Induktio kromosomi epävakauden ja mahasyöpä muuttamalla ekspressiokuviota mitoosi tarkistuspiste geenien hiirillä altistettiin areca pähkinä

Induktio kromosomi epävakauden ja mahasyöpä muuttamalla ekspressiokuviota mitoosi tarkistuspiste geenien hiirillä altistettiin areca-pähkinä
Abstract
tausta
olemassa vahvoja viitteitä syy-yhteydestä areca-mutterin kulutusta ja syöpiä. Meghalaya, Intia, erilaisia ​​areca-pähkinä käytetään raaka ja käsittelemätön muoto, jonka kemiallinen koostumus ja farmakologiset vaikutukset on raportoitu. Tiedämme kuitenkin hieman alkuperäisestä polku mukana areca-pähkinä liittyvän syövän synnyn, koska on vaikea arvioida sen vaikutuksia geneettisiin muutoksiin ilman häiriöitä muista kompaundoinniksi tekijöistä. Siksi esillä oleva tutkimus tehtiin hiirillä tarkistaa kykyä raaka areca-mutteri (RAN) aiheuttaa syöpää ja seurata tiettyjen geenien ilmentyminen mukana syövän synnyn. Tämä tutkimus ei ollut tarkoitus eristää mitään aktiivisia ainesosia RAN ja näyttää sen toimintaa. Tool Menetelmät
Kolme ryhmää hiiriä (n = 25) otettiin ja käytettiin eri aikapisteissä eri kokeellinen analyysi . Kolme muuta ryhmää hiiriä (n = 15 kussakin) katsottiin kasvainten induktioon tutkimuksiin. Jokaisesta sarjasta kaksi ryhmää annettiin RAN-uutetta mielin määrin
juomavedessä tai ilman kalkkia. Ilmaisun tiettyjen geenien arvioitiin tavanomaisella RT-PCR: lla ja immunoblottaus. Hiiret saivat koko RAN-uutetta ja ilman kalkkia, jotta jäljitellä ihmisravinnoksi tyyli RAN.
Tulokset
histologinen valmistelu vatsa kudos osoitti, että RAN aiheuttama mahasyöpä. Lisääntyi asteittain taajuus pikkuvanha Anaphase ja aneuploidi solujen havaittiin luuytimen solut suurempi lisäys seuraavat RAN + lime Tiehallinto. Tasot p53, Bax, Securin
ja p65
ruokatorven ja mahalaukun solut koholla aikana alkuaikoina RAN altistumisen kun taas eri mitoosi tarkistuspiste proteiinit vaimentua. Apoptoottista solukuolemaa ei havaittu ei-syöpä mahan soluissa, mutta ei kasvainsoluja, jotka osoittivat yli-ilmentyminen Bax
ja ilman PARP
.
Päätelmä
Nykyinen tutkimus ehdotti (a) RAN indusoi mahasyöpä, kuitenkin, läsnäolo kalkkia edistetään korkeamman solutransformaatio ja siten kehittynyt syöpä aiemmin, (b) häiriöt komponenttien kromosomissa erottelun järjestelmä voi olla mukana alkuperäisessä prosessissa karsinogeenisuudesta ja (c) on tärkeää varhaiskypsä Anaphase seulontatestinä merkki tunnistamista varten mitoosi tarkistuspiste vikojen aikana alkuaikoina.
avainsanat
kromosomi epävakaus mitoottista tarkistuspiste geenien Securin
Apoptosis Background
Ruokatorven levyepiteelisyöpä (ESCC) ja mahalaukun syövistä ovat yleisimpiä syöpiä Intiassa, jolla on korkein ilmaantuvuus ESCC ollessa koillisosassa valtioiden Intian [1]. On olemassa vahvoja viitteitä syy-yhteydestä areca-mutterin tai mälli pureskeltavaksi tapoja ja näitä syöpiä. Useat tutkimukset eri eläinlajeilla ovat osoittaneet positiivisia Kasvainten molemmissa kohde (poski-pussi, ruokatorven ja mahan) ja ei-kohde- (keuhko ja maksa) kudoksissa, kun arekoliinilla (ARC) tai areca-pähkinä uute antaa eri tavoin, kuten suun intubaatio [2], sekoitetaan ruokavalion [3], ja poski-pussi sovellus [4]. Siksi näyttää siltä, ​​että metabolisen aktivaation alkaloideja tarvitaan lopullista muuntamista lopullinen karsinogeenien, joka on voimakkaasti vaikuttanut fysiologiset olosuhteet ja läsnäolo tiettyjä tekijöitä [5]. Ilmoitettujen sukupolvi reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) peräisin areca-pähkinä ainekset emäksisissä olosuhteissa [6, 7]. Koska läsnä kalkin betel-quid valmiste, areca-mutteri chewers "syljen tyypillisesti muuttuu neutraalista alkaliseen tilaan, mikä voi olla ihanteellinen tuottaa ROS [7]. Nair et ai. [6] ovat myös huomattava, että lisäksi ARC, auto-hapetus areca mutterin polyfenolien voisi tuottaa H 2O 2 ja superoksidiradikaaleja emäksisessä pH: ssa.
