Indukcia nestability chromozómov a rakoviny žalúdka zmenou expresného profilu mitotických kontrolných bodov génov u myší vystavených areku-nut

Indukcia nestability chromozómov a rakoviny žalúdka zmenou expresného profilu mitotických kontrolných bodov génov u myší vystavených areku maticou
Abstract
pozadí
Existujú silné náznaky, na príčinnej súvislosti medzi spotrebou areku maticou a rakoviny. V Meghalaya, India, rôznorodosť areku maticou sa používa ako surové a nespracované forme, ktorého chemické zloženie a farmakologické účinky boli hlásené. Zatiaľ vieme len málo o počiatočnom dráhy zapojené do areku maticou spojené karcinogenézy, pretože je ťažké posúdiť jeho vplyv na genetických zmien bez rušenia iných zmiešavacích faktorov. Preto sa táto štúdia bola vykonaná na myšiach overiť schopnosť surového Areca-matice (RAN) na vyvolanie rakoviny a sledovať expresiu určitých génov zapojených do rakoviny. Táto štúdia nebola určená na izoláciu akejkoľvek aktívnej zložky z RAN a hľadať svoju činnosť.
Metódy
Tri skupiny myší (n = 25 v každej) boli odobraté a použité v rôznych časových bodoch pre rôzne experimentálne analýzy , Ďalšie tri skupiny myší (n = 15 v každej) boli považované za tumoru štúdie. V každej sade, dve skupiny boli podávané rán extraktu ad libitum
v pitnej vode s alebo bez vápna. Expresie niektorých génov bola stanovená konvenčnými RT-PCR a imuno-blottingom. Myši dostali celú RAN-extraktu a bez vápna za účelom napodobenia ľudskú spotrebu štýl RAN.
Výsledky
histologického prípravu žalúdočné tkaniva, ukázal, že RAN indukované rakoviny žalúdka. Postupný nárast početnosti predčasné anaphase a aneuploidních buniek bolo pozorované v bunkách kostnej drene s väčším prírastku nasledujúcich RAN + vápenné administeration. Hladiny p53, Bax, Securin stroje a P65
v pažeráku a žalúdku bunky boli zvýšené počas prvých dní expozície RAN zatiaľ čo tí rôznych mitotický kontrolných bodov proteíny boli downregulated. smrti apoptotických buniek bol zistený u non-rakovinových buniek, žalúdka, ale nie v nádorových bunkách, ktoré ukazovali zvýšenú expresiu Bax stroje a neprítomnosti PARP
.
Záver
tejto štúdii navrhnuté (a) RAN indukuje rakoviny žalúdka, však, prítomnosť vápna podporoval vyššiu transformáciu buniek, a tým aj rakovinu skôr, (b) odchýlky v zložkách segregácie chromozómov strojového zariadenia by mali byť zapojení v počiatočnom procese karcinogenity a (c) významu predčasné anaphase ako skríningového markeru pre identifikáciu mitotických kontrolných bodov vád počas prvých dní.
Kľúčové slová
Chromozóm nestabilita mitotického checkpoint gény Securin
apoptóza pozadí
pažeráka spinocelulárny karcinóm (ESCC) a žalúdočné rakoviny sú najbežnejšie druhy rakoviny v Indii s najvyššou výskyt ESCC bytia v severovýchodných štátoch Indie [1]. Existujú silné náznaky, na príčinnej súvislosti medzi areku maticou alebo quid žuvacie návyky a týmito nádory. Niekoľko štúdií u rôznych druhov zvierat preukázali pozitívny indukcii nádorov v oboch cieľových (líca-vak, pažeráka a žalúdka) a non-cieľ (pľúca a pečeň) tkanív, kedy bol arekolin (ARC) alebo Areca-nut extrakt podávané rôznymi spôsobmi takých ako orálny intubáciou [2], zmieša sa s diétou [3], a aplikáciu na tvár-vačku [4]. Z tohto dôvodu sa zdá, že je potreba metabolickej aktivácie alkaloidov na konečnej konverziu do konečných karcinogénov, ktorá je silne ovplyvnená fyziologickými podmienkami a prítomnosť určitých faktorov [5]. Podľa správ generáciu reaktívnych foriem kyslíka (ROS) z Areca matice zložiek za alkalických podmienok [6, 7]. Vzhľadom k prítomnosti vápna v betel-quid prípravy, sliny Areca matice chewers 'zvyčajne mení od neutrálne až alkalické podmienky, ktoré by mohli byť vhodné pre tvorbu ROS [7]. Nair a kol. [6] tiež poznamenať, že okrem ARC, auto-oxidácia Areca-orechové polyfenolov mohlo generovať H 2O 2 a superoxid radikálmi pri alkalickom pH.
