Inductie van chromosomale instabiliteit en maagkanker door verandering van het expressiepatroon van mitotische checkpoint genen in muizen die zijn blootgesteld aan pinang

Inductie van chromosoom instabiliteit en maagkanker door het veranderen van de expressie patroon van de mitotische checkpoint genen in muizen die zijn blootgesteld aan areca-noot
Abstract achtergrond
Er zijn sterke aanwijzingen voor een oorzakelijk verband tussen areca-noot consumptie en kanker. In Meghalaya, India, is de verscheidenheid van areca-noot wordt gebruikt als rauw en onbewerkte vorm waarvan de chemische samenstelling en de farmacologische werking zijn gemeld. Toch weten we weinig over de oorspronkelijke route die betrokken is bij areca-noot verbonden carcinogenese, omdat het moeilijk is om de effecten op de genetische wijzigingen te evalueren zonder tussenkomst van andere compounding factoren. Daarom werd deze studie uitgevoerd in muizen om het vermogen ruwe pinang (RAN) kanker induceert en de expressie van bepaalde genen betrokken bij kanker volgen verifiëren. Deze studie was niet bedoeld om een ​​actieve ingrediënten uit de RAN te isoleren en haar optreden te kijken.
Methods
Drie groepen muizen (n = 25 in elk) werden genomen en gebruikt worden op verschillende tijdstippen voor verschillende experimentele analyse . De andere drie groepen muizen (n = 15 elk) werden overwogen voor tumorinductie studies. In elke set werden twee groepen RAN-extract ad libitum
toegediend in het drinkwater, met of zonder kalk. De expressie van bepaalde genen werd bepaald door gebruikelijke RT-PCR en immunoblotting. De muizen kregen het gehele RAN-extract met en zonder kalk om de menselijke consumptie beroemd RAN nabootsen.
Resultaten
Histologische bereiding van maagweefsel bleek dat RAN geïnduceerde maagkanker. Een geleidelijke toename in de frequentie van vroegrijpe anafase en aneuploïde cellen werd waargenomen in de beenmergcellen met een grotere toename na RAN + lime administeration. Niveaus van p53, Bax, securine Kopen en p65
in slokdarm en maag-cellen werden verhoogd tijdens de eerste dagen van de blootstelling RAN terwijl die van verschillende mitotische checkpoint eiwitten werden neerwaarts gereguleerd. Apoptotische celdood werd gedetecteerd in niet-kanker maag cellen, maar niet in tumorcellen die overexpressie van Bax
en afwezigheid van PARP
toonde.
Conclusie
Present studie suggereerde (a) RAN veroorzaakt maagkanker, echter, de aanwezigheid van kalk bevorderd hogere celtransformatie en daardoor ontwikkelde kanker eerder, (b) verstoringen in componenten van het chromosoom segregatie machines konden worden betrokken bij de eerste proces van kankerverwekkendheid en (c) het belang van vroegrijpe anafase als screening marker voor identificatie mitotische checkpoint defecten tijdens de vroege dagen.
Trefwoorden, met de hoogste
Chromosome instabiliteit mitotische checkpoint genen securine
apoptose Achtergrond
Esophageal plaveiselcelcarcinoom (ESCC) en de maag kankers zijn de meest voorkomende vormen van kanker in India incidentie van ESCC zijn in noord-oostelijke staten van India [1]. Er zijn sterke aanwijzingen voor een oorzakelijk verband tussen areca-moer of quid kauwen gewoonten en deze vormen van kanker. Verschillende studies in verschillende diersoorten hebben aangetoond positieve inductie van tumoren in beide doel (cheek-zak, slokdarm en de maag) en niet-target (long en lever) weefsels wanneer arecoline (ARC) of areca-noot extract werd toegediend door verschillende dergelijke middelen orale intubatie [2], gemengd met het dieet [3], en wang-pouch toepassing [4]. Daarom lijkt het dat metabole activatie alkaloïden is nodig voor de uiteindelijke omzetting in het uiteindelijke carcinogeen, dat sterk beïnvloed door fysiologische omstandigheden en de aanwezigheid van bepaalde factoren [5]. Rapporten hebben aangegeven generatie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) vanaf pinang bestanddelen onder alkalische condities [6, 7]. Door de aanwezigheid van kalk in betel quid-preparaat, speeksel pinang kauwers 'verandert gewoonlijk van neutrale tot alkalische omstandigheden een ideaal voor het genereren van ROS kunnen zijn [7]. Nair et al. [6] hebben ook opgemerkt dat er naast ARC, auto-oxidatie van areca-noot polyfenolen kunnen genereren H 2O 2 en superoxide radicalen bij alkalische pH.