Osavaltiossa Meghalaya, Intia, erilaisia areca pähkinä, paikallisesti kutsutaan kwai ", käytetään raakoja ja käsittelemätön raaka muodossa, joka on suurempi sisältö alkaloideja, polyfenoleja ja tanniinit verrattuna kuivatussa [8]. Betel-puntaa käytetään Meghalaya sisältää raaka areca-mutteri (RAN), lime tahna ja pieni osa betel lehtiä ilman tupakkaa ja muita aineosia. Täällä ihmiset nielemään koko mälli jälkeen pureskelun sijasta Sylkäiseminen joka voisi olla tärkeä tekijä ESCC ja mahasyöpä. Äskettäin, 40% ruokatorven syöpä näytteistä potilailta Meghalaya tilassa, jossa on vain RAN-pureskelua tapana osoitti poistetaan mikrosatelliittimarkkerin D9S1748 ja D9S1749, joka sijaitsee lähellä eksonia 1β on CDKN2A /ARF
geenin 9p21. Promoottori hypermetylaatiota CDKN2A
geenin oli huomattavasti korkeampi näytteet tapana RAN pureskelua yksin kuin niitä, joilla on tapana käyttää sekä RAN ja tupakan [9]. Tähän asti emme tiedä paljon alkuperäisestä reittiin kuuluu in betel-pähkinä liittyvän syövän syntymistä ruokatorven ja mahan. On myös vaikea arvioida vaikutuksia puhtaasti ja pääasiassa areca mutterin aiheuttama geneettisiä muutoksia ihmisen puuttumatta muiden seostaminen tekijät, kuten tupakan pureskelusta tai tupakointi, alkoholin, erilaisia ​​ei-vegeterian elintarvikkeet jne. Lisäksi läsnäolo lime tekee emäksinen tila, joka ei ole ihanteellinen in vitro
soluviljelmässä ja siksi vaikutus areca-pähkinä ei voida testata soluviljelmissä. Näiden esillä tutkimus tehtiin hiirillä tarkistaa kyky RAN-uutteen kanssa tai ilman kalkkia, aiheuttaa syöpää, ja samanaikaisesti arvioida ekspressiokuviota tiettyjen geenien, joilla on tärkeä rooli alkuperäisen karsinogeneesin prosessiin.
kemiallinen koostumus ja farmakologiset vaikutukset areca-pähkinä on raportoitu ja tarkistaa useat työntekijät [10, 11]. Useat eläinkokeet ovat vahvistaneet, että areca-pähkinä tuotteiden ja betelpähkinöiden nitrosamiinien, on kyky aiheuttaa neoplastisia muutoksia koe-eläimillä [11]. Huomattavaa näyttöä siitä, että areca-pähkinä-alkaloideja, pääasiassa arekoliinilla (ARC) ovat tärkeitä tekijöitä BN-myrkyllisyys [11]. Osoitettiin, että ARC voi aiheuttaa DNA vahingoista hiiren luuytimen soluja [12] ja tällaisen DNA vahingot voidaan vähentää, kun ARC annetaan yhdessä N-asetyyli-L-kysteiini [13]. Siksi on syytä mainita, että tässä tutkimuksessa ei ollut tarkoitus eristää mitään aktiivisia ainesosia RAN ja näyttää sen toimintaa. Tavoitteena oli selvittää alkuperäisen reitin mukana RAN liittyy syövän syntymistä hiirillä ja siksi hiirille annettiin koko RAN-uutetta ja ilman kalkkia, jotta jäljitellä kulutusta tapana ihmisen.
