eliminoi Sox9
ilmaisua ja vähentää Nkx2.5
ja Gremlin
ilmaisun pylorus, vaikka tämä ilmaus myöhemmin toipuu [9], mikä viittaa siihen, että Six2
, Sox9
, Nkx2.5
, ja Gremlin
tarvitaan mahanportin kehittämiseen. Lisäksi, Nkx2.5
, Sox9
, ja GATA3
ovat koekspressoidaan selän mahanportin ulomman pitkittäisen lihaksen (OLM) kerros, joka kypsyy välillä E14.5 ja E16.5. Sen jälkeen poistetaan Nkx2.5
tai GATA3
, selkäpuoli mahanportin OLM on lähes poissa ja kurouma pylorus sulkijalihaksen vaimennetaan [20].
LIM homeodomain (LIM-HD) transkriptiotekijä Isl1 alunperin havaittu toimia insuliinin geenin tehostaja sitova proteiini [21]. Isl1 kuuluu kaksi tandem LIM verkkotunnuksia ja homeodomeenin. Homeodomain, sen helix-turn-helix rakenteen, sitoutuu säätely-DNA-sekvenssit kohdegeenien, kun LIM verkkotunnukset muodostuvat lähinnä proteiini-proteiini vuorovaikutusten että säännellään toimintaa LIM-HD [22]. Isl1 pelaa kriittinen rooli solujen määrittämistä, lisääntymistä ja erilaistumista hermoston [23, 24], sydän [25], ja aivolisäkkeen [26]. Lisäksi, Isl1 ilmentyminen on havaittu mahalaukun mesenkyymissä [27, 28] ja maha-suolikanavan epiteelin sekä alkion ja aikuisen hiiren [29]. Kuitenkin rooli Isl1 vatsassa kehitys on vielä löytäjäänsä. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme Isl1 ilmentyminen mahassa. Isl1 oli hyvin ilmaistu taka vatsassa varhaisessa kehitysvaiheessa ja sen rajoittuu pääasiassa sileän lihaksen soluissa pylorus. Tutkia Isl1
toiminto vatsassa kehitystä, meillä hyödynsi tamoksifeenia-indusoituva tyrmäyksellä hiirimallissa. Indusoituvaa malli oli tarpeen, koska Isl1 - /-
mutanttien die noin E10.5 vuoksi viat sydämen muodostumiseen. Tuloksemme osoittavat, että Isl1 on elintärkeää muodostuminen mahanportin OLM kerroksen aikana vatsaan organogeneesin.
Tulokset
Isl1 ilmentyy alkion hiiren vatsassa
Tutkimme Isl1
mRNA alkion hiiren vatsan reaali kvantitatiivinen PCR (RT-qPCR) ja koko vuori in situ
-hybridisaatio (WISH). Isl1
mRNA alun perin havaittu E11.5 RT-qPCR. Isl1
saavutti korkeimman tason E13.5, jota seurasi jyrkkä at E14.5, ja ei ollut merkittäviä muutoksia aikuisikään (Additional tiedosto 1: Kuva S1a). Tämä tulos oli samankaltainen aiemman raportin [29]. Lokalisointi Isl1
mRNA: n ilmentymisen tutkittiin käyttämällä WISH. Suoritimme Isl1
WISH alkion mahassa E11.5, E13.5 ja E14.5. Tällä E11.5, Isl1
paikallistettiin taka puolet mahan (Additional tiedosto 1: Kuva S1B). Kuitenkin Isl1
WISH-signaali oli paljon voimakkaampi ja kondensoidaan pylorus mukaan E13.5 (kuvio 1A). Kuten vatsa kehitys eteni, pylorus jatkoi ilmaista Isl1
ja ilmaus Isl1
laajennetaan mahdolliselle mahaportin sulkijalihaksen at E14.5 (Additional tiedosto 1: Kuva S1B). Kuitenkin Isl1
WISH signaali heikkeni huomattavasti E13.5 on E14.5. Nämä Isl1
WISH tuloksia yhtyi Isl1
RT-qPCR tuloksia. Kuvio 1 Isl1 ilmentyy kehittyvissä hiiren mahaan. (A) Alkion mahan WISH analyysi osoitti, että Isl1
ilmentyminen rajoittui pylorus at E13.5 (nuoli). (B) immunohistokemiallinen värjäys Isl1 vatsassa. Palasia alkioiden järjestetty kielihaarakkeen ja caudal sekvenssin E11.5 ja E13.5 ja Isl1 ilmentymistä pääasiassa lokalisoitu mesenchyme takaosan vatsaan. Tällä E14.5 ja E18.5, Isl1 oli hyvin ilmaistu sileän lihaksen soluissa pylorus, vaikkakin eräät Isl1-positiivisten solujen lamina propriassa (nuolenpäät). Laajentunut kuvat boxed alueilla esitetään alla alkuperäisiä kuvia. D, pohjukaissuoli; Liv, maksa; Pa, haima; St, vatsa. Mittaviivat alkuperäisten kuvien: 100 pm; asteikko baareissa laajentuneessa kuvia: 50 pm.