V štáte Meghalaya, India, rozmanitosť Areca orech, lokálne nazvaný "Kwai ', sa používa ako nezrelé a nespracované surovej forme, ktorá má vyšší obsah alkaloidov, polyfenolov a trieslovín v porovnaní s sušenej forme [8]. Betel-quid použitý v Meghalaya obsahuje surové Areca maticu (RAN), Vápenná kaša a malú časť alebo betel listom bez tabaku a ďalších zložiek. Tu ľudia prehltnúť celú libier po žuvaní namiesto toho pľuvať von, ktoré by mohli byť dôležitým faktorom pre ESCC a žalúdka rakovinu. V poslednej dobe sa 40% vzoriek rakoviny pažeráka odobraté od pacientov Meghalaya štátu, ktoré majú iba RAN-žuvanie zvyk ukázalo vypustení mikrosatelitních markerov D9S1748 a D9S1749, ktorý sa nachádza v blízkosti exónu 1β z CDKN2A /ARF
génu na 9p21. Promotér hypermetylace z CDKN2A
génu bola významne vyššia vo vzorkách s zvyku RAN-žuvanie samotným ako tie, ktoré majú vo zvyku použitie ako pribehol a tabaku [9]. Doteraz nevieme, veľa na pôvodnú dráhe je obsiahnutý v betel-nut spojené karcinogenézy v pažeráku a žalúdku. Je tiež ťažké posúdiť účinky čisto a prevažne Areca-nut vyvolaného genetické zmeny v ľudskom bez rušenia inými zmiešavacích faktoroch, ako je tabakový žuvanie alebo fajčenie, konzumácia alkoholu, rôzne druhy non-vegetariánskej potraviny apod Okrem toho prítomnosť vápno je alkalické stav, ktorý nie je vhodný pre in vitro
bunkovej kultúre, a tým aj vplyv areku maticou nemôže byť testovaná v systémoch bunkových kultúr. S ohľadom na tieto, táto štúdia bola vykonaná na myšiach za účelom overenia schopnosti RAN extraktu s alebo bez vápna, vyvolať rakovinu a zároveň vyhodnocovať expresného profilu určitých génov, ktoré hrajú dôležitú úlohu v počiatočnom procese karcinogenézy.
chemické zloženie a farmakologické účinky areku maticou boli zaznamenané a preskúmané niekoľkých pracovníkov [10, 11]. Niekoľko štúdií na zvieratách potvrdili, že Areca-orechové výrobky a alebo betelové špecifické nitrozamíny, majú schopnosť indukovať neoplastických zmien v pokusných zvierat [11]. Značné dôkazy naznačujú, že Areca-nut-alkaloidy, prevažne arekolin (ARC) sú hlavnými faktormi BN-toxicity [11]. Ukázalo sa, že oblúk môže spôsobiť poškodenie DNA v bunkách myší kostnej drene [12] a tieto DNA poškodenie sa môže znížiť, ak je podávaný s ARC N-acetyl-L-cysteínu [13]. Z tohto dôvodu je potrebné spomenúť, že súčasná štúdia nebola určená na izoláciu akejkoľvek aktívnej zložky z RAN a hľadať svoju činnosť. Cieľom tejto štúdie bolo zistiť počiatočné dráhy zapojené do RAN spojená karcinogenéze u myší, a teda myši dostali celú RAN-extrakt a bez vápna, aby sa napodobniť spotreby zvyku človeka.
Niekoľkými génov, ako je p53 , P65, Securin stroje a mnoho ďalších, je známe, že zvyčajne nadmerne vystavený v priebehu karcinogenézy [14-16]. Okrem toho, genetická nestabilita je tiež spojené s nestabilitou chromozómu (CIN), čo vedie k aneuploidie, charakteristickým znakom rakoviny. Ako aneuploidie môže uľahčiť tumorigenezi prostredníctvom straty funkcie nádorový supresorový gén. Bolo zistené, že čiastočná strata mitotického ovládanie kontrolného bodu vedie k CIN v ľudských nádorových bunkách [17, 18]. Preto sa v tejto štúdii sme hodnotili expresného profilu p53, P65, Securin stroje a niekoľko mitotické a Vreteno kontrolných bodov génov v rôznych časových bodoch. Pozorovali sme, že RAN môže spôsobiť rakovinu žalúdka zneklidňování zložiek Segregácia chromozómov strojov.
