Induktion av kromosom instabilitet och magcancer genom att förändra uttrycksmönstret för mitotiska kontrollpunkts gener i möss som exponerats för arekanötter-nut

Induktion av kromosominstabilitet och magcancer genom att förändra uttrycksmönstret av mitotiska checkpoint gener i möss som exponerats för Areca-nut Bild Sammanfattning
Bakgrund
Det finns starka indikationer på ett orsakssamband mellan Areca-nut konsumtion och cancer. I Meghalaya, Indien, är den mångfald av Areca-nut som används som rå och obearbetad formen vars kemiska sammansättning och farmakologiska effekter har rapporterats. Men vi vet lite om den ursprungliga banan involverad i Areca-nut associerad cancer eftersom det är svårt att bedöma dess effekter på genetiska förändringar utan inblandning av andra blandningsfaktorer. Därför var denna studie genomförts på möss för att kontrollera förmågan av rå arekanötter-mutter (RAN) för att inducera cancer och övervaka uttrycket av vissa gener som är involverade i cancer. Denna studie var inte avsedd att isolera några aktiva ingredienser från RAN och se sin talan.
Metoder
Tre grupper av möss (n = 25 i varje) togs och användes vid olika tidpunkter för olika experimentell analys . De andra tre grupperna av möss (n = 15 i varje) övervägdes för tumörinduktionsstudier. I varje uppsättning har två grupper administrerades RAN-extrakt ad libitum
i dricksvatten med eller utan kalk. Expressionen av vissa gener utvärderades genom konventionell RT-PCR och immunoblotting. Mössen fick hela RAN-extrakt med och utan kalk för att efterlikna konsumtion stil RAN.
Resultat
Histologisk beredning av magen vävnad avslöjade som körde inducerad magcancer. En gradvis ökning av frekvensen av brådmogen Anafasa och aneuploida celler observerades i benmärgsceller med en större ökning efter RAN + kalk administeration. Nivåer av p53, Bax, Sekurin Mössor och p65
i esofagus och magen celler förhöjda under början av RAN exponering medan de olika mitotiska checkpoint proteiner nedregleras. Apoptotisk celldöd påvisades i icke-cancer magen celler men inte i tumörceller som uppvisade överuttryck av Bax Mössor och frånvaro av PARP
.
Slutsats
aktuella studien föreslog (a) RAN inducerar magcancer, men närvaron av kalk främjas högre celltransformation och därigenom utvecklat cancer tidigare (b) störningar i komponenter i kromosomsegregation maskiner kan vara inblandade i den inledande processen för cancerframkallande och (c) betydelsen av tidig anafas som ett screeningmarkör för identifiering mitotiska checkpoint defekter under tidiga dagar.
Nyckelord
Kromosom instabilitet mitotiska checkpoint gener Sekurin
Apoptos bakgrund
esofagus skivepitelcancer (ESCC) och gastric cancer är de vanligaste cancerformerna i Indien, med den högsta förekomsten av ESCC vara i nordöstra delstater i Indien [1]. Det finns starka indikationer på ett orsakssamband mellan Areca-nut eller quid tuggvanor och dessa cancerformer. Flera studier i olika djurarter har visat positiv induktion av tumörer i både mål (kind-påse, matstrupe och magsäck) och icke-mål (lunga och lever) vävnad när arekolin (ARC) eller Areca-nut extrakt administrerades på olika sätt sådana oral intubation [2], blandas med kost [3], och kinden påse ansökan [4]. Därför verkar det som behövs metabolisk aktivering av alkaloider för den slutliga omvandlingen till den ultimata cancerframkallande, som starkt påverkas av fysiologiska förhållanden och förekomsten av vissa faktorer [5]. Rapporter har visat generering av reaktiva syreradikaler (ROS) från Areca-nut ingredienser under alkaliska betingelser [6, 7]. På grund av närvaron av kalk i betel-quid beredning, ändrar arekanötter-nut chewers 'saliv typiskt från neutralt till ett alkaliskt tillstånd som skulle kunna vara idealisk för att generera ROS [7]. Nair et al. [6] har också noterat att förutom ARC kan auto-oxidation av Areca-nut polyfenoler generera H 2O 2 och superoxidradikaler vid alkaliskt pH.