Sitten arvioitiin Isl1 proteiinin ilmentymistä immunohistokemiallisesti. Tulokset osoittivat, että Isl1 pääasiassa lokalisoitu taka vatsan mesenchyme välillä E11.5 ja E13.5, sitten Isl1 ilmennettiin sileän lihaksen soluissa pylorus (kuvio 1 B ja Muita tiedosto 1: Kuva S1c), ja se oli myös havaittavissa lamina propria (kuvio 1 B, nuolenpäät). Aikuisilla hiiri mahaan, vain muutama Isl1-positiivisia soluja havaittiin sileän lihaksen kerros (Additional tiedosto 1: Kuva S1c).
Isl1-positiivisia soluja koekspressoitu α-sileän lihaksen aktiini alkion hiiren vatsassa
Voit tarkistaa Isl1 ilmentyminen liittyvät sileän lihaksen kehittymistä pylorus selvitimme ilmaus Isl1 ja aikaisintaan sileän lihaksen merkki α-SMA käyttäen immunofluoresenssilla. Tulokset osoittivat, että osuus Isl1-positiivisia soluja, jotka ilmentävät α-SMA asteittain (kuvio 2). Tällä E11.5 ei α-SMA-positiiviset solut havaittiin, vaikka Isl1 oli hyvin ilmaistu mesenkyymissä posterior vatsaan. Tällä E14.5 osajoukko Isl1-positiivisten solujen, erityisesti ne, jotka ovat sisemmän ympyrän lihakseen (ICM) mahanportin, olivat α-SMA positiivinen. Vuoteen E16.5, mahanportin OLM on jo läpikäynyt eriyttäminen [20]. Tällä E18.5, suurin osa Isl1-positiivisten solujen pylorus olivat α-SMA positiivinen. Isl1 ilmaisu itsepintaisesti kypsä mahanportin ICM ja OLM ja lamina propria solut ilmaisivat myös Isl1 (Additional tiedosto 1: Kuva S2). Lisäksi Isl1 ilmentyminen tutkittiin ihmisen näytteitä hypertrofinen mahaportin ahtauma immunofluoresenssilla, ja tulokset osoittivat, että Isl1 myös ilmaistu ihmisen sileän lihaksen soluissa pylorus (Additional tiedosto 1: Kuva S3). Näin ollen, nämä tulokset viittaavat siihen, että Isl1 voi osallistua muodostumiseen mahanportin sulkijalihaksen. Kuva 2 Kahden immuunivärjäykseen Isl1 ja α-sileän lihaksen aktiini hiiren sileän lihaksen soluissa selkä pylorus. Isl1 ja α-SMA co-ekspressiota sileän lihaksen soluissa E11.5, E14.5 ja E18.5. Keltainen pisteviivat merkitsevät epiteelin tyvikalvon, valkoinen paksu pisteviivat merkitsevät ICM ja OLM rajan, ja valkoinen pisteviivat merkitsevät OLM ja haiman rajan. Red värjäytyminen on Isl1, vihreä värjäys on a-SMA, ja DAPI ydinvoiman counterstaining (DNA) on sininen. α-SMA, α-sileän lihaksen aktiini; ICM, sisempi pyöreä lihas; OLM, ulompi pitkittäinen lihas; Pa, haima; St, vatsa. Mittaviivat: 50 pm.