Metódy
Príprava extraktov
Po vybratí vláknitého kabáty z nespracovaného surového a nezrelé areku maticou (RAN), 100 g RAN boli rozdrvené a suspenduje sa v 125 ml destilovanej vody a dôkladne sa premieša, čím sa získa hladké pasty pre prípravu vodného extraktu RAN. Po 24 hodinách sa pasta sa mieša počas 3 hodín pri teplote 37 ° C a vodný extrakt sa oddelí odstredením. Tento extrakčný postup sa opakuje ešte raz pridaním 125 ml vody ku zvyšku. Obidva extrakty boli spojené, čo predstavuje 100 g RAN v 250 ml destilovanej vody, filtruje sa a zmrazia pri - 80 ° C. Filtrát sa vysuší zmrazením v Secfroid Lyolab BII mrazový (Dánsko). Lyofilizovaný Zmes bola udržiavaná pri teplote 4 ° C až do použitia. Extrakt obsahoval 0,9 g /100 g vody extrahovateľný materiál.
Zvieratá sanáciu a ošetrenie
Swiss albino myší (25-30 g), 2-3 mesiacov boli udržiavané v laboratóriu v komunitných klietkach v miestnosti s riadenou teplotou (20 ± 2 ° C) a umelým osvetlením (12 h svetlo, 12 h tma). Štandardné myš strava (NMC Oil Mills Ltd., Pune, India) a voda ad libitum
boli použité pri všetkých pokusoch. Experimenty sa vykonávali v súlade s inštitucionálnymi smernicami a schválená naše "Inštitucionálne štandardy pre starostlivosť o zvieratá a použitie" nastúpi.
Set-1 tri skupiny myší (n = 25 v každej) boli prevedené, ktoré boli použité pri rôznych časových bodoch pre rôzne experimentálne analýzy. V Set-2 tri skupiny myší (n = 15 v každej) boli považované za tumoru štúdie. Obrázok 1 uvádza schematický prehľad o celkovom experimentálneho protokolu, ktorý bol považovaný v tejto štúdii. V každej sade, jedna skupina sa nechá reagovať s jednoduchým pitnou vodou považovaná za bez ošetrenia, zatiaľ čo dve skupiny boli podávané ad libitum RAN extrakciu
v pitnej vode s alebo bez vápna (pH 9,8). Odhaduje sa, že každá myš spotrebovanej 1 mg extraktu denne. Ako je orálny administeration sa pokračuje po dobu 60 dní, po ktorých sa dávka zvýšila od 1 mg do 2 mg za deň do 120 dní. Rovnako tak, každých 60 dní neskôr bola dávka zvýšená o 1 mg na deň spotreby. Obrázok 1 Schéma návrhu experimentu pre analýzu surového areku maticou sprostredkované Karcinogenéza u myší. Náhodnom surové arekových matice; D- dní.
Príprava metafáz a bodovanie chromozómy
Pre prípravu metafázy, bunky kostnej drene (BMC) boli odobraté z dvoch myšou na jeden bod z neošetrených, 15 a 30 dní liečenej skupiny a tri myši na jeden bod pre zvyšok. V ošetrených skupinách, BMC boli odobraté po 15, 30, 60, 120 a 180 dňoch liečby. BMC boli odobraté z dvoch myší, ktoré majú žalúdočné nádor. BMC boli odobraté po 2 h kolchicínu liečby (15 mg /kg). Zvieratá bola zabitá cervikálny dislokáciou. Tieto stehennej kosti boli vyňaté von a BMC sa prepláchnuť injekcií 2 ml 0,075 M KCI predhriateho na 37 ° C. Bunky boli ošetrené v hypotonická roztoku po dobu 15 minút a fixované v kyseline octovej a metanolu (1: 3). Sklíčka bola pripravená podľa metódy sušenia plameňom, morenie v 5% Giemsa po dobu 5 minút a montujú v syntetickom médiu. Obrazy metafázních spreadov boli odobraté pod mikroskopom Zeiss Axioskop (Nemecko).