I delstaten Meghalaya, Indien, olika arekanötter mutter, lokalt kallas "kwai ', används som omogna och obearbetade råa form, som har högre halter av alkaloider, polyfenoler och tanniner, jämfört med den torkade form [8]. Den betel-quid används i Meghalaya innehåller rå arekanötter-mutter (RAN), lime pasta och liten del av betelblad utan tobak och andra beståndsdelar. Här människor svälja hela quid efter tugga istället för att spotta ut det som skulle kunna vara en viktig faktor för ESCC och magcancer. Nyligen 40% matstrupscancer prover som tagits från patienter Meghalaya staten har endast RAN-tugga vana visade deletion av mikrosatellitmarkörer D9S1748 och D9S1749, som ligger nära exon 1β av CDKN2A /ARF
genen vid 9p21. Promotor hypermethylation av CDKN2A
genen var betydligt högre i proverna med vana av RAN-tugga ensam än de som har för vana att använda både RAN och tobak [9]. Tills nu, vet vi inte mycket om den första vägen involverar i betel-nut associerad cancer i matstrupe och magsäck. Det är också svårt att bedöma effekterna av rent och främst Areca-nut-inducerad genetiska förändringar i människa utan inblandning av andra blandnings faktorer som tobak tugga eller rökning, alkoholkonsumtion, olika typer av icke-vegeterian livsmedel etc. Dessutom närvaron av lime gör en alkalisk tillstånd som inte är idealiskt för in vitro
cellodling och därför effekten av Areca-nut kan inte testas i cellodlingssystem. Mot bakgrund av dessa var den aktuella studien genomfördes på möss för att kontrollera förmågan hos RAN-extrakt med eller utan kalk, för att framkalla cancer och samtidigt utvärdera uttrycksmönstret av vissa gener som spelar en viktig roll i den inledande processen för cancer.
Den kemiska sammansättningen och farmakologiska effekter av Areca-nut har rapporterats och granskats av flera arbetstagare [10, 11]. Flera djurstudier har bekräftat att arekanötter-nötprodukter och betel specifika nitrosaminer, har förmågan att inducera neoplastiska förändringar hos försöksdjur [11]. Betydande bevis tyder på att arekanötter-mutter-alkaloider, främst arekolin (ARC) är de viktigaste faktorerna i BN-toxicitet [11]. Det visade sig att ARC kan framkalla DNA-skador i mus benmärgsceller [12] och sådana DNA-skador kan reduceras när ARC administreras med N-acetyl-L-cystein [13]. Därför är det värt att nämna att den aktuella studien inte var avsedd att isolera några aktiva ingredienser från RAN och se sin talan. Syftet med studien var att identifiera den ursprungliga vägen involverad i RAN associerad cancer hos möss och därför möss fick hela RAN-extrakt med och utan kalk för att efterlikna konsumtionen vana människa.
Flera gener, som p53 , p65, Sekurin Mössor och många andra, är kända för att vanligtvis överuttryckt vid cancer [14-16]. Dessutom är genetisk instabilitet även i samband med kromosom instabilitet (CIN) som leder till aneuploidi, ett kännetecken för cancer. Sådan aneuploidi kan underlätta tumorigenes genom förlusten av tumörsuppressorgenen funktion. Det har observerats att den partiella förlusten av mitotisk checkpoint kontroll leder till CIN i humana cancerceller [17, 18]. Därför, i denna studie, utvärderade vi uttrycksmönstret av p53, p65, Sekurin Mössor och flera mitotiska och spindel montering checkpoint gener vid olika tidpunkter. Vi observerade att RAN kan inducera magcancer genom att störa komponenterna i kromosomsegregation maskiner.
Metoder
Framställning av extrakt
Efter skalning de fibrösa rockar från obearbetat rått och omogna arekanötter-muttern (RAN), 100 g av RAN maldes och suspenderades i 125 ml destillerat vatten och blandas noggrant för att ge en slät smet för framställning av ett vattenextrakt av RAN. Efter 24 timmar tillsattes pastan omrördes i 3 h vid 37 ° C och det vattenhaltiga extraktet samlades upp genom centrifugering. Detta extraktionsförfarande upprepades ytterligare en gång genom tillsats av 125 ml vatten till återstoden. Båda extrakten slogs samman, vilket motsvarar 100 g RAN i 250 ml destillerat vatten, filtrerades och frystes vid - 80 ° C. Filtratet lyofiliserades i en Secfroid Lyolab BII lyofiliseringsanordning (Danmark). Den lyofiliserade massan hölls vid 4 ° C fram till användning. Extraktet innehöll 0,9 g /100 g vatten-extraherbart material.
Djur underhåll och behandling
Swiss albino-möss (25-30 g), 2-3 månader gamla hölls i laboratoriet i samhälls burar i ett rum med kontrollerad temperatur (20 ± 2 ° C) och kontrollerad belysning (12 timmar ljus, 12 h mörker). Vanlig mus diet (NMC Oil Mills Ltd, Pune, Indien) och vatten efter behag
användes i alla experiment. Experimenten utfördes i enlighet med institutionella riktlinjer och godkänts av våra "institutionella standarder för Animal Care och använda" styrelse.
