Induktion af kromosom ustabilitet og mavekræft ved ændring ekspressionsmønsteret af mitotiske checkpoint gener i mus udsat for arecanødder-nut

Induktion af kromosom ustabilitet og mavekræft ved at ændre udtrykket mønster af mitotiske checkpoint gener i mus udsat for arecanødder-nut
Abstract
Baggrund
Der er stærke indikationer for en årsagssammenhæng mellem arecanødder-møtrik forbrug og kræft. I Meghalaya, Indien, er de mange forskellige areca-nut anvendt som rå og ubehandlet form, hvis kemiske sammensætning og farmakologiske virkninger er blevet rapporteret. Alligevel ved vi lidt på den første vej involveret i arecanødder-nut tilknyttet carcinogenese, da det er vanskeligt at vurdere dens virkninger på genetiske ændringer uden indblanding af andre kompoundering faktorer. Derfor blev denne undersøgelse foretaget på mus for at kontrollere evne rå arecanødder-møtrik (RAN) at fremkalde kræft og overvåge ekspressionen af ​​visse gener involveret i carcinogenese. Denne undersøgelse blev ikke beregnet til at isolere eventuelle aktive ingredienser fra RAN og se sin indsats.
Metoder
Tre grupper af mus (n = 25 i hver) blev udtaget og anvendt på forskellige tidspunkter for forskellige eksperimentel analyse . De andre tre grupper af mus (n = 15 i hver) blev anset for tumorinduktion studier. I hvert sæt blev to grupper administreret RAN-ekstrakt ad libitum
i drikkevand med eller uden kalk. Ekspressionen af ​​visse gener blev bedømt ved konventionel RT-PCR og immunblotting. Musene fik hele RAN-ekstrakt med og uden kalk for at efterligne den konsum stil af RAN. Search Results Salg histologisk fremstilling af mavevæv afsløret, at RAN induceret mavekræft. En gradvis stigning i hyppigheden af ​​tidligt udviklede anafase og aneuploide celler blev observeret i knoglemarvsceller med en større tilvækst efter RAN + kalk administeration. Niveauer af p53, Bax, Securin
og p65
i esophageal og mave celler blev forhøjet i løbet af tidlige dage af RAN eksponering, mens de forskellige mitotisk checkpoint proteiner blev nedreguleret. Apoptotisk celledød blev påvist i ikke-kræft maven celler, men ikke i tumorceller, som viste overekspression af Bax
og fravær af PARP
.
Konklusion
Present undersøgelse foreslået (a) RAN inducerer mavekræft, men tilstedeværelsen af ​​kalk forfremmet højere celle transformation og derved udviklet kræft tidligere, (b) forstyrrelser i komponenter af kromosom adskillelse maskiner kunne være involveret i den indledende proces med carcinogenicitet og (c) betydningen af ​​gammelklog anafase som screening markør til identifikation af mitotiske checkpoint defekter under tidlige dage.
Keywords
kromosom ustabilitet mitotiske checkpoint gener Securin
Apoptose Baggrund
esophageal pladecellekræft (ESCC) og mavens kræftformer er mest almindelige kræftformer i Indien, med den højeste forekomst af ESCC være i nordøstlige stater i Indien [1]. Der er stærke indikationer for en årsagssammenhæng mellem arecanødder-møtrik eller quid tygge vaner og disse kræftformer. Flere undersøgelser i forskellige dyrearter har vist positiv induktion af tumorer i både mål (kind-pose, spiserøret og maven) og ikke-target (lunge og lever) væv når arecolin (ARC) eller arecanødder-møtrik ekstrakt blev indgivet ved forskellige midler sådanne som oral intubation [2], blandet med kosten [3], og kind-pouch ansøgning [4]. Det synes derfor, at der er behov metabolisk aktivering af alkaloider ved den endelige omdannelse til de endelige carcinogener, som er stærkt påvirket af fysiologiske betingelser og tilstedeværelsen af ​​visse faktorer [5]. Rapporter har indikeret generation af reaktive ilt arter (ROS) fra arecanødder-møtrik ingredienser under alkaliske betingelser [6, 7]. På grund af tilstedeværelsen af ​​kalk i betel-quid præparat, arecanødder-møtrik tyggere 'spyt typisk skifter fra neutral til en alkalisk tilstand, som kunne være ideel til generering ROS [7]. Nair et al. [6] har også bemærket, at udover ARC, kunne auto-oxidation af arecanødder-møtrik polyfenoler generere H 2O 2 og superoxidradikaler ved basisk pH.