Chromozomálne štúdiu bola sklíčka kódované náhodne a aspoň 100 dobre rozšírených metafáze doštičky boli vybrané pre štúdie z každej myši. Vykonali sme počty chromozómov v metafáze šírenia. Chromozómy boli hodnotené ako isochromatid prestávok a chromatidové prestávky. Pozri Rozšírené experimentálne postupy pre detaily v ďalší súbor. 1: Mumbai
imuno-blottingom
buniek z kostnej drene, pažerák (škrabaním vnútornú vrstvu) a žalúdka (škriabaním vnútorná časť) boli dvakrát premyté PBS (fosfátom tlmený soľný roztok) a boli lyžovanie v radioimmuno-zrážok pufra (0,1% SDS, 2 mM EDTA, 1% NP-40, 1% deoxycholát sodný, 50 mM fluoridu sodného a 100 U /ml aprotinínu). Po 30 minútach inkubácie na ľade boli fragmenty buniek boli stočené počas 15 minút pri teplote 4 ° C a množstvo proteínu bola stanovená použitím testu bicinchoninic proteínu kyseliny. Rovnaké množstvo proteínu (40 ug) z každej vzorky bol načítaný v každej jamke; rovná nakladacia bola ďalej overená imunoblotováním s aktínu protilátok. Vzorky boli nanesené v Novex Tris-Glycín 4-20% géloch s gradientom a elektroforéza bola vykonaná v NuPAGE elektroforetické systéme (Invitrogen, USA). Proteíny boli prenesené na polyvinylidendifluoridovou (PVDF) membrány (Sigma) po štandardnej protokol. Membrány boli testované s 1: 1000 riedenie myšou monoklonálnou protilátkou proti p53
(PAB 240, ab-26; abca, USA), Bax
(6A7, ab5714; abca, USA), Securin
(DCS-280, ab3305; abca, USA), β-aktínu
(AC-15, ab6276; abca, USA) a králičie polyklonálne protilátky proti NF-P65 κβ
(ab31481, BCAM, USA). Bloty boli premyté 3-krát počas 10 minút každý v TBST pufri pH 7,6 (1 M Tris Cl, 5 M NaCl a 0,05% Tween 20) a inkubujú sa sekundárnou protilátkou (alkalickej fosfatázy konjugovanej anti-myšou IgG alebo alkalická fosfatáza konjugovaná antirabbit IgG 1: 2000; abca, USA) po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti. Po dôkladnom premytí bol blot ponorí do 4 ml roztoku substrátu BCIP /NBT (Bangalore GENEI, India). Dostatočné farbenie bolo dosiahnuté v priebehu 15 minút. Každý imunoblotování bola vykonaná v troch myšiach za-bod.
Histopatologické hodnotenie
žalúdka tkanivo bola odobraná z neošetrených kontrolných rastlín a z dvoch RAN + vápno liečených myší s nádorom. V ďalšej sade, žalúdka tkanivo bola tiež zhromaždené z neupravené aj zo skupín, ktoré liečených 300 dní s RAN-extraktu a bez vápna. Tri myši boli vybrané náhodne z každej skupiny. Tieto myši nemali žiadne známky nádoru externe. Tkanivovej rezy (5-7 um) boli spracované na histologické rezy podľa štandardného postupu [19] a zafarbené hematoxylínom a eosínu [20]. Rezy potom boli pozorované pod svetelným mikroskopom a vyfotografoval (Carl Zeiss, Nemecko).
Extrakcia RNA a konvenčné RT-PCR analýza
Bunky boli zhromaždené poškriabaniu vnútornú vrstvu pažeráka a žalúdka z neošetrenej kontroly, RAN a RAN + vápno liečených myší (tri myšou na bod). Bunky kostnej drene boli odobraté od stehennej kosti kosti myši. Celková RNA bola izolovaná pomocou TRIzolu a potom sa vyčistí pomocou RNeasy Mini Kit (Qiagen) podľa protokolu výrobcu. Reverzný transkripcie bola vykonaná s 1 ug celkovej RNA z každej vzorky za použitia reverznou transkriptasy, Quantiscript Quantiscript RT-pufer a RT Primer-mix QuantiTect reverznej transkripcie kit (Qiagen GmbH, Hilden, Nemecko) podľa protokolu výrobcu. Zosilnenie cDNA bola vykonaná v 20 ul roztoku obsahujúceho 2 ul cDNA, 10 pmol primérov párov Aurora A, Aurora B, Mad2, Bub1 a GAPDH (pre priame sekvencií Pozri doplnkovú súboru 1 Company), respektíve, a 10 ul RT qPCR Master mix (Qiagen GmbH, Hilden, Nemecko). PCR sa skladala z počiatočnej denaturácie pri 94 ° C po dobu 5 minút, nasleduje 30 reakčných cyklov (30 sekúnd pri 94 ° C, 30 sekúnd pri 60 ° C a 30 sekúnd pri 72 ° C) a konečný cyklus pri 72 ° C po dobu 10 min. GAPDH bola použitá ako vnútorná kontrola. Všetky PCR produkty boli elektroforeticky separované na etídiumbromidu postriekané agarosovém gélu a vizualizované UV svetlom.