In de staat Meghalaya, India, de verscheidenheid van areca moer, plaatselijk genaamd 'kwai', wordt gebruikt als onrijpe en onbewerkte vorm die hogere gehalten alkaloïden, polyfenolen en tannines heeft vergeleken met gedroogde toestand [8]. De betel-quid gebruikt in Meghalaya bevat ruwe areca-moer (RAN), kalk plakken en klein gedeelte van betelnoten-leaf zonder tabak en andere bestanddelen. Hier mensen slikken het hele quid na het kauwen in plaats van het uit te spugen die een belangrijke factor voor ESCC en maagkanker kan zijn. Onlangs, 40% slokdarmkanker monsters verzameld van patiënten van Meghalaya staat met slechts RAN-kauwen gewoonte toonde schrapping van de microsatelliet markers D9S1748 en D9S1749, dicht bij 1β van CDKN2A /ARF
gen exon op 9p21. De promotor hypermethylering van CDKN2A
gen was significant hoger in de monsters met de gewoonte van RAN-kauwen alleen dan die met de gewoonte van het gebruik van zowel RAN en tabak [9]. Tot nu toe hebben we niet veel weten over het oorspronkelijke pad gaat in betelnoot geassocieerd carcinogenese in de slokdarm en de maag. Het is ook moeilijk om de effecten van zuiver en voornamelijk Areca-nut-geïnduceerde genetische veranderingen in humane beoordelen zonder inmenging van andere samengestelde factoren zoals tabak kauwen of roken, alcohol, verschillende soorten non-vegeterian voedsel etc. Bovendien zal de aanwezigheid van kalk maakt een alkalisch voorwaarde die niet ideaal is voor in vitro
celkweek en daarmee het effect van areca-noot kan niet getest worden in celkweek systemen. Gezien deze, werd dit onderzoek uitgevoerd bij muizen het vermogen van RAN-extract verifiëren met of zonder kalk, kanker induceren en tegelijkertijd het expressiepatroon van bepaalde genen die een belangrijke rol in de initiële proces van carcinogenese evalueren.
De chemische samenstelling en de farmacologische werking van areca-noot zijn gemeld en beoordeeld door een aantal werknemers [10, 11]. Verschillende dierstudies hebben bevestigd dat pinang producten en betelnoten nitrosamines, de mogelijkheid om neoplastische veranderingen bij proefdieren [11] induceren. Aanzienlijke aanwijzingen dat areca-noot-alkaloïden, overwegend arecoline (ARC) zijn de belangrijkste factoren in BN-toxiciteit [11]. Werd aangetoond dat ARC kan DNA schade induceren in beenmergcellen van de muis [12] en dergelijke DNA schade kan worden verminderd wanneer ARC wordt toegediend met N-acetyl-L-cysteine ​​[13]. Daarom is het vermelden waard dat de huidige studie was niet bedoeld om enige actieve ingrediënten uit de RAN te isoleren en haar optreden te kijken. Het doel van de studie was de oorspronkelijke route betrokken bij RAN geassocieerd carcinogenese in muizen en muizen identificeren daardoor kregen de hele RAN-extract met en zonder kalk om de consumptie gewoonte menselijke nabootsen.
Verschillende genen, zoals p53 , p65, securine Kopen en vele andere, is bekend dat ze gewoonlijk overexpressie in carcinogenese [14-16]. Bovendien is genetische instabiliteit ook geassocieerd met chromosomale instabiliteit (CIN), die leidt tot aneuploïdie, een kenmerk van kanker. Dergelijke aneuploidy kan het ontstaan ​​van tumoren te vergemakkelijken door het verlies van de tumor suppressor gen-functie. Waargenomen is dat de gedeeltelijk verlies mitotische controlegenen leidt tot CIN in menselijke kankercellen [17, 18]. Daarom is in de huidige studie onderzochten we de expressie patroon van p53, p65, securine
en een aantal mitotische en assemblage van de spoel checkpoint genen op verschillende tijdstippen. We zagen dat RAN maagkanker kan veroorzaken door het verstoren van de componenten van het chromosoom segregatie machines.