I staten af ​​Meghalaya, Indien, de mange forskellige arecanødder møtrik, lokalt kaldet 'kwai «, anvendes som umodne og uforarbejdede rå form, som har højere indhold af alkaloider, polyphenoler og tanniner i forhold til den tørrede form [8]. Den betel-quid brugt i Meghalaya indeholder rå arecanødder-møtrik (RAN), kalk pasta og lille del af betel-blade uden tobak og andre bestanddele. Her mennesker sluge hele quid efter tygning i stedet for at spytte det ud, som kunne være en vigtig faktor for ESCC og mavekræft. For nylig, 40% esophageal kræft prøver indsamlet fra patienter i Meghalaya stat, der kun RAN-tygge vane viste sletning af mikrosatellitmarkører D9S1748 og D9S1749, beliggende tæt til exon 1β af CDKN2A /ARF
gen ved 9p21. Promotor hypermethylering af CDKN2A
gen var signifikant højere i prøverne med den vane at RAN-tygge alene end dem, der har for vane at bruge både RAN og tobak [9]. Indtil nu, ved vi ikke meget på den første vej involverer i betel-nut associeret carcinogenese i spiserøret og maven. Det er også vanskeligt at vurdere virkningerne af rent og overvejende arecanødder-møtrik-induceret genetiske ændringer i menneskets uden indblanding fra andre tilskrivningsperioder faktorer som tobak tygge eller rygning, alkoholforbrug, forskellige typer af ikke-vegeterian fødevarer osv Desuden er tilstedeværelsen af kalk gør en alkalisk betingelse, som ikke er ideel til in vitro
cellekultur og derfor virkningen af ​​areca-møtrik kan ikke testes i cellekultursystemer. I betragtning af disse, blev den foreliggende undersøgelse i mus for at kontrollere evnen for RAN-ekstrakt med eller uden kalk, for at inducere cancer og samtidigt evaluere udtrykket mønster af visse gener, som spiller en vigtig rolle i den indledende proces med carcinogenese.
kemiske sammensætning og farmakologiske virkninger af arecanødder-møtrik er blevet rapporteret og revideret af flere arbejdstagere [10, 11]. Adskillige dyreforsøg har bekræftet, at arecanødder-møtrik produkter og betel specifikke nitrosaminer, har evnen til at inducere neoplastiske ændringer i forsøgsdyr [11]. Betydelig tyder på, at arecanødder-møtrik-alkaloider, overvejende arecolin (ARC) er de vigtigste faktorer i BN-toksicitet [11]. Det blev vist, at ARC kan inducere DNA-skader i muse knoglemarvsceller [12] og sådanne DNA skader kan reduceres, når ARC administreres sammen med N-acetyl-L-cystein [13]. Derfor er det værd at nævne, at den foreliggende undersøgelse ikke havde til formål at isolere eventuelle aktive ingredienser fra RAN og se sin indsats. Formålet med undersøgelsen var at bestemme den oprindelige pathway involveret i RAN associeret carcinogenese hos mus og derfor mus fik hele RAN-ekstrakt med og uden kalk for at efterligne forbruget vane menneske.
Adskillige gener, som p53 , p65, Securin
og mange andre, er kendt for at være normalt overudtrykt under carcinogenese [14-16]. Desuden er genetisk ustabilitet også forbundet med kromosom ustabilitet (CIN), som fører til aneuploidi, kendetegnende for kræft. Sådan aneuploidi kan lette tumorigenese gennem tabet af tumorsuppressorgen funktion. Det er blevet observeret, at den delvise tab af mitotisk checkpoint kontrol fører til CIN i humane cancerceller [17, 18]. Derfor, i den foreliggende undersøgelse, vi evaluerede udtrykket mønster af p53, p65, Securin
og adskillige mitotiske og spindel montage checkpoint gener på forskellige tidspunkter. Vi observerede, at RAN kan fremkalde mave kræft ved at forstyrre komponenterne i kromosom adskillelse maskiner.