Useita geenejä, kuten p53 , p65, Securin
ja monet muut, joita tiedetään yleensä yli-ilmentynyt aikana syövän synnyn [14-16]. Lisäksi geneettinen epävakaus liittyy myös kromosomiin epävakaus (CIN), joka johtaa aneuploidian, tunnusmerkki syöpä. Tällaiset aneuploidia- voi helpottaa kasvaimen kehittymisen kautta menetys tuumorisuppressorigeenin toiminto. On havaittu, että osittainen menetys mitoosi tarkistuspisteen kontrolli johtaa CIN ihmisen syöpäsoluja [17, 18]. Näin ollen, esillä olevassa tutkimuksessa arvioimme ekspressiokuviota p53, p65, Securin
ja useita mitoosi ja kehräkokoonpanon tarkastuspiste-geenit eri ajankohtina. Havaitsimme, että RAN voi aiheuttaa mahasyöpä häiritsemällä komponentit kromosomi erottelu koneita. Tool Menetelmät
valmistaminen uutteiden
jälkeen kuoret kuitumainen takit käsittelemättömien raaka ja raakoja areca-mutteri (RAN), 100 g RAN jauhettiin ja suspendoitiin 125 ml: aan tislattua vettä ja sekoitettiin perusteellisesti, jolloin saatiin sileä tahna valmistamiseksi vesipitoisen uutteen RAN. 24 tunnin kuluttua, tahna sekoitettiin 3 tunnin ajan 37 ° C: ssa ja vesipitoinen uute kerättiin talteen sentrifugoimalla. Tämä uuttoprosessi toistettiin vielä kerran lisäämällä 125 ml vettä jäännökseen. Molemmat uutteet yhdistettiin, eli 100 g RAN 250 ml: ssa tislattua vettä, suodatettiin ja pakastettiin - 80 ° C: ssa. Suodos lyofilisoitiin Secfroid Lyolab BII lyofilisaattoria (Tanska). Lyofilisoitu massa pidettiin 4 ° C: ssa käyttöön asti. Uute sisälsi 0,9 g /100 g vesiliukoisia materiaalia.
Eläimet huolto ja hoito
Swiss albinohiirten (25-30 g), 2-3 kuukautta vanha pidettiin laboratoriossa yhteisö häkeissä samassa huoneessa säädetyssä lämpötilassa (20 ± 2 ° C) ja ohjattu valaistus (12 h valo, 12 h pimeää). Standard hiiri ruokavalio (NMC Oil Mills Ltd, Pune, Intia) ja vettä mielin määrin
käytettiin kaikissa kokeissa. Kokeet tehtiin noudattaen institutionaalisten ohjeiden ja hyväksynyt meidän "Institutional Standards for Animal Care ja Käytä" hallituksen.
Set-1, kolme ryhmää hiiriä (n = 25) otettiin joita käytettiin eri ajankohtina eri koe-analyysiä. Set-2, kolme ryhmää hiiriä (n = 15 kussakin) katsottiin kasvainten induktioon tutkimuksiin. Kuvassa 1 on kaaviokuva siitä yleisestä tutkimussuunnitelma jota pidettiin tässä tutkimuksessa. Jokaisesta sarjasta yksi ryhmä käsiteltiin yksinkertainen juomavettä pidetään käsittelemätöntä taas kahteen ryhmään annettiin RAN purkaa ad libitum
juomaveteen tai ilman kalkkia (pH 9,8). On arvioitu, että jokainen hiiri kuluttaa 1 mg uutetta päivässä. Tällaiset suun kautta Tiehallinto jatkettiin 60 päivää, jonka jälkeen annosta nostettiin 1 mg 2 mg päivässä asti 120 päivää. Vastaavasti jokainen 60 päivää myöhemmin annosta lisättiin 1 mg: aan päivässä kulutusta. Kuva 1 Vuokaavio kokeelliset analysointiin raaka areca-pähkinä välittämää Karsinogeneesi hiirillä. RAN- raaka areca-pähkinä; d- päivää.
valmistelu metafaasien ja pisteytystä kromosomipoikkeavuuksien
varten metafaasissa valmistelu, luuydinsolujen (BMC) kerättiin kaksi hiirtä per piste käsittelemättömästä, 15 ja 30 päivän käsitellyn ryhmän ja kolme hiirtä per piste loput. Käsitellyissä ryhmissä, BMC kerättiin 15, 30, 60, 120 ja 180 päivää hoidon jälkeen. BMC kerättiin myös kaksi hiirtä, joissa mahan kasvain. BMC kerättiin 2 h kuluttua kolkisiinikäsittelysyklejä (15 mg /kg). Eläimet tapettiin katkaisemalla kaula. Reisiluut irrotettiin ja BMC: huuhdottiin pois ruiskuttamalla 2 ml 0,075 M KCI esilämmitetty 37 ° C. Soluja käsiteltiin hypotoniseen liuokseen 15 minuutin ajan ja kiinnitetään etikkahappoa ja metanolia (1: 3). Objektilasit valmistettiin liekki kuivausmenetelmä, värjättiin 5% Giemsa 5 min ja asentaa synteettinen väliaineessa. Kuvia metafaasivaiheeseen levitteiden otettiin alla Zeiss Axioskop mikroskoopilla (Saksa).