Methoden
Bereiding van extracten
Na de beschietingen de vezelige lagen van onverwerkte rauwe en onrijpe areca-moer (RAN), 100 g RAN werden gemalen en gesuspendeerd in 125 ml gedestilleerd water en grondig gemengd om een ​​gladde pasta te geven voor de bereiding van een waterig extract van RAN. Na 24 uur werd het deeg gedurende 3 uur bij 37 ° C en het waterige extract werd verzameld door centrifugeren. Deze extractieprocedure werd nogmaals herhaald door toevoegen van 125 ml water aan het residu. Beide extracten werden samengevoegd, hetgeen 100 g RAN in 250 ml gedestilleerd water, gefiltreerd en ingevroren bij - 80 ° C. Het filtraat werd gevriesdroogd in een Secfroid Lyolab BII Lyophilizer (Denemarken). Het gelyofiliseerde massa werd bij 4 ° C tot gebruik bewaard. Het extract bevatte 0,9 g /100 g water extraheerbare materiaal.
Dieren onderhoud en behandeling
Zwitserse albino muizen (25-30 g), 2-3 maanden oud werden in het laboratorium in de gemeenschap kooien in een kamer met onderhouden gecontroleerde temperatuur (20 ± 2 ° C) en regelbare verlichting (12 uur licht, 12 uur donker). Standaard muis voeding (NMC Oil Mills Ltd, Pune, India) en water ad libitum
werden gebruikt in alle experimenten. De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen en door ons goedgekeurd "Institutionele Normen voor Animal Care en gebruik" van Commissarissen.
In Set-1, drie groepen muizen (n = 25 in elk) werden genomen, die op verschillende werden gebruikt tijdstippen voor verschillende experimentele analyse. In Set-2, drie groepen muizen (n = 15 elk) werden overwogen voor tumorinductie studies. Figuur 1 geeft een schematisch overzicht over de totale experimentele protocol dat werd geacht in deze studie. In elke set, werd één groep behandeld met eenvoudige drinkwater beschouwd als onbehandeld te zijn, terwijl twee groepen werden toegediend RAN extraheren ad libitum
in het drinkwater, met of zonder kalk (pH 9,8). Er werd geschat dat elke muis verbruikte 1 mg extract per dag. Dergelijke orale administeration werd gedurende 60 dagen, waarna de dosis werd verhoogd van 1 mg tot 2 mg per dag tot 120 dagen. Evenzo, elke 60 dagen later werd de dosis verhoogd met 1 mg per dag consumptie. Figuur 1 Stroomdiagram van experimentele opzet voor de analyse van ruwe pinang gemedieerde carcinogenese in muizen. RAN- ruwe areca-noot; d- dagen.
Bereiding van metafasen en scoren chromosoomafwijkingen
Voor metafase bereiding beenmergcellen (BMC) werden verzameld van twee muizen per punt van onbehandelde, 15 en 30 dagen behandelde groep en drie muizen per punt voor de rest. In de behandelde groepen werden BMC verzameld na 15, 30, 60, 120 en 180 dagen behandeling. BMC werden verzameld van de twee muizen die maagtumor. BMC werden verzameld na 2 uur colchicine (15 mg /kg). De dieren werden gedood door cervicale dislocatie. De bovenbenen werden ontleed uit en de BMC werden gespoeld door het injecteren van 2 ml 0,075 M KCl voorverwarmd tot 37 ° C. Cellen werden in hypotone oplossing behandeld gedurende 15 min en gefixeerd in azijnzuur en methanol (1: 3). Objectglaasjes werden bereid door de vlam droogmethode, gekleurd met 5% Giemsa gedurende 5 min en bevestigd in synthetische medium. Beelden van metafase spreads werden genomen in het kader Zeiss Axioskop microscoop (Duitsland).