Metoder
Udarbejdelse af ekstrakter
Efter beskydning de fibrøse frakker fra uforarbejdede rå og umodne arecanødder-møtrik (RAN), 100 g af RAN blev formalet og suspenderes i 125 ml destilleret vand og blandes grundigt til dannelse af en glat pasta til fremstilling af en vandig ekstrakt af RAN. Efter 24 timer blev pastaen omrørt i 3 timer ved 37 ° C, og den vandige ekstrakt blev opsamlet ved centrifugering. Denne ekstraktionsprocedure blev gentaget en gang mere ved tilsætning af 125 ml vand til remanensen. Begge ekstrakter blev samlet, svarende til 100 g RAN i 250 ml destilleret vand, filtreret og frosset ved - 80 ° C. Filtratet blev lyofiliseret i en Secfroid Lyolab BII frysetørrer (Danmark). Det frysetørrede masse blev holdt ved 4 ° C indtil anvendelse. Ekstrakten indeholdt 0,9 g /100 g vand-ekstraherbare materiale.
Dyr vedligeholdelse og behandling
schweiziske albino mus (25-30 g), 2-3 måneder gamle blev opretholdt i laboratoriet i lokalsamfundet bure i et rum med kontrolleret temperatur (20 ± 2 ° C) og kontrolleret belysning (12 timers lys; 12 h mørke). Standard mus kost (NMC Oil Mills Ltd., Pune, Indien) og vand ad libitum
blev anvendt i alle eksperimenter. Forsøgene blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer og godkendt af vores "Institutionelle standarder for Animal Care og Brug" Board. Salg In Set-1, tre grupper af mus (n = 25 i hver) blev taget som blev brugt på forskellige tidspunkter for forskellige eksperimentel analyse. I Set-2, tre grupper af mus (n = 15 i hver) blev anset for tumor induktion studier. Figur 1 giver en skematisk oversigt over den samlede eksperimentelle protokol, som blev behandlet i denne undersøgelse. I hvert sæt blev én gruppe behandlet med enkle drikkevand betragtes som ubehandlet hvorimod to grupper blev indgivet RAN udtrække ad libitum
i drikkevandet med eller uden kalk (pH 9,8). Det blev anslået, at hver mus forbruges 1 mg ekstrakt dagligt. En sådan oral administeration fortsatte i 60 dage, hvorefter dosis blev øget fra 1 mg til 2 mg pr dag indtil 120 dage. Ligeledes hver 60. dag senere dosen blev forøget med 1 mg dagligt forbrug. Figur 1 Blokdiagram over eksperimentelle design for analysen af ​​rå arecanødder-nut medieret Carcinogenese i mus. RAN- rå arecanødder-møtrik; D- dage.
Udarbejdelse af metafaser og scoring af kromosomafvigelser
For metafase forberedelse blev knoglemarvsceller (BMC) indsamlet fra to mus pr punkt fra ubehandlede, 15 og 30 dage behandlede gruppe og tre mus pr punkt for resten. I de behandlede grupper blev BMC opsamlet efter 15, 30, 60, 120 og 180 dages behandling. BMC blev også indsamlet fra de to mus med mave tumor. BMC blev opsamlet efter 2 timer colchicin behandling (15 mg /kg). Dyrene blev aflivet ved cervikal dislokation. De lårben blev dissekeret ud og BMC blev skyllet ud ved injektion af 2 ml 0,075 M KCI forvarmet til 37 ° C. Cellerne blev behandlet i hypotonisk opløsning i 15 min og fikseres i eddikesyre og methanol (1: 3). Objektglas blev fremstillet ved flammen tørringsmetode, farvet i 5% Giemsa i 5 min og monteret i syntetisk medium. Billeder af metafase spreads blev taget under Zeiss Axioskopmikroskop (Tyskland).