Isl1 ilmaisua tehokkaasti ablatoitu vuonna Isl1
MCM /F
indusoitavissa hiirten
Tutkitaan vaikutuksia Isl1
ablaation vatsan kehitystä, käytimme Isl1
MCM /F
indusoitavissa Cre (Isl1
MCM /Del
) hiiriä (kuvio 3A) ja Isl1
F /+ m
jäätä oli käytettiin verrokkeina [30, 31]. Alkiot genotyypattiin PCR klo E18.5 (Additional tiedosto 1: Kuva S4) ja ehjä tai mutantti Isl1
mRNA erottaa puolikvantitatiivinen PCR (kuvio 3B). Kuvio 3 tehokkuus Isl1 ablaatio vatsat Isl1 MCM /Del mutanttihiirimallien vatsat klo E18.5. (A) tamoksifeeni indusoitavissa Cre rekombinaasin leikataan DNA-sekvenssit reunustaa kaksi loxP
sivustoja. (B) Isl1
RNA-tasot olivat ablatoitu vuonna Isl1
MCM /Del
mutantti mahat näkemää semikvantitatiivinen PCR. Isl1
F /+ m
jään osoitti 592 emäsparin tuote taas Isl1
MCM /Del
hiirille tuotti 303 emäsparin tuotteen. (C) Isl1 oli merkitsevästi alas-säädellä proteiinin tasot Isl1
MCM /Del
mutantti mahat osoittamalla tavalla western blot. Expression of alkioiden E11.5 käytettiin positiivisena kontrollina. (D) Isl1 proteiinin ilmentymistä Isl1
F /+ a
nd Isl1
MCM /Del
alkion pylorus. Isl1 ilmentyminen väheni merkittävästi Isl1
MCM /Del
alkion mahat, kuten nähdään immunofluoresenssilla. Kuvien Isl1
F /+ a
nd Isl1
MCM /Del
käsiteltiin samalla dia ja valokuvattiin samalla altistumista. Laajentunut kuvia boxed alueet näkyvät oikealla puolella sulautuneen kuvia. Keltainen arrowheads näyttää edustavan Isl1-positiivisten solujen, ja valkoinen nuolenpää näyttää edustavan Isl1-negatiivisia soluja. Keltainen pisteviivat merkitsevät epiteelin tyvikalvon. Mittaviivat: 50 pm.
Western blot-analyysit osoittivat, että Isl1 proteiini tasot alkion vatsassa Isl1
MCM /Del
hiiret olivat merkittävästi alhaisemmat kuin Isl1
F /+ m
jäätä (kuvio 3C). Immunofluoresenssikoe tulokset osoittivat merkitsevästi pienempiä Isl1 värjäystä pylorus of Isl1
MCM /Del
hiirissä verrattuna kontrolleihin (Kuva 3D). Nämä tiedot osoittavat, että Isl1
ilmentyminen oli tehokkaasti säädellä vähentävästi Isl1
MCM /Del
mutantti vatsat.