Voor chromosomaal onderzoek werden de dia's gecodeerd in het wilde weg en ten minste 100 goed gespreid metafase platen werden geselecteerd voor de studie van elke muis. We voerden chromosoom rekent op metafase spread. Chromosoomafwijkingen werden gescoord als isochromatide pauzes en chromatide breuken. Zie Uitgebreide Experimentele Procedures voor details in de Extra file. 1: Aanvullende informatie
Immunoblottingtest
Cellen uit beenmerg, slokdarm (door krabben binnenste laag) en de maag (door krabben binnenste deel) werden tweemaal gewassen met PBS (fosfaat gebufferde saline) en werden gelyseerd in radioimmuno-precipitatie buffer (0,1% SDS, 2 mM EDTA, 1% NP-40, 1% natriumdeoxycholaat, 50 mM natriumfluoride en 100 U /ml aprotinine). Na 30 min incubatie op ijs werden de cellysaten gecentrifugeerd gedurende 15 minuten bij 4 ° C en de hoeveelheid eiwit werd bepaald met behulp van de bicinchoninezuur eiwit assay. Gelijke hoeveelheid eiwit (40 ug) van elk monster in elk putje geladen; gelijke hoeveelheden werd verder geverifieerd door immunoblotting met actine antilichamen. Monsters werden geladen in Novex Tris-Glycine 4-20% gradiënt gels en elektroforese werd uitgevoerd in NuPAGE elektroforesesysteem (Invitrogen, USA). Eiwitten werden overgebracht naar een polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan (Sigma) volgens standaard protocol. De membranen werden gehybridiseerd met een 1: 1000 verdunning van een monoklonaal antilichaam tegen p53
(Pab 240, AB-26, Abcam, USA), Bax
(6A7, ab5714, Abcam, USA), securine
(DCS-280, ab3305; Abcam, USA), β-actine
(AC-15; ab6276; Abcam, USA) en konijn polyklonaal antilichaam tegen NF-P65 κβ
(ab31481; BCAM, USA). Blots werden 3 maal gewassen gedurende 10 min elk in TBST buffer pH 7,6 (1 M Tris Cl, 5 M NaCl en 0,05% Tween 20) en geïncubeerd met secundair antilichaam (alkalisch fosfatase geconjugeerd anti-muis IgG of alkaline-fosfatase geconjugeerd antirabbit IgG 1: 2000; Abcam, USA) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Na uitgebreid wassen werd de blot ondergedompeld in 4 ml substraatoplossing van BCIP /NBT (Bangalore genei, India). Voldoende kleuring werd verkregen binnen 15 min. Elk immunoblotting werd uitgevoerd in drie muizen per-point.
Histopathologisch evaluatie
Maag weefsel werd uit onbehandelde controle verzameld en uit twee RAN + lime behandelde muizen met een tumor. In een andere set werd maagweefsel ook verzameld van onbehandelde en uit de groepen die behandeld gedurende 300 dagen bij RAN-extract met en zonder kalk. Drie muizen werden willekeurig gekozen uit elke groep. Deze muizen leverde geen aanwijzingen van de tumor buiten hebben. Weefsel secties (5-7 micrometer) werden verwerkt voor histologische coupes als per standaard protocol [19] en gekleurd met hematoxyline en eosine [20]. Secties werden vervolgens bekeken onder een lichtmicroscoop en gefotografeerd (Carl Zeiss, Duitsland).
RNA-extractie en conventionele RT-PCR-analyse
Cellen werden verzameld door krassen binnenlaag van slokdarm en maag van onbehandelde controle, en RAN RAN + lime behandelde muizen (drie muizen per punt). Beenmerg cellen werden uit het dijbeen van de muis. Totaal RNA werd geïsoleerd met Trizol en daarna gezuiverd met de RNeasy Mini Kit (Qiagen) volgens het protocol van de fabrikant. Reverse transcriptie werd uitgevoerd met 1 ug totaal RNA uit elk monster met behulp Quantiscript Reverse Transcriptase, Quantiscript RT-buffer en RT-primer mix van QuantiTect reverse transcriptie kit (Qiagen GmbH, Hilden, Duitsland) volgens het protocol van de fabrikant. Amplificatie van cDNA werd uitgevoerd in 20 ul oplossing die 2 pi cDNA, 10 pmol primer paren voor aurora A, dageraad B, Mad2, Bub1 en GAPDH (voor primersequenties, zie Extra file 1: Aanvullende informatie), respectievelijk, en 10 ul van RT qPCR Master mix (Qiagen GmbH, Hilden, Duitsland). De PCR bestond uit initiële denaturatie bij 94 ° C gedurende 5 minuten, gevolgd door 30 reactie cycli (30 seconden bij 94 ° C, 30 seconden bij 60 ° C en 30 seconden bij 72 ° C) en een laatste cyclus bij 72 ° C gedurende 10 min. GAPDH werd gebruikt als interne controle. Alle PCR-producten werden elektroforetisch gescheiden op met ethidiumbromide gekleurde agarosegel en zichtbaar gemaakt met UV-licht.