For kromosomal undersøgelse blev objektglassene kodet tilfældigt og mindst 100 godt spredt metafase plader blev udvalgt til undersøgelse fra hver mus. Vi udførte kromosom tæller på metafase spredning. Kromosomafvigelser blev scoret som isochromatid pauser og kromatid pauser. Se Udvidede Eksperimentelle Procedurer for detaljer i Yderligere fil 1:. Supplerende oplysninger
Immunoblotting
Celler fra knoglemarv, spiserør (ved at skrabe indre lag) og mave (ved at skrabe indre del) blev vasket to gange med PBS (fosfat saltvand) og blev lyseret i radioimmunpræcipitation puffer (0,1% SDS, 2 mM EDTA, 1% NP-40, 1% natriumdeoxycholat, 50 mM natriumfluorid og 100 U /ml aprotinin). Efter 30 minutters inkubation på is blev cellelysaterne centrifugeret i 15 minutter ved 4 ° C, og mængden af ​​protein blev bestemt under anvendelse af bicinchoninsyre proteinassay. Lige så stor mængde protein (40 ug) fra hver prøve blev påsat i hver brønd; lige belastning blev yderligere bekræftet ved immunoblotting med aktin antistoffer. Prøver blev lagt i Novex Tris-glycin 4-20% gradientgeler og elektroforese blev udført i NuPAGE elektroforesesystem (Invitrogen, USA). Proteiner blev overført til en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (Sigma) efter standardprotokol. Membranerne blev probet med en 1: 1000 fortynding af et monoklonalt muse-antistof mod p53
(PAb 240; ab-26; Abcam, USA), Bax
(6A7; ab5714; Abcam, USA), Securin
(DCS-280; ab3305; Abcam, USA), β-actin
(AC-15; ab6276; Abcam, USA) og kanin-polyklonalt antistof mod NF-κβ P65
(ab31481; BCAM, USA). Blots blev vasket 3 gange i 10 min hver i TBST-buffer pH 7,6 (1 M Tris Cl, 5 M NaCI og 0,05% Tween 20) og inkuberet med sekundært antistof (alkalisk phosphatase-konjugeret anti-muse-IgG eller alkaliske phosphatase-konjugeret antikanin IgG 1: 2000; Abcam, USA) i 1 time ved stuetemperatur. Efter grundig vask blev blottet nedsænket i 4 ml substrat opløsning af BCIP /NBT (Bangalore Genei, Indien). Tilstrækkelig farvning blev opnået inden for 15 min. Hver immunoblotting blev udført i tre mus pr-point.
Histopatologisk evaluering
mave væv blev indsamlet fra ubehandlet kontrol og fra to RAN + kalk behandlede mus med tumor. I andet sæt blev mave væv også indsamlet fra ubehandlet såvel som fra de grupper, der blev behandlet i 300 dage med RAN-ekstrakt med og uden kalk. Tre mus blev tilfældigt udvalgt fra hver gruppe. Disse mus havde ikke nogen indikation af tumor eksternt. Vævssnit (5-7 um) blev bearbejdet til histologisk sektionering som pr standardprotokol [19] og farvet med hematoxylin og eosin [20]. Snit blev derefter observeret under et lysmikroskop og fotograferet (Carl Zeiss, Tyskland).
RNA-ekstraktion og konventionel RT-PCR-analyse
Celler blev opsamlet ved at skrabe det indre lag af spiserøret og maven fra ubehandlet kontrol løb og løb + kalk behandlet mus (tre mus pr point). Knoglemarvsceller blev opsamlet fra lårbenet knogle af musen. Totalt RNA blev isoleret med Trizol og derefter oprenset under anvendelse af RNeasy Mini Kit (Qiagen) ifølge producentens protokol. Revers transskription blev udført med 1 ug totalt RNA fra hver prøve ved anvendelse Quantiscript revers transkriptase, Quantiscript RT-puffer og RT Primer-blanding af QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland) ifølge producentens protokol. Forstærkning af cDNA blev udført i 20 pi opløsning indeholdende 2 pi cDNA, 10 pmol primerpar til aurora A, aurora B, MAD2, Bub1 og GAPDH (for primersekvenser, se Yderligere fil 1: Supplerende oplysninger) henholdsvis og 10 pi RT qPCR Master mix (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland). PCR bestod af indledende denaturering ved 94 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 30 reaktionscyklusser (30 sekunder ved 94 ° C, 30 sekunder ved 60 ° C og 30 sekunder ved 72 ° C) og en endelig cyklus ved 72 ° C i 10 min. GAPDH blev anvendt som intern kontrol. Alle PCR-produkter blev elektroforetisk separeret på ethidiumbromid-farvet agarosegel og visualiseret med UV-lys.