Kormosomaalista tutkimuksessa dioja koodattiin satunnaisesti ja vähintään 100 hyvin levinnyt metafaasissa levyjä Tutkimukseen valittiin kustakin hiirestä. Suoritimme kromosomi luottaa metafaasissa leviämiseen. Kromosomipoikkeavuudet pisteytettiin isochromatid taukoja ja kromatidipoikkeavuuksiin taukoja. Katso Laajennettu Kokeelliset menetelmät yksityiskohtia Additional tiedosto 1: Tiedotustiedot.
Immunoblottausmääritys
Solut luuytimestä, ruokatorvi (raaputtamalla sisäkerros) ja vatsa (raaputtamalla sisäosa) pestiin kahdesti PBS: llä (fosfaatti puskuroitu suolaliuos) ja lyysattiin radioimmuno-saostuksen (0,1% SDS, 2 mM EDTA, 1% NP-40, 1% natriumdeoksikolaattia, 50 mM natriumfluoridia ja 100 U /ml aprotiniinia). 30 min inkubaation jäillä, solulysaateista sentrifugoitiin 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja proteiinin määrä määritettiin käyttäen bikinkoniini- happoa proteiinin määritystä. Sama määrä proteiinia (40 ug) kustakin näytteestä ladattiin kuhunkin kuoppaan; equal loading varmistettiin lisäksi immunoblottaus aktiinin vasta-aineita. Näytteet ladattiin Novex Tris-glysiini 4-20% gradienttigeeleillä ja elektroforeesi suoritettiin NuPAGE elektroforeesijärjestelmään (Invitrogen, USA). Proteiinit siirrettiin polyvinylideenifluoridia (PVDF) kalvo (Sigma) seuraavan standardin protokollaa. Kalvot tutkittiin 1: 1000 laimennus hiiren monoklonaalisen vasta-aineen p53
(PAB 240, ab-26; Abcam, USA), Bax
(6A7; ab5714, Abcam, USA), Securin
(DCS-280, ab3305, Abcam, USA), β-aktiini
(AC-15, ab6276, Abcam, USA) ja kanin polyklonaalinen vasta-aine NF-κβ P65
(ab31481; bcam, USA). Blotit pestiin 3 kertaa 10 minuuttia kukin TBST-puskurissa, pH 7,6 (1 M Tris-Cl, 5 M NaCl ja 0,05% Tween 20) ja inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen (alkalinen-fosfataasiin konjugoitua anti-hiiri-IgG tai maa-fosfataasiin konjugoitua antirabbit IgG 1: 2000, Abcam, USA) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Perusteellisen pesemisen jälkeen blotti upotettiin 4 ml substraattiliuosta ja BCIP /NBT (Bangalore genei, Intia). Riittävä värjäys saatiin 15 min. Kukin immunoblottaus tehtiin kolme hiirtä kohden pisteen.
Histopatologisissa
Vatsa kudosta kerättiin käsittelemätön kontrolli ja kahdesta RAN + kalkki käsitellyistä hiiristä kasvain. Toisessa asetettu, vatsa kudos kerätään myös käsittelemättömästä samoin kuin ryhmät, jotka käsitelty 300 päivää RAN-uutetta ja ilman kalkkia. Kolme hiiret valittiin satunnaisesti kustakin ryhmästä. Nämä hiiret eivät ole mitään viitteitä kasvaimen ulkoisesti. Kudosleikkeet (5-7 um) käsiteltiin histologista leikkuu kohti vakioyhteyskäytäntöä [19] ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla [20]. Sitten leikkeitä havaittu valomikroskoopilla ja valokuvattiin (Carl Zeiss, Saksa).
RNA ja perinteisiä RT-PCR-analyysi
Solut kerättiin raaputtamalla sisäkerroksen ruokatorven ja mahalaukun käsittelemättömästä ohjaus, RAN ja RAN + lime käsitelty hiiri (kolme hiirtä per piste). Luuytimen solut kerättiin reisiluusta luun hiiren. Kokonais-RNA eristettiin Trizol ja puhdistettiin sitten käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen) mukaan valmistajan protokollaa. Käänteistranskriptio suoritettiin 1 ug kokonais-RNA: ta kustakin näytteestä käyttäen Quantiscript käänteistranskriptaasia, Quantiscript RT-puskuria ja RT Primer-yhdistelmä QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Saksa) mukaan valmistajan protokollaa. Monistaminen cDNA tehtiin 20 ul liuosta, joka sisältää 2 ui cDNA, 10 pmol aluketta paria aurora A, aurora B, Mad2, Bub1 ja GAPDH (alukkeen sekvenssit, katso Additional tiedosto 1: Tiedotustiedot) vastaavasti, ja 10 ui RT qPCR Master mix (Qiagen GmbH, Hilden, Saksa). PCR koostui alkudenaturaatio 94 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 30 reaktiosykliä (30 sekuntia 94 ° C: ssa, 30 sekuntia 60 ° C: ssa, ja 30 sekuntia 72 ° C: ssa), ja viimeinen sykli 72 ° C: ssa 10 min. GAPDH: ta käytettiin sisäisenä kontrollina. Kaikki PCR-tuotteet elektroforeettisesti erotettiin etidiumbromidilla värjätty agaroosigeelillä ja visualisoitiin UV-valolla.