Flow cytometrische analyse van cellen
Muis beenmergcellen en de cellen verzameld door krassen op de binnenste laag van de slokdarm en de maag van beide behandeld en gedurende 260 dagen bij RAN dan niet met kalk werden gefixeerd met 70% ethanol. Maagtumor cellen werden verzameld en gefixeerd. De gefixeerde cellen werden gewassen in PBS en geresuspendeerd in 500 ul propidiumjodide-oplossing (50 ug /ml propidiumjodide, 0,2 mg /ml RNase) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. 10.000 cellen werden verkregen voor elk monster en geanalyseerd met een FACS Calibur (Becton Dickinson). CELLQuest Pro software werd gebruikt om celcyclus compartimenten kwantificeren het percentage cellen verdeeld in de verschillende fasen van de celcyclus te bepalen.
Annexine V labeling studies
Apoptotische celdood werd beoordeeld volgens annexinV fluoresceïne isothiocyanaat methode in de maag tumorcellen en in de binnenste laag van cellen van de maag en de slokdarm van onbehandelde en RAN met en zonder kalk behandelde muizen na 260 dagen continu administeration. De celpellet werd geresuspendeerd in PBS. Cellen werden gekleurd met propidiumjodide en annexine-V-FITC met behulp BD PharmingenTM Annexine V: FITC Apoptose Detectie Kit (BD-Pharmingen Biosciences, San Diego, CA) volgens instructies van de fabrikant. Kort na het verzamelen en tweemaal wassen met PBS werden cellen geresuspendeerd in bindingsbuffer (500 ui). FITC-annexine-V (5 ui) werd aan de cellen, gevolgd door toevoeging van 5 ul PI volgens het protocol toegevoegd. De monsters werden vervolgens gedurende 15 minuten in het donker bij kamertemperatuur en onderworpen aan flowcytometrie evalueren.

Statistische analyse Waarden worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM of gemiddelde ± SEM van controle en experimentele monsters en statistische analyses werden uitgevoerd door t-test van Student met GraphPad Prism-software 5.1. De waarden waren statistisch significant beschouwd als de p-waarde was 0,05 of minder.
Resultaten
Algemene opmerkingen
van de vijftien muizen, twee muizen ontwikkelden maagkanker na 220 en 256 dagen van het voeden van RAN te extraheren met kalk (Figuur 2A a en b). Geen tumor werd ontwikkeld in muizen ofwel onbehandeld of toegediend met alleen RAN. De histologische sectie duidelijk onderscheid tussen normaal (Figuur 2A c) en tumor maag (Figuur 2A d-f). Echter, werd histologische bereiding van de maag weefsel ook gemaakt van drie ogenschijnlijk normaal uitziende muizen willekeurig gekozen uit deze groep na 300 dagen van het voeden met RAN-extract met en zonder kalk. RAN zowel met als zonder kalk vertoonden het vermogen om kanker te veroorzaken in de maag. Twee van de drie muizen die met alleen RAN toonde precancereuze fase (dysplasie), terwijl alle drie muizen behandeld met RAN + lime bleek carcinoom (figuur 2B). Figuur 2 ontleed muis en histopathologie van zowel de normale en tumorweefsel van de maag na behandeling met RAN met en zonder kalk. A. ontleed muis met (a) normale maag en (b) tumorachtig maag aangegeven met een pijl. Histopathologie van normaal (c) en maagtumor (d, e en f) geïnduceerd door RAN extract met kalk. De pijlen geven zweren neoplasma in (d) en tumor reusachtige cellen in (e en f). De vergroting is aangegeven, hetzij 10X of 40X. B. Histopathologie van normale en tumor maag van muizen na RAN en RAN + lime behandeling voor 300 dagen. In alle panelen, "Normal" geeft muizen zonder tumor, "dysplasie" betekent muizen met precancerous maagweefsel. "Carcinoom" geeft muizen met tumor maag. Dysplasie toont anisokaryosis (variatie in grootte kernen) en anisocytose (variatie in grootte van cellen). De vergroting is aangegeven, hetzij 10X, 40X en 100X.