Flowcytometrisk analyse af celler
knoglemarvsceller hos mus, og cellerne opsamlet ved at skrabe det indre lag af spiserøret og maven af ​​både ubehandlet og behandlet i 260 dage med RAN med eller uden kalk blev fikseret med 70% ethanol. Mave-tumorceller blev også opsamlet og fikseret. De fikserede celler blev vasket i PBS og resuspenderet i 500 pi propidiumiodid (50 ug /ml propidiumiodid, 0,2 mg /ml RNase) i 1 time ved stuetemperatur i mørke. 10.000 celler blev erhvervet for hver prøve og analyseret med en FACS Calibur (Becton-Dickinson). CELLQuest Pro software blev anvendt til at kvantificere cellecyklus rum til at estimere procentdelen af ​​celler fordelt i de forskellige cellecyklusfaser.
Annexin V mærkning undersøgelser
apoptotisk celledød blev vurderet ved anvendelse annexinV-fluoresceinisothiocyanat metode i maven tumorceller og også i det indre lag af celler i maven og spiserøret af ubehandlet og RAN med og uden kalk behandlet mus efter 260 dages kontinuerlig administeration. Cellepelleten blev resuspenderet i PBS. Celler blev farvet med propidiumiodid og Annexin-V-FITC hjælp BD PharmingenTM Annexin V: FITC Apoptose Detektion Kit (BD-Pharmingen Biosciences, San Diego, CA) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt, efter indsamling og vask to gange med PBS blev celler resuspenderet i bindingspuffer (500 pi). FITC-Annexin-V (5 pi) blev tilsat til cellerne efterfulgt af tilsætning af 5 pi PI ifølge protokollen. Prøverne blev derefter inkuberet i 15 minutter i mørke ved stuetemperatur og udsat for flowcytometri evaluering.
Statistiske analyser
Værdier er udtrykt som middelværdi ± SEM eller middel ± SEM for kontrol og eksperimentelle prøver og statistiske analyser blev udført ved Students t-test med GraphPad Prism software 5.1. Værdierne blev anset statistisk signifikant, hvis p-værdien var 0,05 eller mindre.
Resultater
Generelle bemærkninger
Ud af femten mus, to mus udviklede mavekræft efter 220 og 256 dage efter fodring af RAN ekstrakt med kalk (figur 2A a og b). Ingen tumor blev udviklet i mus enten ubehandlet eller administreres med kun RAN. Den histologiske snit klart adskilles mellem den normale (figur 2A c) og tumorøse mave (figur 2A d-f). Imidlertid blev histologisk fremstilling af mavevæv også lavet af tre tilsyneladende normalt udseende mus tilfældigt udvalgt fra denne gruppe efter 300 dages fodring med RAN-ekstrakt med og uden kalk. Begge løb med og uden kalk viste sin evne til at inducere cancer i maven. To ud af tre mus behandlet med kun RAN viste præ-kræft fase (dysplasi), mens alle de tre mus behandlet med RAN + kalk viste carcinom (figur 2B). Figur 2 dissekeret mus og histopatologi af både normale og tumorvæv af maven efter behandling med RAN med og uden kalk. A. dissekerede mus med (a) normal mave og (b) tumorøse mave angivet med en pil. Histopatologi af normal (c) og tumor mave (d, e og f) der induceres af RAN ekstrakt med kalk. Pilene angiver sår neoplasme i (d) og tumor kæmpeceller i (e og f). Forstørrelsen er angivet enten 10X eller 40X. B. Histopatologi af normal og tumorform maven på mus efter løb og løb + kalk behandling for 300 dage. I alle paneler, "Normal" angiver mus uden tumor, "Dysplasi" angiver mus med præcancer mave væv. "Carcinoma" angiver mus med tumorøse mave. Dysplasi viser anisokaryosis (variation i størrelse af kerner) og anisocytose (variation i størrelse af celler). Forstørrelsen er angivet enten 10X, 40X og 100X.