Virtaussytometrinen analyysi solujen
Hiiren luuytimen solut ja solut kerättiin raaputtamalla sisäkerroksen ruokatorven ja mahalaukun sekä käsittelemätön ja käsitelty 260 päivää RAN kanssa tai ilman kalkkia fiksoitiin 70% etanolilla. Vatsa kasvainsolut kerättiin myös ja kiinteä. Kiinnitetyt solut pestiin PBS: ssä ja suspendoitiin uudelleen 500 ui propidiumjodidia (50 ug /ml propidiumjodidia, 0,2 mg /ml RNaasi) 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa pimeässä. 10000 solua hankittiin kustakin näytteestä ja analysoitiin FACS Calibur (Becton-Dickinson). CellQuest Pro -ohjelmisto käytettiin määrittämään solusyklin osastojen arvioida solujen prosenttiosuus jaetaan eri solusyklin vaiheissa.
Anneksiini V merkintöjä tutkimukset
Apoptoottista solukuolemaa arvioitiin käyttäen anneksiiniV-fluoreseiini-isotiosyanaatti menetelmä vatsassa kasvainsoluissa ja myös sisäkerros solujen mahan ja ruokatorven käsittelemättömien ja RAN ja ilman lime käsitelty hiiri kuluttua 260 päivää jatkuvan Tiehallinto. Solupelletti suspendoitiin uudelleen PBS: ään. Solut värjättiin propidiumjodidilla ja anneksiini-V-FITC käyttäen BD PharmingenTM anneksiini V: FITC Apoptosis Detection Kit (BD-Pharmingen Biosciences, San Diego, CA) kohti valmistajan ohjeita. Lyhyesti, sen jälkeen, kun keräämällä ja pesemällä kahdesti PBS: llä, solut suspensoitiin uudelleen sitomispuskuriin (500 ui). FITC-anneksiini-V (5 ui) lisättiin soluihin, minkä jälkeen lisättiin 5 ui PI protokollan mukaisesti. Näytteitä inkuboitiin sitten 15 minuuttia pimeässä huoneenlämpötilassa ja alistettiin virtaussytometria arviointiin.
Tilastollinen analyysi
Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM tai keskiarvo ± SEM ohjaus- ja koenäytteiden ja tilastollinen analyysi suoritettiin Studentin t-testi GraphPad Prism-ohjelmiston 5.1. Arvot katsottiin tilastollisesti merkittäviksi, jos p-arvo oli 0,05 tai vähemmän.
Tulokset
Yleiset huomautukset
viidestätoista hiirillä, kaksi hiirille kehittyi mahasyöpä jälkeen 220 ja 256 päivää ruokinta RAN uutetaan lime (Kuvio 2A a ja b). Ei kasvaimen kehitettiin hiiren tai käsittelemättömät annostella RAN vain. Histologinen osassa selvästi erotteli normaali (kuva 2A c) ja tumorous mahan (kuva 2A d-f). Kuitenkin histologinen valmistelu vatsa kudos oli myös tehty kolmesta normaalisti näköinen hiiriä satunnaisesti valittu tämän ryhmän jälkeen 300 päivää ruokinta RAN-uutetta ja ilman kalkkia. Sekä RAN ja ilman lime osoitti sen kyky aiheuttaa syöpää vatsassa. Kaksi kolmesta hiirestä hoidettiin vain RAN osoitti syöpää edeltävän vaiheen (dysplasia), kun taas kaikki kolme hiirtä hoidettiin RAN + lime osoitti karsinooma (kuvio 2B). Kuvio 2 Dissected hiiren ja histopatologia sekä normaalin ja kasvainkudoksen mahalaukun hoidon jälkeen RAN kanssa ja ilman kalkkia. A. Dissected hiiri (a) normaali mahan ja (b) tumorous vatsan nuolella. Histopatologia normaali (c) ja kasvaimen vatsa (d, e ja f) indusoi RAN uutetta kalkilla. Nuolet osoittavat haavaumia kasvaimen (d) ja kasvaimen jättiläinen soluja (e ja f). Suurennus on tarkoitettu joko 10X tai 40X. B. histopatologia normaali ja tumorous vatsassa hiiristä RAN ja RAN + kalkki hoitoa 300 päivää. Kaikissa paneelit, "Normaali" osoittaa hiirillä, joilla ei ole kasvainta, "dysplasia" osoittaa hiirten precancerous vatsaan kudosta. "Karsinooma" osoittaa hiiriä tumorous vatsaan. Dysplasia näyttää anisokaryosis (vaihtelu koko ytimet) ja anisosytoosia (kokovariaatio solujen). Suurennus on merkitty joko 10X, 40X ja 100X.