Prietokové cytometrie buniek
myších buniek kostnej drene a bunky zhromaždené poškriabaniu vnútornú vrstvu pažeráka a žalúdka oboch neošetrené a ošetrené po dobu 260 dní sa RAN s alebo bez vápna boli fixované 70% etanolom. Žalúdočné nádorové bunky boli zhromaždené a pevné. Fixované bunky boli premyté PBS a resuspendované vo 500 ul roztoku propidium jodidu (50 ug /ml propidium jodidu, 0,2 mg /ml RNázy) po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti v tme. 10,000 bunky boli získané pre každú vzorku a analyzovaný pomocou FACS Calibur (Becton-Dickinson). CellQuest Pre softvér bol použitý pre kvantifikáciu oddelenie bunkového cyklu odhadnúť percento buniek distribuovaných v rôznych fázach bunkového cyklu. Štúdií označovanie
annexinu V
bunková smrť bola hodnotená pomocou proapoptotický AnnexinV-fluoresceinisothiokyanátem metódy v žalúdku nádorových buniek a tiež vo vnútornej vrstve buniek žalúdka a pažeráka neošetrené a RAN s a bez vápna liečených myší po 260 dňoch nepretržitého administeration. Bunková peleta sa resuspendujú v PBS. Bunky boli zafarbené propidiumjodidom a annexin-V-FITC s použitím BD PharmingenTM annexinu V: FITC apoptózy Detection Kit (BD-Pharmingen Biosciences, San Diego, CA) podľa inštrukcií výrobcu. Stručne povedané, po zhromaždení a premytí dvakrát PBS, bunky boli resuspendované vo väzbovom pufri (500 ul). FITC-annexin-V (5 ul) bol pridaný k bunkám s následným pridaním 5 ul PI podľa protokolu. Vzorky sa potom inkubujú po dobu 15 minút v tme pri teplote miestnosti a podrobí prietokovej cytometrie vyhodnotenie.
Štatistická analýza
Hodnoty sú vyjadrené ako stredná ± SEM, alebo priemer ± SEM pre kontrolné a experimentálne vzorky a štatistická analýza bola vykonaná od t-testu Studentov s GraphPad Prism softwaru 5.1. Hodnoty boli považované za štatisticky významné, pokiaľ bola hodnota p 0,05 alebo menej.
Výsledky
Všeobecné pripomienky
z pätnástich myší, dve myši rakovinu žalúdka po 220 až 256 dňoch kŕmenia RAN extrahovať s vápnom (obrázok 2A a a b). Žiadny nádor vyvinul u myší buď neupravené alebo podávať iba s RAN. Histologický rez jasne odlíšené od bežnej (obrázok 2A c) a nádorového žalúdka (obrázok 2A d-F). Avšak, histologické Príprava tkaniva žalúdka bol tiež z troch normálne hľadajú myší náhodne vybraných z tejto skupiny, po 300 dňoch podávania s RAN-extraktu a bez vápna. Ako RAN s alebo bez vápna ukázal svoju schopnosť vyvolať rakovinu žalúdka. Dvaja z troch myší liečených len RAN ukázali prekanceróznych stupeň (dysplázia), zatiaľ čo všetky tri myši liečenej RAN + vápnom ukázali, karcinóm (obrázok 2B). Obrázok 2 členitý myší a histopatológie normálnu aj nádorové tkanivo žalúdka po liečbe s RAN s a bez vápna. A. pitvali myš s (a) normálneho žalúdka a (b) nádorového žalúdka označený šípkou. Histopatológie normálneho (c) a nádor žalúdka (d, e a f), ktoré bolo vyvolané RAN extraktu vápnom. Šípky označujú vredy novotvar v (d) a tumor obrovských buniek v (e a f). Je zväčšenie je indikovaný buď 10X alebo 40X. B. Histopatologické normálne a nádorové žalúdka myší po RAN a bežal + liečenie Vápno pre 300 dní. Vo všetkých panelov, "normálne" znamená myší s žiadnym nádoru, "dysplázia" indikuje myši sa prekancerózne tkaniva žalúdka. "Karcinóm" znamená myší s nádorovým žalúdka. Dysplázia ukazuje anisokaryosis (rozdiel vo veľkosti jadier) a anizocytóza (rozdiel vo veľkosti buniek). Je zväčšenie je indikovaný buď 10x, 40x a 100x.