Studerede på metafase spreder
at bestemme om kontinuerlig administeration af RAN-ekstrakt (fra 15 til 180 dage) med eller uden kalk har nogen effekt på kromosomer, vi studerede metafasespredninger efter 2 h behandling med colchicin, i knoglemarvsprøver. Data, afslørede en gradvis stigning i mitotiske tal med tidligt adskilte søster kromatider (figur 3A og C) i både løb og løb + kalk administreret mus sammenlignet med ingen i ubehandlede mus. Det er også klart af undersøgelsen, at RAN + kalk administreret museknoglemarvs viste signifikant højere frekvens af sådanne gammelklog anafase end kun kørte administreret (figur 3A). Efter 180 dages kontinuerlig administeration af RAN + kalk, 34,4% tidlig anafase sammenlignet med 18,4% (p = 0,002) i RAN administreret muse BMC blev set. Figur 3 Karyotype-analyse af efter udsættelse for RAN ekstrakt med (RAN + L) eller uden kalk (RAN) genomisk ustabilitet i knoglemarvceller hos mus. (A) Procentdel af metafaser med tidlig søster-kromatid adskillelse. To mus pr punkt for ubehandlet, 15 og 30 dage behandlede gruppe og tre mus pr punkt for resten. Mindst 100 metafaser blev bedømt til hver mus. (B) Normal metafasespredning fra muse knoglemarvsceller. (C) For tidlig søster-kromatid adskillelse fra mus udsat for RAN. Parentes viser søster-kromatider liggende adskilt i mitotiske tal, der viser fænotype. (D og E) metafasespredning viste 37 og 38 kromosomer, hhv. (F, G og H) metafasespredning viste mere end 60 kromosomer. (I) viste mere end 80 kromosomer.
Vi tælles antallet af kromosomer i metafase spreder at forstå betydningen af ​​tidligt udviklede anaphases i forhold til kromosom stabilitet. De ubehandlede mus har en stabil (2n = 40) karyotype (figur 3B) og viste ingen aneuploide celler. Vi iagttog lav frekvens af aneuploide celler (figur 3D-I; Tabel 1) i RAN-administreret med og uden kalk, i 120 dage, og det blev bemærket, at frekvensen af ​​aneuploide celler blev forøget gradvist. Den gennemsnitlige frekvens (13,8%) af aneuploide celler blev scoret i både maven tumorbærende mus. Samlet, frekvensen af ​​aneuploide celler var mere efter RAN + kalk administeration end RAN alene (tabel 1) .table 1 kromosomanalyse af knoglemarvsceller hos mus efter udsættelse for RAN ekstraher med eller uden kalk
Behandling mønster

Behandling dag
Total spredning scoret
kromosom nr.
Aneuploidi
tidlig søster Vejviser
37
38
39
40
41
42
> 60

% (Mean)
kromatidtypen adskillelse%
Ubehandlet
0
110
110
0
0
104
104
0
0
RAN
120
105
1
1
103
1,9
17,5
120
2
1
2
115
4.1
18,7
105
1
2
102
2,8 (2,9)
18,3 (18,2)
RAN + kalk
100
2
2
1
95
5,0
31.7
105
2
2
3
98
6,6
28,6
110
3
2
1
103
1
6,4 (6,0)
28,3 (29,5)
s = 0.015a
RAN
180
101
1
2
1
97
3,9
18,0
124
2
2
1
119
4.0
17,7
114
3
2
1
108
5,3 (4,4)
19,4 (18,4)
RAN + kalk
112
3
3
3
103
8,0
32,6
105
2
2
1
98
1
1
6,6
34,9
110
4
2
101
2
1
8.2 (7.6)
35,6 (34,4)
p = 0.002a
RAN + kalk
220
232
6
9
12
194
7
2
2
16,4
8,2
(med avanceret tumor)
256
234
5
4
7
208
5
2
3
11,1 (13,8)
7,1 (7,6)
en statistisk signifikant i parret t-test; tosidede p-værdi blev vist.