Tutkittu metafaasissa leviää
Sen määrittämiseksi, jatkuva Tiehallinto RAN uute (15-180 päivää) kanssa tai ilman kalkkia on vaikutusta kromosomeissa, tutkimme metafaasissa levitteet , kuluttua 2 h hoidon kolkisiini, luuytimen näytteitä. Data paljasti asteittainen nostaminen mitoosi lukuja ennenaikaisesti erotetut sisko kromatidia (kuvio 3A ja C) sekä RAN ja RAN + kalkki annettiin hiiri, verrattuna yhtään hoitamattomilla hiirillä. Se ilmenee myös tutkimuksesta, joka RAN + kalkki annostellaan hiiren luuytimen verrokkeja tiheämmin tällaisten varhaiskypsä Anaphase kuin vain RAN annostella (kuvio 3A). 180 päivän jälkeen jatkuvan Tiehallinto RAN + kalkkia, 34,4% varhaiskypsä Anaphase verrattuna 18,4% (p = 0,002) RAN hallinnoimassa hiiren BMC nähtiin. Kuvio 3 Karyotyyppi genomi epävakaus luuytimen soluissa hiiren altistuksen jälkeen RAN uute (RAN + L) tai ilman kalkkia (RAN). (A) Prosenttia metafaasien ennenaikainen sisar-kromatidipoikkeavuuksiin erottaminen. Kaksi hiirtä per piste käsittelemättömän, 15 ja 30 päivän käsitellyn ryhmän ja kolme hiirtä per piste loput. Ainakin 100 metafaasien pisteytettiin kullekin hiirelle. (B) Normaali metafaasissa leviäminen hiiren luuytimen soluja. (C) Ennenaikainen sisar-kromatidin erottaminen hiiri altistuu RAN. Sulkeissa sisar-kromatidia makaa erotettu mitoosi lukuja, jotka osoittavat fenotyyppi. (D ja E) Metaphase leviäminen osoitti 37 ja 38 kromosomia, vastaavasti. (F, G ja H) Metaphase leviäminen osoitti yli 60 kromosomia. (I) osoitti yli 80 kromosomia.
Laskimme kromosomien lukumäärä metafaasissa leviää ymmärtää merkityksen varhaiskypsä anaphases nähden kromosomiin vakautta. Käsittelemätön hiirillä on vakaa (2n = 40) karyotyyppi (kuvio 3B), ja ei ole mitään aneuploidi soluja. Emme tarkkailla alhainen taajuus aneuploidi soluja (kuva 3D-I, taulukko 1) RAN-annettiin, ja ilman kalkkia, 120 päivää ja todettiin, että taajuus aneuploidi solujen lisääntynyt vähitellen. Keskimääräinen taajuus (13,8%) on aneuploidi solujen pisteytettiin sekä mahatuumori hiirille. Kaiken taajuus aneuploidi solujen oli seuraavat RAN + kalkki Tiehallinto kuin RAN yksinään (taulukko 1) .table 1 Kromosomianalyysi hiiren luuytimen solujen altistuksen jälkeen RAN purkaa tai ilman kalkin
hoito kuvio

hoito päivää
Yhteensä leviäminen sai
kromosomi no.
Aneuploidy
Ennenaikainen sisko

37
38
39
40
41
42
> 60

% (Mean)
Kromatidipoikkeavuus erottaminen%
Hoitamaton
0
110
110
0
0
104
104
0
0
RAN
120
105
1
1
103
1,9
17,5
120
2
1
2
115
4,1
18,7
105
1
2
102
2,8 (2,9) B 18,3 (18,2)
RAN + lime
100
2
2
1
95
5,0
31,7
105
2
2
3
98
6,6
28,6
110
3
2
1
103
1
6,4 (6,0) B 28,3 (29,5)
p = 0.015a
RAN
180
101
1
2
1
97
3,9
18,0
124
2
2
1
119
4,0
17,7
114
3
2
1
108
5,3 (4,4) B 19,4 (18,4) B RAN + lime
112
3
3
3
103
8,0
32,6
105
2
2
1
98
1
1
6.6
34,9
110
4
2
101
2
1
8,2 (7,6)
35,6 (34,4) B p = 0.002a
RAN + lime
220
232
6
9
12
194
7
2
2
16,4
8,2
(edistynyttä kasvain) B 256
234
5
4
7
208
5
2
3
11,1 (13,8)
7,1 (7,6)
tilastollisesti merkittävä pariksi t-testiä; kaksisuuntainen p-arvo näkyy.