Mahaportin poikkeavuuksia Isl1
MCM /F
mutanttien
Tutkitaan vaikutuksia Isl1
ablaation vatsan kehitystä, vertasimme ja histologia erot Isl1
MCM /Del
ja Isl1
F /+ s
tomachs klo E18.5. Tällä E18.5, keltainen neste havaittiin Isl1
MCM /Del
mahoja muttei vatsat Isl1
F /+ l
ittermates (kuvio 4A, tähti) . Histologinen tutkimus osoitti, että selkä mahanportin sileän lihaksen kerros oli paljon ohuempi pylorus on Isl1
MCM /Del
hiirillä verrokkeihin nähden (kuva 4B). Tutkimme ilmaisua ja jakelu α-SMA molemmissa Isl1
MCM /Del
mutanttien ja Isl1
F /+ s
ylorus. Immunofluoresenssikoe Tulokset osoittivat, että Isl1 puute johti lähes täydellistä puuttumista mahanportin OLM kerroksen E18.5, ja loput solut löyhästi järjestäytynyt (kuvio 5A, tähdellä). Lisäksi kurouma mahaportin sulkijalihaksen oli heikennetty Isl1
MCM /Del
mutantti mahat verrattuna supistumista Isl1
F /+ s
tomachs (kuvio 5B) . Lisäksi olemme analysoineet ilmentyminen sileän lihaksen spesifisen proteiinin Calponin-1 E18.5 ja immunofluoresenssilla tulokset osoittivat, että menetys Isl1 johti myös kohteen puuttuessa Calponin-1 ilmentymisen selän mahanportin OLM kerros, joka on samanlainen tulos, jossa α- SMA (Additional tiedosto 1: Kuva S5). Sox9 ilmentyy sekä epiteelin ja mesenchyme [9], jota tarvitaan kehitystä OLM ja muodostumisen mahaportin sulkijalihaksen ahdistus [20]. Meidän immunofluoresenssilla tulokset osoittivat, että Sox9 pysyivät normaalilla tasolla vatsassa epiteelin Isl1
MCM /Del
hiiriä E14.5 ja E18.5 (kuvio 6, nuolenpäät), mutta alue on mahanportin sileän lihaksen ilmennetään Sox9 väheni merkittävästi Isl1
MCM /Del
mutanttien E14.5 (kuvio 6A, tähdellä) ja poissaolevaksi E18.5 (kuvio 6B, tähdellä). Näin ollen, Isl1
vaadittiin Sox9
ilmentymisen selkä mahaportin OLM soluja. Nämä tulokset osoittavat, että Isl1 on kriittinen säädellään kehityksen hiiren mahaportin sileän lihaksen. Kuva 4 ja histologia muutokset kehittyvissä vatsassa Isl1 MCM /Del mutantteja. (A) Gross ja mikroskooppiset todisteita vatsaan vikojen Isl1
MCM /Del
hiirillä. Koko mount näkymistä E18.5 vuonna Isl1
F /+ a
nd Isl1
MCM /Del
hiiri vatsat. Isl1
MCM /Del
mutantti vatsat puuttui toiminnallinen mahaportin sulkijalihaksen (nuolenkärki), jolloin refluksi nestettä kuin havaittu mutantti alkioita. Keltainen neste merkitään tähdellä. (B) hematoksyliinillä ja eosiinivärjäykset Isl1
F /+ a
nd Isl1
MCM /Del
hiiri pylorus klo E18.5. Dorsaalinen mahanportin sileän lihaksen (musta boxed alue) oli näkyvästi Isl1
F /+ e
mbryos, mutta oli paljon ohuempi Isl1
MCM /Del
alkioita. Loput pylorus oli histologisesti normaalit. Green pisteviivat merkitsevät epiteelin tyvikalvon. Laajentunut kuvat boxed alueilla esitetään alla alkuperäisen kuvia. Mittaviivat alkuperäisen kuvia: 200 pm; asteikko baareissa laajentuneessa kuvia: 50 pm. H &E, hematoksyliinillä ja eosiinilla.
Kuvio 5 menettäminen Isl1 häiritsee muodostumisen selkä mahaportin ulomman pitkittäisen lihaksen. (A) Immunofluoresenssi on Isl1 ja α-SMA Isl1
F /+ a
nd Isl1
MCM /Del
alkion pylorus klo E18.5. Menetys Isl1 johti lähes täydellinen menetys α-SMA-positiivisten solujen selkä mahaportin OLM (tähdellä). Keltainen pisteviivat merkitsevät epiteelin tyvikalvon ja valkoinen pisteviivat merkitsevät ICM ja OLM rajan. Red värjäytyminen on Isl1, vihreä värjäys on a-SMA, ja DAPI ydinvoiman counterstaining (DNA) on sininen. Mittaviivat: 50 pm. (B) α-SMA immunofluoresenssi Isl1
F /+ a
nd Isl1
MCM /Del
alkion pylorus klo E18.5. Verrattuna Isl1
F /+ e
mbryos, mahanportin sulkijalihaksen supistumista oli laajempi Isl1
MCM /Del
eläimiä. Sulkijalihaksen supistelu mittaukset näytetään. Keltainen baareja rajattava mahanportin ja korosta merkitty leveyden erotuksesta Isl1
F /+ a
nd Isl1
MCM /Del
näytteitä. Tiedot ovat keskiarvo ± SEM (n
= 6 hiirtä ryhmää kohti), * P
< 0,05 (Studentin t
-testi). Mittaviivat: 50 pm. α-SMA, α-sileän lihaksen aktiini; ICM, sisempi pyöreä lihas; OLM, ulompi pitkittäinen lihas.