I Set-1, tre grupper av möss (n = 25 i varje) togs som användes vid olika tidpunkter för olika experimentell analys. I Set-2, tre grupper av möss (n = 15 i varje) ansågs för tumörinduktionsstudier. Figur 1 ger en schematisk översikt över den övergripande experimentella protokoll som ansågs i denna studie. I varje uppsättning, var en grupp som behandlades med enkel dricksvatten anses vara obehandlat medan två grupper administrerades RAN extrahera ad libitum
i dricksvattnet med eller utan kalk (pH 9,8). Det uppskattades att varje mus konsumerade 1 mg extrakt per dag. En sådan oral administeration fortsattes under 60 dagar, varefter dosen ökades från 1 mg till 2 mg per dag till 120 dagar. Likaså var 60 dagar senare ökades dosen med 1 mg per dag konsumtion. Figur 1 Flödesschema av experimentell design för analys av rå Areca-nut medierad Karcinogenicitet i möss. Sprang- rå arekanötter-mutter, d- dagar.
Beredning av metafaser och poängsättning av kromosomavvikelser Hus Till förberedelse metaades benmärgsceller (BMC) samlas in från två möss per punkt från obehandlade, 15 och 30 dagar behandlade gruppen och tre möss per punkt för resten. I de behandlade grupperna var BMC samlas efter 15, 30, 60, 120 och 180 dagars behandling. BMC ades också in från två möss som har mage tumören. BMC uppsamlades efter 2 h kolchicin behandling (15 mg /kg). Djuren dödades genom cervikal dislokation. Lårbenen dissekerades ut och BMC spolades ut genom att injicera 2 ml 0,075 M KCl förvärmd till 37 ° C. Celler behandlades i hypoton lösning under 15 min och fixerades i ättiksyra och metanol (1: 3). Diabilder framställdes genom lågan torkningsmetoden, färgades i 5% Giemsa under 5 min och monterades i syntetiskt medium. Bilder från metafas sprider togs i Zeiss Axioskop mikroskop (Tyskland). Idéer för kromosom studien glasen kodas på måfå och minst 100 väl spridda metafaser plattor valdes för studie från varje mus. Vi utförde kromosomantal på metafas spridning. Kromosomavvikelser bedömdes som isochromatid raster och kromatidbrott. Se Utökade Experimentella förfaranden för detaljer i tilläggs fil 1. Kompletterande information
Immunoblotting
Celler från benmärg, matstrupe (genom att skrapa innerskikt) och magen (genom att skrapa inre delen) tvättades två gånger med PBS (fosfat buffrad saltlösning) och lyserades i radioimmuno-fällningsbuffert (0,1% SDS, 2 mM EDTA, 1% NP-40, 1% natriumdeoxikolat, 50 mM natriumfluorid och 100 U /ml aprotinin). Efter 30 minuters inkubering på is, fick cellysaten centrifugerades under 15 min vid 4 ° C och mängden protein bestämdes med användning av bicinkoninsyra proteinanalys. Lika stor mängd protein (40 ug) från varje prov laddades i varje brunn; lika laddning ytterligare verifieras genom immunoblotting med aktin antikroppar. Prover laddades i Novex Tris-glycin 4-20% gradientgeler och elektrofores utfördes i NuPAGE elektroforessystem (Invitrogen, USA). Proteiner överfördes till ett polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (Sigma) genom att följa standardprotokoll. Membranen sonderades med en 1: 1000-spädning av en monoklonal musantikropp mot p53
(PAb 240; ab-26; Abcam, USA), Bax
(6A7, ab5714; Abcam, USA), Sekurin
(DCS-280, ab3305, Abcam, USA), β-aktin
(AC-15, ab6276, Abcam, USA) och kanin polyklonal antikropp mot NF-κβ P65
(ab31481, BCAM, USA). Blottar tvättades 3 gånger under 10 min vardera i TBST-buffert pH 7,6 (1 M Tris Cl, 5 M NaCl och 0,05% Tween 20) och inkuberades med sekundär antikropp (alkaliskt-fosfatas-konjugerad anti-mus-IgG eller alkaliskt-fosfatas konjugerat antikanin IgG 1: 2000; Abcam, USA) under 1 h vid rumstemperatur. Efter omfattande tvättning tillsattes blotten nedsänkt i 4 ml substratlösning av BCIP /NBT (Bangalore Genei, Indien). Tillräcklig färgning erhölls inom 15 minuter. Varje immunoblotting utfördes i tre möss per punkt.
Histopatologisk utvärdering
magen vävnad samlades in från obehandlad kontroll och från två RAN + kalkbehandlade möss med tumör. I en annan uppsättning, var magen vävnad också samlats in från obehandlade liksom från de grupper som behandlades för 300 dagar med RAN-extrakt med och utan kalk. Tre möss valdes slumpmässigt från varje grupp. Dessa möss har inte någon indikation på tumör externt. Vävnadssnitt (5-7

• Expression av en LINE-1 endonukleas variant magcancer: dess association med kliniskt patologiska parametrar
• Magskyddande mekanismen för paederia foetida Linn. (Rubiaceae) - en populär ätbar växt som används av stam- gemenskap nordöstra India