kromosomiaberraatiot pisteytettiin lähinnä kromatidipoikkeavuuksiin taukoja. Erittäin alhainen taajuus isochromatid taukoja havaittu eikä mitään vaihto poikkeavuuksia löytynyt. Taajuus kromatidin taukoja ja poikkeava metafaasien nostettiin vähitellen 60-180 päivää RAN-Tiehallinto tai ilman kalkkia. Taajuus kromosomipoikkeavuuksien oli seuraava RAN + kalkki Tiehallinto kuin RAN yksin. Taajuus kromosomipoikkeavuuksien oli niin kehittynyt mahatuumori hiirille. (Jos poikkeama Lisätietoja Additional tiedosto 1: Täydentäviä tietoja).
Alennettu ilmaisun mitoosi ja karan tarkistuspiste geenien RAN-käsiteltyjen hiirten
Näistä edellä tutkimuksissa tarkastelimme ilmaus AuroraA, AuroraB, MAD2
ja Bub1
geenien luuytimessä, ruokatorven ja mahalaukun solujen niitä hiiriä, jotka olivat käsittelemättömiä tai antaa RAN uutetta ja ilman kalkin 120, 180 ja 260 päivää. Tavanomaisen RT-PCR-tulokset (kuvio 4) osoitti, että solut kerätään ruokatorven ja mahan osoittivat enimmäkseen-näiden geenien ilmentymistä suhteessa käsittelemättömän yhden ja tällainen ali-ilmentyminen oli yhdenmukaista ja merkittävä RAN + kalkin annetaan hiirille. Ilmaisulla kaikkien näiden geenien BMC ei muutu merkittävällä tavalla paitsi yli-ilmentyminen Mad2
ja Bub1
todettiin BMC hiiren jälkeen kerättyä 260 päivää ja Tiehallinto. Kuva 4 Upper paneelin Expression mitoosi tarkistuspiste geenien hiiren luuytimen (BM), ruokatorven ja mahalaukun solujen altistuksen jälkeen RAN uuta tai ilman kalkkia 120, 180 ja 260. Alempi paneelin kvantitatiivinen densitometristä analyysi ilmaisun profiilin mitoosi tarkistuspiste geenien mRNA tasolla ruokatorven ja mahalaukun solujen jälkeen 260 päivää altistuksen näytettiin. Arvot ovat keskiarvo ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. Arvot normalisoidaan vastaaviin GAPDH-arvot. * P < 0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001. Merkittävästi erilainen verrattuna negatiivisen /positiivisen kontrollin (määritettynä pariksi t-testi).
Analyysi yli-ilmentymisen geenien kautta immunoblottauksen
Tasot p53, p65, Bax
ja Securin
BMC hiiristä jälkeen Tiehallinto RAN purkaa tai ilman kalkkia 60, 90 ja 180 päivää, ja ne, ruokatorven ja mahalaukun jälkeen 180 päivän ruokinnan tutkittiin immunoblottauksella. Tasot nämä proteiinit testattiin myös soluista kerättiin kudosta viisasta käsittelemättömästä hiirillä. Tulokset osoittavat, että p53, p65, Bax
ja Securin
ovat koholla merkittävästi kaikissa kudoksissa RAN annettiin hiirille. Korotus oli huomattavasti korkeampi RAN + kalkkia kuin vain RAN annettiin hiirille (kuva 5). Kuva 5 Ylempi paneelin tyypillisen western blotting havaitseminen p65, p53, securin, Bax ja β-aktiini hiiren luuytimen (BM), ruokatorven ja mahalaukun solujen altistuksen jälkeen RAN uuta tai ilman kalkkia. BM, solut kerättiin jälkeen 60, 120 ja 180 päivää, kun taas ruokatorven ja mahan, solut kerättiin vasta 180 päivän altistumisen. p-aktiini käytettiin latauskontrollina. Alempi paneelin kvantitatiivinen densitometristä analyysi tasosta proteiinien edellä mainittujen geenien luuytimessä, ruokatorven ja mahalaukun solujen 180 päivän kuluttua altistuksen näytettiin. Arvot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Arvot normalisoidaan vastaaviin β-aktiini-arvot. * P < 0,05; ** P < 0.01 Merkittävästi erilainen verrattuna negatiivisen /positiivisen kontrollin (määritettynä pariksi t-testi).