Kuvio 6 menetys Isl1 poistaa selän mahanportin ulomman pitkittäisen lihaksen Sox9 ilmaisua. (A) Kahden immuunivärjäykseen Isl1 ja Sox9 selkäpuoli pylorus osoitteessa E14.5. Puuttuessa Isl1, verkkotunnus mesodermal soluja (tähdellä) ilmennetään Sox9 oli pienempi. (B) Double immuunivärjäykseen Isl1 ja Sox9 selkäpuoli pylorus osoitteessa E18.5. Inducible Isl1 tyrmäys poistaa tehokkaasti Isl1 ilme, samanaikaisen menetyksen Sox9 ilmaisun selkäpuoli OLM solut (tähdellä). Sox9 ilmentyminen oli normaalia mahassa epiteelin molemmissa vaiheissa (nuolenpäät). Keltainen pisteviivat merkitsevät epiteelin tyvikalvon ja valkoiset katkoviivat erillinen ICM ja OLM. Red värjäytyminen on Isl1, vihreä värjäys on Sox9, ja DAPI ydinvoiman counterstaining (DNA) on sininen. Mittaviivat: 50 pm. ICM, sisempi pyöreä lihas; OLM, ulompi pitkittäinen lihas.
Expression ja jakelu proteiinin geenituotteen 9,5 (PGP9.5), enteerinen hermosto merkki [32], oli ehjä E18.5 vuonna Isl1
MCM /Del
mutantti vatsat (Additional tiedosto 1: Kuva S6). Haiman ja pohjukaissuolen homeobox geeni 1 (Pdx1) ilmentyy epiteelisoluissa antral-mahanportin segmentti ja rostraalisen pohjukaissuoli [33]. Meidän immunofluoresenssilla tulokset osoittivat, että Pdx1 ilmentyminen oli samankaltainen Isl1
MCM /Del
hiirissä verrattuna valvonnan E18.5 (Additional tiedosto 1: Kuva S7). Lisäksi hiiren mahan ja pohjukaissuolen epiteelin rajan välille perustettiin E14.5 ja E16.5 [34], tämän ajan samaan aikaan kehittämiseen OLM kerroksen [20]. Testasimme eheyttä mahassa-ohutsuolen epiteelin pyloric rajan E18.5 tutkimalla ilmentäminen ohutsuolisiirrepotilailla erityinen epiteelin markkeri Cdx2 [19]. Meidän immunohistokemia tulokset osoittivat, että asema epiteelin mahaportin rajan Isl1
MCM /Del
hiirillä oli samanlainen kuin valvonnan (Additional tiedosto 1: Kuva S8). Nämä tulokset osoittavat, että menetys Isl1 ei vaikuta hermotuksen tai epiteelin kehittymistä pylorus.
Menetys Isl1 ei vaikuta leviämiseen tai apoptoosia mahaportin sisempi pyöreä lihaksen ja ulompi pitkittäinen lihassolujen
Voit tarkistaa Isl1 ilme oli liittyvän soluun leviämisen pylorus, tutkimme kolokalisaation Isl1 ja proliferatiivinen merkki bromideoksiuridiinia (BrdU) käyttäen immunofluoresenssilla Isl1
F /+ m
jäätä. Tuloksemme osoittivat, että BrdU-positiiviset solut olivat tiheä klo E11.5 ja hajallaan ICM ja OLM alueita E14.5 ja E18.5 (Additional tiedosto 1: Kuva S9A). Lisäksi osuus lisääntyvien ICM ja OLM soluja ei ollut merkitsevää eroa Isl1
MCM /Del
ja Isl1
F /+ m
jään E18.5 ( Muita tiedosto 1: Kuva S9B).