Bestudeerd metafase spreads
Om te bepalen of een continue administeration van RAN extract (15-180 dagen) met of zonder kalk enig effect heeft op de chromosomen, bestudeerden we metafase spreads na 2 uur behandeling met colchicine, in beenmerg monsters. Gegevens onthulde een geleidelijke toename van mitotische figuren met voortijdig gescheiden zusterchromatiden (figuur 3A en C) zowel RAN en RAN + lime toegediend muis, tegenover geen in onbehandelde muizen. Het is ook duidelijk uit de studie dat RAN + lime toegediend muisbeenmerg toonde significant hogere frequentie van dergelijke vroegrijpe anafase dan alleen RAN toegediend (figuur 3A). Na 180 dagen continu administeration van RAN + lime, 34,4% vroegrijpe anafase, vergeleken met 18,4% (p = 0,002) in-RAN toegediend muis BMC werden gezien. Figuur 3 Karyotype analyse van genomische instabiliteit in beenmergcellen van muizen na blootstelling aan RAN extract met (RAN + L) of zonder kalk (RAN). (A) Percentage van metafasen met vroegtijdige zus-chromatid scheiding. Twee muizen per punt voor onbehandelde, 15 en 30 dagen van de behandelde groep en drie muizen per punt voor de rest. Tenminste 100 metafasen werden gescoord voor elke muis. (B) Normaal metafase spread van beenmergcellen van de muis. (C) Premature zuster-chromatid scheiding van muizen blootgesteld aan RAN. Haakjes geven zuster-chromatids liggen gescheiden in mitotische cijfers die het fenotype te tonen. (D en E) metafase spread toonde 37 en 38 chromosomen, respectievelijk. (F, G en H) metafase spread vertoonden meer dan 60 chromosomen. (I) vertoonde meer dan 80 chromosomen.
We telden het aantal chromosomen in de metafase verspreidt de betekenis van vroegrijpe anaphases met betrekking tot chromosoom stabiliteit begrijpen. De onbehandelde muizen een stabiele (2n = 40) karyotype (figuur 3B) en geen aneuploïde cellen vertonen. We hebben acht lage frequentie aneuploïde cellen (Figuur 3D-I, Tabel 1) in-RAN toegediend met en zonder kalk, gedurende 120 dagen en werd opgemerkt dat de frequentie van aneuploïde cellen geleidelijk werd verhoogd. De gemiddelde frequentie (13,8%) van aneuploïde cellen werd gescoord in zowel de maag tumordragende muizen. Over het algemeen, de frequentie van aneuploïde cellen was meer volgende RAN + lime administeration dan alleen RAN (tabel 1) .table 1 chromosoom analyse van beenmergcellen van de muis na blootstelling aan RAN te extraheren met of zonder kalk
Behandeling patroon

Behandeling dagen
Total spread scoorde
Chromosome no.
Aneuploidy
Premature zus

37
38
39
40
41
42
> 60

% (Mean)
chromatidetype scheiding%
Onbehandeld
0
110
110
0
0
104
104
0
0
RAN
120
105
1 1
103
1.9
17,5
120 Pagina 2
1 2
115
4.1
18,7
105
1 2
102
2.8 (2.9)
18,3 (18,2)
RAN + lime
100 2
2 1
95
5.0
31,7
105 Pagina 2 2
3
98
6.6
28,6
110
3 2
1
103 1
6.4 (6.0)
28,3 (29,5)
p = 0.015a
RAN
180
101 1
2 1
97
3,9
18,0
124 pagina 2
2 1
119
4,0
17,7
114
3 2
1
108
5,3 (4,4) 19,4
(18,4)
RAN + lime
112
3
3
3
103
8,0
32,6
105 2
2
1
98
1 1
6.6
34,9
110 verhuur 4 2
101 2
1
8.2 (7.6)
35,6 (34,4)
p = 0.002a
RAN + lime
220
232
6
9
12
194
7 Pagina 2 2
16,4
8.2
(met geavanceerde tumor)
256
234
5 verhuur 4
7
208
5 2
3
11,1 (13,8)
7.1 (7.6)
een statistisch significant in gepaarde t-test; tweezijdige p-waarde werd vertoond.