Virtaussytometrinen tutkimukset solusyklin ja havaitseminen apoptoottisten solujen dual värjäys ja immunoblottaus
virtaussytometrianalyysin DNA sisällön luuytimessä , ruokatorven ja mahalaukun soluissa hiiren jälkeen kerättyä 260 päivää RAN + kalkki hallinto (kuvio 6A), osoitti, että oli kasvua G1 vaiheessa olevien solujen sekä luuytimen ja ruokatorven suhteen käsittelemätön kontrolli. Kuitenkin, vatsassa, solujen prosenttiosuus osa-G1-faasi kasvoi, mikä voisi johtua vuoksi apoptoottisen solukuoleman. Tämän varmistamiseksi dual värjäys anneksiiniV ja PI suoritettiin. Tiedot kuviossa 5B osoittavat lisääntynyt positiivista värjäytymistä anneksiini-V neljännekseen 2 ja 3 vatsassa soluissa, mutta ei ruokatorven soluissa RAN + lime annettiin hiirille. Kuva 6 analyysi solukierron ja apoptoosin hoidetuilla hiirillä RAN kalkilla (A) analyysi solusyklin kuluttua 260 päivää altistuksen RAN uuta lime luuytimessä, ruokatorven ja mahalaukun soluissa hiiren ja myös mahan syöpäsoluja. (B) edustaja sytogrammeja anneksiini V versus PI fluoresenssivoimakkuudet määritettynä virtaussytometrianalyysillä hiiren ruokatorven ja mahalaukun solujen jälkeen 260 päivää altistuksen RAN kalkilla ja vatsaan syöpäsoluja. Sisällä cytogram, neljännesympyrä 1 ja 2 ovat varhainen ja myöhäinen apoptoottisia soluja, tässä järjestyksessä; neljänneksessä 3, eläviä soluja; neljänneksessä 4, kuolleita soluja. (C) Western blotting apoptoottisen markkereita normaalissa (käsittelemätön) ja kasvaimen vatsaan soluja. β-aktiini käytettiin lastaus ohjaus.
Mielenkiintoista, virtaussytometria-analyysi tuumorisolujen kerätty hiiriltä, ​​jotka olivat kehittäneet kasvaimen jälkeen mahalaukun 220 ja 256 päivää jatkuvan Tiehallinto RAN ja kalkin, paljasti vähennetään merkittävästi G1 solut samanaikainen nousu osa-G1 soluihin (kuvio 6A). Dual värjäys osoittaa, että ala-G1 solut ovat enimmäkseen nekroottinen kuolleita soluja (neljänneksessä 4) (kuvio 6B). Merkittävästi korkeampi p53
ja Bax
proteiinit havaittiin kasvain kuin normaalit vatsaan soluja (kuvio 6C). Kuitenkin PARP
havaittiin olevan poissa sekä kasvainsoluissa mahan vaikka PARP
ja sen 29 kD: n pilkottiin tuote oli läsnä normaaleissa mahan näytteissä (kuvio 6C).
Keskustelu
Esillä tutkimus tehtiin, onko halun
Tiehallinto RAN purkaa tai ilman kalkkia juomaveteen voi aiheuttaa ruokatorven tai mahalaukun syövän hiiri ja jos on, mitä alustavia prosessit ovat mukana. Tässä tutkimuksessa hiirille annettiin koko RAN-uutetta ja ilman kalkkia, jotta jäljitellä ihmisravinnoksi tyyli RAN. Lisäksi annos lisääntyi myös ajoittain, koska se tapahtuu ihmisen. Tuloksemme osoittivat, että sekä RAN kanssa ja ilman lime aiheuttaa mahasyöpä, vaikka on huomattava, että läsnäolo kalkkia RAN edistetään korkeampi solutransformaatio ja siten kehittynyt mahasyöpä aikaisintaan RAN yksin. Vaikuttaa siltä, ​​että syöpä indusoitiin mahan, koska ne ovat alttiimpia sen limakalvon oli RAN kun ruokatorven limakalvon paljastui vain lyhyesti aikana juomaveden RAN sekoitetaan veteen.
On osoitettu aikaisemmin, että emäksisessä pH: ssa on ihanteellinen tuottamiseksi ROS itsehapetuksella on areca mutterin polyfenolit [6, 7]. Se oli myös osoittanut, että catechin osa areca-pähkinä uute aktiivisesti synnyttää ROS emäksisessä pH: ssa, joka indusoi DNA-vaurioita in vitro
[21, 22]. Kaikki kirjoittajat luettu ja hyväksytty lopullinen käsikirjoitus.

• Expression of LINE-1-endonukleaasi variantti mahasyövän: sen yhdessä kliinis parameters
• Gastroprotektiivinen mekanismi Paederia foetida Linn. (Rubiaceae) - suosittu syötävä kasvi, jota heimojen yhteisö Koillis-India