arvioimiseksi voivat vaikuttaa apoptoosiin tutkimme lohkaista kaspaasi 3 ilmentymistä E18.5, ja meidän immunofluoresenssilla tulokset osoittivat ei ollut kaspaasi 3-positiivisten solujen mahaportin ICM tai OLM kerros of Isl1
MCM /Del
ja Isl1
F /+ m
jäätä (Additional tiedosto 1: Kuva S10). Nämä tiedot osoittavat, että Isl1 ablaatio ei vaikuta leviämiseen tai apoptoosiin mahanportin ICM ja OLM soluja.
Menetys Isl1 johtaa vähentynyt ilmentyminen GATA3
, Gremlin
, ja Nkx2.5
koska määrä tekijöitä, kuten Bapx1
[18], Barx1
[35], GATA3
[19, 36], Gremlin
[5], Nkx2.5
[2] , ja Six2
[9], on raportoitu osallistuvan säätelyyn mahaportin kehitys, tutkimme vaikutuksia menetyksen Isl1 on näiden geenien ilmentymistä at E14.5 ja E18.5. RT-qPCR tulokset osoittivat, että menetys Isl1
ei vaikuttanut ekspressioon Bapx1
tai Barx1
joko E14.5 tai E18.5 (kuvio 7A, B). Tällä E18.5, α-SMA
ja Six2
mRNA-tasot olivat huomattavasti matalammat Isl1
MCM /Del
hiirissä verrattuna kontrolleihin (kuvio 7B). Sekä E14.5 ja E18.5, Nkx2.5
, GATA3
, ja Gremlin
mRNA-tasot vatsassa Isl1
MCM /Del
hiiret olivat pienempiä kuin kontrolleihin (kuvio 7A, B). GATA3
mRNA-tasot olivat noin 70% vähentynyt molemmissa vaiheissa tutkittiin (kuvio 7A, B). Näiden tulosten perusteella, tutkimme Isl1
, GATA3
, Gremlin
, ja Nkx2.5
ilmaisun Isl1
MCM /F
mutantti ja Isl1
F /+ s
tomachs avulla WISH. Tulokset osoittivat, että ilmentyminen kukin näistä geeneistä rajoittui lähinnä mahanportin alueella, kuten odotettua, GATA3
ilmentyminen lisää vähennetty mutantti mahat; ja Gremlin
ja Nkx2.5
oli vain pieniä muutoksia (Kuva 7E, F). Isl1
ja GATA3
ilmentyminen olivat vaikuttaa voimakkaasti (kuvio 7C, D). Nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​RT-qPCR tiedot ja viittaavat siihen, että Isl1 säätelee ilmentymistä GATA3
, Gremlin
, ja Nkx2.5
. Kuva 7 Poikkeava geeniekspressio hindstomach in Isl1 MCM /Del mutantteja. (A) RT-qPCR analyysi mRNA tasojen hindstomach rikastetun transkriptiotekijöiden at E14.5 osoittaa merkittävästi vähentää α-SMA
, Six2 Nkx2.5
, GATA3
, ja Gremlin
mRNA vuonna Isl1
MCM /Del
mutantti vatsat (n
= 4). Kaikki tulokset normalisoitiin tasoja GAPDH
mRNA. (B) RT-qPCR analyysi mRNA tasoilla hindstomach rikastetun transkription tekijöitä E18.5 osoittaa merkittävä väheneminen Nkx2.5
, GATA3
, ja Gremlin
mRNA Isl1
MCM /Del
mutantti vatsat (n
= 4). Kaikki tulokset normalisoitiin tasoja GAPDH
mRNA. Tiedot ovat keskiarvo ± SEM (n = 6
hiirtä per ryhmä). * P
< 0,05 versus Isl1
F /+
; ** P
< 0,01 versus Isl1
F /+
(Studentin t
-testi). (CF) WISH mRNA-analyysi vahvisti menetys Isl1
, GATA3
, Gremlin
, ja Nkx2.5
mRNA-ilmentymisen E14.5 että Isl1
MCM /Del
mutantti vatsat. Isl1
ja GATA3
mRNA vakavasti säädellä vähentävästi Isl1
MCM /Del
hiiriä, kun taas Gremlin
ja Nkx2.5
ilme oli hieman vähennetty. Nuolet mahaportin sulkijalihaksen.