Chromosoomafwijkingen werden voornamelijk gescoord als chromatide breuken. Zeer lage frequentie van isochromatide breaks werd waargenomen en geen uitwisseling afwijkingen werden gevonden. De frequentie van chromatide breuken en afwijkende metafasen werd geleidelijk verhoogd 60-180 dagen van RAN-administeration met of zonder kalk. De frequentie van aberraties was meer volgende RAN + lime administeration dan alleen RAN. De frequentie van aberraties was in zowel de gevorderde maag tumordragende muizen. (Voor aberratie details, zie Extra file 1: Aanvullende informatie).
Verminderde expressie van mitotische en spindle checkpoint genen in-RAN behandelde muizen
In het licht van het bovenstaande studies onderzochten we de expressie van AuroraA, AuroraB, Mad2 Kopen en Bub1
genen in beenmerg, slokdarm en maag cellen die muizen die onbehandeld of toegediend RAN extract waren met en zonder kalk voor 120, 180 en 260 dagen. De conventionele RT-PCR-resultaten (figuur 4) toonde dat cellen verzameld van slokdarm en maag vertoonden meestal onder-expressie van deze genen met betrekking tot onbehandelde en zulks onder-expressie was consistent en significant RAN + lime muizen toegediend. Echter, de expressie van al deze genen in BMC niet veranderen op significante wijze met uitzondering van overexpressie van Mad2 Kopen en Bub1
werd opgemerkt in het BMC van de muis verzameld na 260 dagen van administeration. Figuur 4 Upper panel- Expressie van mitotische checkpoint genen in muizen beenmerg (BM), slokdarm en maag cellen na blootstelling aan RAN extraheer met of zonder kalk voor 120, 180 en 260 dagen. Lagere panel- kwantitatieve densitometrische analyse van het expressieprofiel van mitotische checkpoint genen mRNA niveau slokdarm en maag cellen na 260 dagen blootstelling krijgt. De waarden zijn het gemiddelde ± SEM van drie onafhankelijke experimenten. De waarden zijn genormaliseerd op GAPDH respectievelijke waarden. * P < 0,05; ** P < 0,01; *** P < 0.001. Significant verschillend in vergelijking met een negatieve /positieve controle (zoals bepaald door gepaarde t-test).
Analyse van de over-expressie van genen door middel van immunoblotting
Niveaus van p53, p65, Bax Kopen en securine
in BMC van muizen na administeration RAN extraheer met of zonder kalk voor 60, 90 en 180 dagen, en de slokdarm en maag na 180 dagen voeren werden onderzocht door immunoblotting. Niveaus van deze eiwitten werden getest door het restmateriaal-wise van de onbehandelde muizen cellen. Resultaten geven aan dat de expressie van p53, p65, Bax Kopen en securine Wat zijn significant verhoogd in alle weefsels in muizen RAN toegediend. Deze verhoging was significant hoger in RAN + lime dan slechts RAN toegediende muizen (Figuur 5). Figuur 5 Upper panel- Representative western blotting detectie van p65, p53, securine, bax en β-actine in muis beenmerg (BM), slokdarm en maag cellen na blootstelling aan RAN extraheer met of zonder kalk. Voor BM, werden de cellen verzameld na 60, 120 en 180 dagen, terwijl voor slokdarm en de maag, werden de cellen pas na 180 dagen van blootstelling verzameld. ß-actine werd gebruikt als ladingcontrole. Lagere panel- kwantitatieve densitometrische analyse van het eiwitgehalte van de genoemde genen in het beenmerg, slokdarm en maag cellen na 180 dagen blootstelling krijgt. De waarden zijn het gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke experimenten. De waarden zijn genormaliseerd aan respectieve β-actine waarden. * P < 0,05; ** P < 0,01 Significant verschillend vergeleken met een negatieve /positieve controle (zoals bepaald door gepaarde t-test).