Študoval na metafáze šíri
Ak chcete zistiť, či spojitý administeration z RAN extraktu (od 15 do 180 dní) s alebo bez vápna nemá žiadny vplyv na chromozómoch, sme študovali metafázy nátierky po 2 h ošetrení kolchicínom, vo vzorkách kostnej drene. Dáta ukázali postupný nárast mitotických číslach sa predčasne oddelených sesterských chromatíd (obrázok 3A a C), a to ako v RAN a bežal + vápenné podávaný myší, v porovnaní so žiadnym u neliečených myší. Je tiež zo štúdie, ktorá RAN + vápno podávaný myší kostnej drene ukázala významne vyšší výskyt také predčasné anaphase než len RAN podávaného (obrázok 3A) jasné. Po 180 dňoch nepretržitého administeration RAN + vápna, 34,4% v porovnaní s predčasným anaphase 18,4% (p = 0,002) v RAN podávaný myši boli pozorované BMC. Obrázok 3 karyotypu analýza genómovej nestabilite v bunkách kostnej drene myši po expozícii RAN extraktu (RAN + L), alebo bez vápna (RAN). (A) Percento metafáz s predčasnou sestra-chromatidov oddelenia. Dve myši na každý bod pre neošetrené, 15 a 30 dní po skupine liečenej a tri myši na mieste pre odpočinok. Aspoň 100 metafáz boli hodnotené pre každú myš. (B) Normálny metafázy šíri z buniek myší kostnej drene. (C) Predčasné sestra chromatidov odlúčenie od myši vystavené RAN. Zátvorky ukazujú, sesterské chromatidu-ležiace oddelené mitotických obrázkoch, ktoré ukazujú fenotyp. (D a E) metafáz spread ukázala, 37 a 38 chromozómov, resp. (F, G a H) metafáze spread ukázal viac ako 60 chromozómov. (I) vykazovali viac ako 80 chromozómov.
Počíta sme počet chromozómov v metafáze šíri pochopiť význam predčasné anaphases vo vzťahu k stabilite chromozómov. Neošetrené myši majú stabilný (2n = 40) karyotyp (obrázok 3B) a nevykazovali žiadne aneuploidní bunky. sme pozorovali nízkej frekvencii aneuploidních buniek (obrázok 3D-I, tabuľka 1) v RAN administrácie, a bez vápna, po dobu 120 dní a bolo zistené, že sa frekvencia aneuploidních buniek sa postupne zvyšuje. Stredná frekvencia (13,8%) aneuploidních buniek bola hodnotená u myší, ako žalúdka nádorových ložísk. Celková frekvencia aneuploidních buniek bolo viac nasledujúcich RAN + vápna administeration než samotným RAN (tabuľka 1) .Table 1 chromozómov analýza buniek myší kostnej drene po vystavení RAN extrakcii s alebo bez vápna
Liečba vzor

liečebné dni
Celkom spread zaznamenal
chromozómu č.
aneuploidiu
Predčasné sestra

37
38
39
40
41
42
> 60

% (stredná)
chromatidového separácia%
Neliečená
0
110
110
0
0
104 104
NETHRY.cz 0
0
RAN
120
105
1
1
103
1,9
17,5
120
2
1
2
115
4,1
18,7
105
1
2
102
2,8 (2,9)
18,3 (18,2)
RAN + vápno
100
2
2 foto 1
95
5,0
31,7
105
2
2 Sims 3
98
6,6
28,6
110 Sims 3
2 foto 1
103
1
6,4 (6,0)
28,3 (29,5)
p = 0.015
RAN
180
101
1
2 foto 1
97
3,9
18,0
124
2.
2 foto 1
119
4.0
17,7
114 Sims 3
2 foto 1
108
5.3 (4.4) 19.4
(18.4)
RAN + vápno
112 Sims 3 Sims 3 Sims 3
103
8,0
32,6
105
2
2
1
98
1
1
6,6
34,9
110
4
2
101
2
1
8,2 (7,6)
35,6 (34,4)
p = 0.002
RAN + vápno
220
232
6
9
12
194
7
2
2
16,4
8,2
(s pokročilým nádorom)
256
234
5
4
7
208
5
2 Sims 3
11,1 (13,8)
7,1 (7,6)
štatisticky významné v párovým t-testom; Bolo preukázané, dvojchvostý hodnota p.