Isl1 tavoitteet GATA3
ja aktivoi sen transkription
GATA3
ilmentyy selektiivisesti pylorus kehittyvien hiiren alkion [19, 20]. Expression sekä Isl1
ja GATA3
mRNA havaittiin pylorus osoitteessa E14.5, mutta siitä GATA3 ja Isl1 ilmentyvät samoissa soluissa ei ole tutkittu. Siksi tutkimme ilmaus Isl1 ja GATA3 immunofluoresenssilla analyysejä. Tulokset osoittivat, että Isl1 ja GATA3 proteiinit ilmennetään rinnakkain samassa solujen mahanportin on E14.5 ja E18.5 in Isl1
F /+ c
ontrol vatsat (kuvio 8). Lisäksi alueella ilmentävät GATA3 oli merkitsevästi pienempi Isl1
MCM /Del
mutantti mahanportin sileän lihaksen kerros E14.5 (kuvio 8A) ja se menetetty E18.5 mahanportin OLM kerros (kuvio 8B). Siten Isl1
vaadittiin GATA3
ilmentymistä selkäpuoli mahaportin OLM kerros. Sen tutkimiseksi, Isl1 säätelee pyloric kehitystä säänteleviä GATA3
, suoritimme bioinformatiikan analyysi GATA3 genomisen lokuksen. Hiiren GATA3
geeni sisältää useita oletetun Isl1 vaste-elementit (ATTA /TAAT) on -2832 emäsparia (bp) ja 1002 bp transkriptionaloituskohdat [37]. Olemme tunnistettu 10 alueilla, jotka sisälsivät oletetun Isl1 sitoutumiskohta (kuvio 9A), ja 10 paria vastaavat alukkeita suunniteltiin monistamaan näitä alueita seuraavat kromatiinin immunosaostuksella (ChIP) tutkimukset käyttäen vasta-aineen Isl1. Immunosaostettiin genominen DNA saatiin mahanportin alueet hiiren alkioiden E14.5. Niistä 10 otaksuttu Isl1 sitovia alueita, kaksi erillistä alueet, -2558 bp -2303 bp (P1 alue) ja -1081 bp -855 bp (P6 alue), hoitivat Isl1 proteiinia. Tämä tulos vahvistettiin puolikvantitatiivinen PCR (kuvio 9B) ja taitekohdan rikastusmenetelmällä (kuvio 9C). Kuva 8 menetys Isl1 eliminoi selkä mahanportin ulompi Pitkittäislihas GATA3 ilme. (A) Kahden immuunivärjäykseen Isl1 ja GATA3 selkäpuoli pylorus osoitteessa E14.5. Alueella mesodermal soluja (tähdellä) ilmennetään GATA3 oli pienempi Isl1
MCM /Del
pylorus kuin Isl1
Fl +
. (B) Double immuunivärjäykseen Isl1 ja GATA3 selkäpuoli pylorus osoitteessa E18.5. Inducible Isl1 tyrmäys poistaa tehokkaasti Isl1 ilme, samanaikaisen menetyksen GATA3 ilmaisun selkäpuoli OLM solut (tähdellä). Keltainen pisteviivat merkitsevät epiteelin tyvikalvon ja valkoinen pisteviivat merkitsevät ICM ja OLM rajan. Valkoinen nuolenkärki osoittaa epäspesifinen tahra. Kaikki kirjoittajat luettu ja hyväksytty lopullinen käsikirjoitus.

• Harvinainen syy ruuansulatuskanavan phytobezoars: Diospyros Lotus
• Transkriptiotekijän FOXO4 säätyy alas ja estää kasvaimen leviämisen ja etäpesäkkeiden mahasyövän