Flowcytometrische studies celcyclus en detectie van apoptotische cellen door dubbele kleuring en immunoblotting
Flow cytometrische analyse van het DNA-gehalte in het beenmerg , slokdarm en maag cellen van muizen verzameld na 260 dagen RAN + lime toediening (figuur 6A), toonde aan dat er een toename G1-fase cellen zowel in het beenmerg en de slokdarm opzichte van onbehandelde controle. Echter, in de maag, het percentage cellen in sub-G1 fase werd verhoogd, wat kan worden toegeschreven door apoptotische celdood. Om dit te bevestigen, dubbele kleuring met annexinV en PI werd uitgevoerd. Gegevens in Figuur 5B leiden tot een hoger positieve kleuring met Annexine-V in kwadrant 2 en 3 in de maag cellen, maar niet in cellen van slokdarmkanker RAN + lime muizen toegediend. Figuur 6 Analyse van de celcyclus en apoptose in muizen behandeld met RAN met kalk (A) Analyse van de celcyclus na 260 dagen blootstelling met RAN extraheer met kalk in beenmerg, slokdarm en maag cellen van muis en ook uit de maag tumorcellen. (B) Representatieve cytogrammen Annexine V versus PI fluorescentie intensiteiten zoals bepaald door flow cytometrische analyse muis slokdarm en maag cellen na 260 dagen blootstelling met RAN met kalk en maag- tumorcellen. Binnen cytogram, kwadrant 1 en 2 vertegenwoordigen vroege en late apoptotische cellen, respectievelijk; kwadrant 3, levensvatbare cellen; kwadrant 4, dode cellen. (C) Western blotting voor apoptotische merkers in normaal (onbehandelde) en maag tumorcellen. β-actine werd gebruikt als ladingcontrole.
Interessant stroom cytometrische analyse van tumorcellen verzameld van muizen die tumoren in de maag ontwikkeld na 220 en 256 dagen continu administeration van RAN en kalk, onthulde significante vermindering in G1 cellen met een daarmee samenhangend het sub-G1-cellen (Figuur 6A). Dubbele kleuring geeft aan dat sub-G1 cellen meestal necrotische dode cellen (kwadrant 4) (Figuur 6B). Significant hoger niveau van p53 Kopen en Bax
eiwitten werden waargenomen in tumor dan normaal maag cellen (figuur 6C). Echter, werd PARP, vond afwezig is in zowel de tumor cellen van de maag te zijn, hoewel PARP Kopen en haar 29 kD gesplitst product aanwezig zijn in de normale maag monsters (figuur 6C) waren.
Discussie
De huidige studie werd uitgevoerd om te zien of ad libitum
administeration van RAN te extraheren met of zonder kalk in het drinkwater kan slokdarm of maagkanker veroorzaken in de muis en zo ja, wat de eerste processen betrokken zijn. In dit onderzoek werden de muizen de volledige RAN-extract met en zonder kalk om de menselijke consumptie beroemd RAN nabootsen. Bovendien werd de dosis ook periodiek verhoogd als het gebeurt tot mens. Onze resultaten toonden dat zowel RAN met en zonder kalk induceren maagkanker, hoewel wordt opgemerkt dat de aanwezigheid van kalk met RAN bevorderd hogere celtransformatie en daardoor maagkanker ontwikkeld vroegste RAN alleen. Het blijkt dat de kanker werd geïnduceerd in maag als gevolg van de grotere blootstelling de voering moesten RAN terwijl de slokdarm voering slechts kort blootgesteld tijdens het drinken RAN mengwater.
Eerder is aangetoond dat een alkalische pH is ideaal voor het opwekken ROS door auto-oxidatie van areca-noot polyfenolen [6, 7]. Ook bleek dat de catechine fractie pinang extract actief genereert ROS bij alkalische pH die DNA schade in vitro
induceert [21, 22]. Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.

• Expressie van een LINE-1 endonuclease variant bij maagkanker: de associatie met klinisch-pathologische parameters
• Gastrobeschermende mechanisme van Paederia foetida Linn. (Rubiaceae) - een populaire eetbare plant gebruikt door de tribale gemeenschap van Noord-Oost India