Chromozómy boli hodnotené prevažne ako chromatidové prestávky. Veľmi nízka frekvencia isochromatid prestávok bola pozorovaná a neboli nájdené žiadne výmenné aberácie. Frekvencia chromatidové prestávok a aberantne metafáz sa postupne zvýšil z 60 na 180 dní RAN-administeration s alebo bez vápna. Frekvencia odchýlok bol viac nasledujúcich RAN + vápenné administeration než samotný RAN. Frekvencia odchýlok bola viac ako v pokročilom žalúdku nádor nesúcich myší. (Podrobnosti aberácie Pozri doplnkovú súbor 1: doplňujúcich informácií).
Zníženú expresiou mitotických a kontrolných bodov vreteno génov u myší RAN liečených
S ohľadom na vyššie uvedených štúdií sme skúmali expresiu AuroraA, AuroraB, MAD2 stroje a Bub1
génov v kostnej dreni, pažeráka a žalúdka bunky týchto myší, ktoré boli neupravenú alebo podávať extrakt RAN s alebo bez vápna pre 120, 180 a 260 dní. Konvenčné Výsledky RT-PCR (obrázok 4), ukázala, že bunky získané z pažeráka a žalúdka ukázala, väčšinou na základe expresie týchto génov vzhľadom k neošetreným jednej a tak na základe expresie bola konzistentná a významná v RAN + vápna podávaný myší. Avšak výraz všetkých týchto génov v BMC nezmenil akýmkoľvek významným spôsobom s tým rozdielom zvýšená expresia Mad2 stroje a Bub1
bolo uvedené v BMC myší získaných po 260 dňoch administeration. Obrázok 4 Horný panely- Expresia mitotických kontrolných bodov génov v myší kostnej dreni (BM), pažeráka a žalúdka buniek po expozícii s RAN extrakt s alebo bez vápna pre 120, 180 a 260 dní. Dolné panely- Kvantitatívna analýza denzitometrické expresného profilu mitotické checkpoint génov úrovni mRNA v pažeráku a žalúdku buniek po bolo preukázané 260 dni expozície. Hodnoty sú priemer ± SEM z troch nezávislých experimentov. Hodnoty sú normalizované k GAPDH príslušným hodnotám. * P < 0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001. Významne odlišné v porovnaní s negatívnou /pozitívne kontroly (ako je stanovené párovým t-testom).
Analýza nadmerné expresie génov pomocou imunoblotování
hladiny p53, P65, Bax stroje a Securin
v BMC z myší po administeration RAN extrakcii s alebo bez vápna pre 60, 90 a 180 dní, a tie pažeráka a žalúdka po 180 dňoch kŕmenia boli skúmané imuno-blottingom. Hladiny týchto proteínov boli tiež testované z buniek odobratých tkanív ručičiek z neošetrených myší. Výsledky ukazujú, že expresia p53, P65, Bax stroje a Securin
významne zvýšené vo všetkých tkanivách regulovaných myšou RAN. Ako je zvýšenie bola signifikantne v RAN + vápna vyššia, než len v RAN podávaných myší (obrázok 5). Obrázok 5 Horné panely- Reprezentatívny western blot detekcie P65, p53, securin, Bax a beta-aktínu v myší kostnej dreni (BM), pažeráka a žalúdka buniek po expozícii s RAN extrakt s alebo bez vápna. Pre BM, bunky boli odobraté po 60, 120 a 180 dní, zatiaľ čo v prípade pažeráka a žalúdka, boli bunky zhromaždené až po 180 dňoch expozície. beta-aktínu bol použitý ako kontrola nanášania. Nižšia panely- Kvantitatívne densitometrická analýza úrovni proteínov vyššie uvedených génov v kostnej dreni, bolo ukázané, pažeráka a žalúdka bunky po 180 dňoch expozície. Hodnoty sú priemer ± SD z troch nezávislých experimentov. Tieto hodnoty sú normalizované k príslušným beta-aktínu hodnôt. * P < 0,05; ** P < 0.01 Podstatný rozdiel v porovnaní s negatívnou /pozitívne kontroly (ako je stanovené párovým t-testom).