Kromosomfejl blev primært scoret som kromatid pauser. Meget lav frekvens af isochromatid pauser blev observeret, og ingen veksel- aberrationer blev fundet. Hyppigheden af ​​kromatid pauser og afvigende metafaser blev øget gradvist fra 60 til 180 dage af RAN-administeration med eller uden kalk. Hyppigheden af ​​aberrationer var mere efter RAN + kalk administeration end RAN alene. Hyppigheden af ​​aberrationer var mere i både den avancerede mave tumorbærende mus. (For aberration oplysninger, se Yderligere fil 1: Supplerende oplysninger).
Reduceret udtryk for mitotiske og spindel checkpoint gener i RAN-behandlede mus
På baggrund af de ovennævnte undersøgelser, undersøgte vi ekspressionen af ​​AuroraA, AuroraB, MAD2
og Bub1
gener i knoglemarv, esophageal og mave-celler i disse mus, som var ubehandlet eller administreres RAN ekstrakt med og uden kalk til 120, 180 og 260 dage. De konventionelle RT-PCR-resultater (figur 4) viste, at celler indsamlet fra spiserøret og maven viste meste under-ekspression af disse gener i forhold til ubehandlet én og sådanne under-ekspression var konsistent og signifikant i RAN + kalk administrerede mus. Men udtryk for alle disse gener i BMC ikke ændre på nogen væsentlig måde undtagen overekspression af MAD2
og Bub1
blev bemærket i BMC af musen opsamlet efter 260 dages administeration. Figur 4 Øvre XLRF Angivelse af mitose checkpoint gener i mus knoglemarv (BM), spiserør og mavesæk celler efter eksponering med RAN ekstrakt med eller uden kalk til 120, 180 og 260 dage. Lavere XLRF Kvantitativ densitometrisk analyse af udtrykket profil mitotiske checkpoint gener mRNA niveau i spiserøret og maven celler efter 260 dages eksponering blev vist. Værdierne er gennemsnit ± SEM for tre uafhængige forsøg. Værdierne normaliseret til respektive GAPDH værdier. * P < 0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001. Væsentligt anderledes i forhold til negativ /positiv kontrol (som bestemt ved parret t-test).
Analyse af over-ekspression af gener gennem immunoblotting
Niveauer af p53, p65, Bax
og Securin
i BMC fra mus efter administeration af RAN ekstrakt med eller uden kalk i 60, 90 og 180 dage, og de spiserør og mave efter 180 dages fodring blev undersøgt ved immunoblotting. Niveauer af disse proteiner blev også testet fra cellerne indsamlet væv-wise fra de ubehandlede mus. Resultater indikerer, at ekspressionen af ​​p53, p65, Bax
og Securin
er forhøjet betydeligt i alle væv i RAN administrerede mus. En sådan forhøjelse var signifikant højere i RAN + kalk end i kun kørte indgivne mus (figur 5). Figur 5 Upper panel- repræsentant western blotting påvisning af p65, p53, Securin, bax og β-actin i museknoglemarvs (BM), spiserøret og maven celler efter eksponering med RAN ekstraher med eller uden kalk. For BM blev celler opsamlet efter 60, 120 og 180 dage, mens der for spiserøret og maven blev celler opsamlet først efter 180 dages eksponering. p-actin blev anvendt som indlæsning kontrol. Lavere panel- Kvantitativ densitometrisk analyse af omfanget af proteiner af de ovennævnte gener i knoglemarv, blev spiserøret og maven celler efter 180 dages eksponering vist. Værdierne er gennemsnittet ± SD af tre uafhængige forsøg. Værdierne normaliseret til respektive p-actin værdier. * P < 0,05; ** P < 0,01 Signifikant forskellig i forhold til negativ /positiv kontrol (som bestemt ved parrede t-test).