Prietokové cytometrie štúdií bunkového cyklu a detekciu apoptotických buniek dvojakom farbením a chémiou
prietokovej cytometrie obsahu DNA v kostnej dreni , pažeráka a žalúdka bunky myší získaných po 260 dňoch RAN + správy vápno (obrázok 6A), ukázali, že došlo k zvýšeniu v G1 fáze buniek a to ako v kostnej dreni a pažeráka s ohľadom na nechránenú kontrolou. Avšak, v žalúdku, percento buniek v sub-G1 fáza bola zvýšená, čo možno pripísať vzhľadom k apoptotické bunkovej smrti. K tomuto potvrdeniu bolo vykonané dvojaké farbenie AnnexinV a PI. Dáta na obrázku 5B ukazujú zvýšenie pozitívne farbenie s annexinu-V v kvadrante 2 a 3 v žalúdočných bunkách, ale nie v bunkách pažeráka RAN + vápna podávaný myší. Obrázok 6 Analýza bunkového cyklu a apoptózu u myší liečených RAN vápnom (A) Analýza bunkového cyklu po 260 dňoch expozície s RAN extrahuje sa vápna v kostnej dreni, pažeráka a žalúdka bunky myši, a tiež z žalúdka nádorových buniek. (B) Reprezentatívny cytograms annexinu V oproti intenzity fluorescencie PI, ako je stanovené analýzou prietokovej cytometrie na myšiach pažeráka a žalúdka buniek po 260 dňoch expozície s RAN s vápnom a z žalúdka nádorových buniek. V rámci cytogramu, kvadrant 1 a 2 reprezentujú skoré a neskoré apoptotické bunky, v uvedenom poradí; kvadrant 3, životaschopné bunky; kvadrant 4, odumreté bunky. (C) Western blot pre apoptotických markerov v normálnych (neošetrené) a nádor žalúdka buniek. β-aktínu bol použitý ako kontrola nanášania.
Je zaujímavé, že prietoková cytometrická analýza nádorových buniek odobratých z myší, ktorý sa vyvíjal nádor v žalúdku po 220 a 256 dňoch nepretržitého administeration RAN a vápna, odhalila významné zníženie G1 buniek s súčasnej vzostup v sub-G1 buniek (obrázok 6A). Dvojaký značenie ukazuje, že sub-G1 bunky sú väčšinou necrotic odumretých buniek (kvadrant 4) (obr 6B). Významne vyššiu úroveň p53 a Bax
proteíny boli pozorované v nádore ako bežné žalúdočných bunkách (Obrázok 6c). Avšak bolo zistené, že PARP
byť chýbajúce v oboch nádorových buniek v žalúdku, aj keď PaRP stroje a jeho 29 kD štiepi boli prítomné v normálnych vzorkách žalúdka (obrázok 6c) produktu.
Diskusia
predkladaného štúdia bola vykonaná na zistiť, či ad libitum
administeration RAN extrakt s alebo bez vápna v pitnej vode môže indukovať pažeráka alebo žalúdka, rakoviny u myší, a ak áno, čo počiatočné procesy sú zapojené. V tejto štúdii boli myši uvedené celú RAN-extrakt a bez vápna za účelom napodobenia ľudskú spotrebu štýl RAN. Okrem toho, bola dávka tiež periodicky zvyšuje, ako sa to stane na človeka. Naše výsledky ukazujú, že ako RAN s a bez vápna spôsobiť rakovinu žalúdka, aj keď treba poznamenať, že prítomnosť vápna s RAN podporovaná vyššou transformáciu buniek, a tým rakovinu žalúdka skôr ako RAN sám. Zdá sa, že rakovina bola indukovaná v žalúdku, pretože väčšie expozíciu jeho obloženie musel RAN, zatiaľ čo pažeráka podšívka bola vystavená len krátko po vypití RAN zmiešanej vody.
Bolo preukázané už skôr, že alkalické pH je vhodný pre generovanie ROS autooxidáciou z Areca matice polyfenolov [6, 7]. Bolo tiež ukázané, že katechín frakcia Areca maticou extraktu aktívne generuje ROS pri alkalickom pH, ktoré indukuje poškodenie DNA in vitro
[21, 22]. Všetci autori čítať a schválená konečná rukopis.

• Vyjadrenie varianty LINE-1 endonukleázou u karcinómu žalúdka: jeho vzťah s klinicko-parametrami
• Žalúdočným mechanizmus paederia foetida Linn. (Rubiaceae) - populárna jedlé rastliny používajú domorodé komunity v severovýchodnej Indii