Flow-cytometriske undersøgelser af cellecyklus og påvisning af apoptotiske celler ved dobbelt-farvning og immunblotting
Flowcytometrisk analyse af DNA-indholdet i knoglemarv , spiserøret og maven celler fra mus opsamlet efter 260 dages RAN + kalk administration (figur 6A), viste, at der var en stigning i G1-fase celler i både knoglemarven og spiserøret med hensyn til ubehandlet kontrol. Men i maven, blev procentdelen af ​​celler i sub-G1-fasen øges, som kan tilskrives grund apoptotisk celledød. For at bekræfte dette, blev dobbelt farvning med annexinV og PI udført. Data i figur 5B tyder på øget positiv farvning med Annexin-V i kvadrant 2 og 3 i maven celler, men ikke i esophageal celler af RAN + kalk administrerede mus. Figur 6 Analyse af cellecyklus og apoptose i mus behandlet med RAN med kalk (A) Analyse af cellecyklus efter 260 dages eksponering med RAN ekstraher med kalk i knoglemarv, spiserøret og maven celler fra mus og også fra mave-tumorceller. (B) Repræsentative cytogrammer af Annexin V versus PI fluorescensintensiteter som bestemt ved flowcytometrisk analyse i muse spiserøret og maven celler efter 260 dages eksponering med RAN med kalk og fra mave-tumorceller. Inden for en cytogram, kvadrant 1 og 2 repræsenterer tidlige og sene apoptotiske celler henholdsvis; kvadrant 3, levedygtige celler; kvadrant 4, døde celler. (C) Western blotting for apoptotiske markører i normale (ubehandlede) og tumor maven celler. β-actin blev anvendt som indlæsning kontrol.
Interessant flow-cytometri af tumorceller indsamlet fra musene, der udviklede tumor i maven efter 220 og 256 dages kontinuerlig administeration af RAN og kalk, som viste betydelig reduktion i G1 celler med en samtidig stigning i sub-G1 celler (figur 6A). Dual farvning indikerer, at sub-G1 celler er for det meste nekrotiske døde celler (kvadrant 4) (figur 6B). Markant højere niveau af p53
og Bax
proteiner blev observeret i tumor end normale mave-celler (Figur 6C). Imidlertid blev PARP
fundet at være fraværende i både tumorceller af maven selvom PARP
og dets 29 kD spaltet produkt var til stede i normale mave prøver (figur 6C).
Diskussion
foreliggende undersøgelsen blev foretaget for at se om ad libitum
administeration af RAN ekstraher med eller uden kalk i drikkevand kan inducere spiserøret eller mavekræft i mus og hvis den gør, hvad indledende processer er involveret. I denne undersøgelse blev musene givet hele RAN-ekstrakt med og uden kalk for at efterligne den konsum stil af RAN. Desuden blev dosen også forøges periodevis som det sker for mennesker. Vores resultater viste, at både RAN med og uden kalk fremkalde mavekræft, selv om det bemærkes, at tilstedeværelsen af ​​kalk med RAN fremmes højere transformation celle og derved udviklede mavecancer tidligere end RAN alene. Det fremgår, at cancer blev induceret i maven på grund af den større eksponering dens foring måtte RAN mens spiserøret foring blev eksponeret kun kortvarigt under drikning RAN blandet vand.
Det er blevet påvist tidligere, at en alkalisk pH er ideel til at generere ROS ved autoxidation af arecanødder-møtrik polyfenoler [6, 7]. Det blev også vist, at catechin brøkdel af arecanødder-møtrik ekstrakt aktivt genererer ROS ved alkalisk pH, der inducerer DNA-beskadigelse in vitro
[21, 22]. Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

• Ekspression af en LINE-1 endonuclease variant i mavekræft: dens association med klinisk-patologisk parameters
• Gastrobeskyttende mekanisme Paederia foetida Linn. (Rubiaceae) - en populær spiselig plante brugt af stammeledere samfund af nordøstlige India