L'induzione di instabilità cromosomica e cancro allo stomaco alterando il pattern di espressione dei geni di checkpoint mitotico in topi esposti a areca-nut

L'induzione di instabilità cromosomica e cancro allo stomaco alterando il pattern di espressione dei geni di checkpoint mitotico in topi esposti a areca-nut
Abstract
sfondo
Ci sono forti indicazioni per una associazione causale tra il consumo di areca-nut e tumori. In Meghalaya, in India, la varietà di areca-nut è usato come forma grezza e non trasformati la cui composizione e le azioni farmacologiche chimici sono stati segnalati. Eppure sappiamo poco sul sentiero iniziale coinvolti in areca-nut cancerogenesi associata dal momento che è difficile valutare i suoi effetti sulla alterazioni genetiche senza interferenze di altri fattori di compounding. Pertanto, il presente studio è stato intrapreso nei topi per verificare la capacità di materie prime areca-nut (RAN) per indurre il cancro e per monitorare l'espressione di alcuni geni coinvolti nella carcinogenesi. Questo studio non aveva lo scopo di isolare eventuali principi attivi dalla RAN e di guardare la sua azione.
Metodi
Tre gruppi di topi (n = 25 in ciascuno) sono stati presi e utilizzati in diversi punti temporali per l'analisi sperimentale diverso . Gli altri tre gruppi di topi (n = 15 in ciascuno) sono stati considerati per studi induzione tumorale. In ogni set, due gruppi sono stati somministrati RAN-estratto ad libitum
in acqua potabile con o senza calce. L'espressione di alcuni geni è stata valutata mediante RT-PCR convenzionale e immunoblotting. I topi sono stati dati l'intero RAN estratto con e senza calce al fine di imitare lo stile consumo umano di RAN.
Risultati
preparazione istologica del tessuto dello stomaco rivelato che correva indotto il cancro allo stomaco. Un graduale aumento della frequenza delle cellule anafase e aneuploid precoci è stata osservata nelle cellule del midollo osseo con una maggiore incremento seguenti calce administeration RAN +. I livelli di p53, Bax, Securin
e p65 nelle cellule
esofagee e gastriche sono stati elevati durante i primi giorni di esposizione RAN mentre quelli di diverse proteine ​​mitotico checkpoint sono stati smorzati. morte cellulare per apoptosi è stata rilevata nelle cellule dello stomaco non-cancerose, ma non nelle cellule tumorali che hanno mostrato la sovraespressione di Bax
e l'assenza di PARP
.
Conclusione
presente studio ha suggerito (a) RAN induce il cancro allo stomaco, tuttavia, la presenza di calce promosso maggiore trasformazione delle cellule e del cancro così sviluppato in precedenza, (b) perturbazioni nei componenti del macchinario segregazione cromosomica potrebbero essere coinvolti nel processo iniziale di cancerogenicità e (c) l'importanza di anaphase precoce come marcatore di screening per l'identificazione di difetti checkpoint mitotico durante i primi giorni.
Parole
instabilità cromosomica mitotiche checkpoint geni Securin
apoptosi Sfondo
esofageo carcinoma a cellule squamose (ESCC) ei tumori gastrici sono tumori più comuni in India, con il più alto incidenza di ESCC essere in stati del nord-est dell'India [1]. Ci sono forti indicazioni per una associazione causale tra areca-nut o masticando le abitudini quid e questi tumori. Diversi studi in diverse specie animali hanno dimostrato l'induzione positiva di tumori sia di destinazione (guancia-sacchetto, dell'esofago e dello stomaco) e non-bersaglio (polmone e fegato) i tessuti quando arecolina (ARC) o areca-nut estratto è stato somministrato con mezzi diversi tali come intubazione orale [2], mescolato con la dieta [3], e l'applicazione guancia-pouch [4]. Pertanto, sembra che l'attivazione metabolica di alcaloidi è necessario per la conversione finale in cancerogeni finale, che è fortemente influenzata dalle condizioni fisiologiche e presenza di alcuni fattori [5]. I rapporti hanno indicato la generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) da ingredienti Areca-nut in condizioni alcaline [6, 7]. A causa della presenza di calce in preparazione betel quid, saliva areca-nut chewers 'varia tipicamente da neutro a una condizione alcalina che può essere ideale per la generazione di ROS [7]. Nair et al. [6] hanno anche notato che, oltre ARC, auto-ossidazione dei polifenoli areca-nut potrebbe generare H 2O 2 e radicali superossido a pH alcalino.
Nello Stato di Meghalaya, in India, la varietà di noce di areca, localmente chiamato 'Kwai', è usato come forma grezza acerba e non trattato che ha contenuti più elevati di alcaloidi, polifenoli e tannini rispetto alla forma secca [8]. Il betel quid utilizzato in Meghalaya contiene grezzo areca-nut (RAN), pasta di calce e una piccola porzione di foglie di betel senza tabacco e altri costituenti. Qui la gente ingoiare l'intero quid dopo la masticazione invece di sputare fuori che potrebbe essere un fattore importante per il cancro ESCC e lo stomaco. Recentemente, il 40% dei campioni di cancro esofageo raccolti da pazienti di stato Meghalaya aventi soltanto abitudine RAN-masticazione ha mostrato la cancellazione del marcatori microsatelliti D9S1748 e D9S1749, situato vicino a esone 1β di CDKN2A /ARF
gene in 9p21. L'ipermetilazione promotore di CDKN2A
gene era significativamente più alta nei campioni con l'abitudine di RAN-masticare solo quelli che presentano l'abitudine di utilizzo sia RAN e tabacco [9]. Fino ad ora, non sappiamo molto sul percorso iniziale prevede in noce di betel cancerogenesi associata a dell'esofago e dello stomaco. E 'anche difficile valutare gli effetti di puramente e alterazioni genetiche prevalentemente Areca-dado indotte umana senza interferenze da parte di altri fattori di compounding come masticare tabacco o il fumo, il consumo di alcol, vari tipi di alimenti non-vegetariani, ecc Inoltre, la presenza di calce rende una condizione alcalina, che non è l'ideale per vitro
cultura delle cellule e quindi l'effetto di areca-nut non può essere testato in sistemi di colture cellulari. In vista di questi, il presente studio è stato condotto in topi per verificare la capacità di RAN-estratto con o senza calce, per indurre il cancro e valutare contemporaneamente il pattern di espressione di alcuni geni che svolgono un ruolo importante nel processo iniziale della carcinogenesi.
La composizione chimica e le azioni farmacologiche di areca-nut sono stati segnalati e rivisto da più uomini [10, 11]. Diversi studi su animali hanno confermato che i prodotti Areca-dado e nitrosammine specifiche di betel, hanno la capacità di indurre alterazioni neoplastiche animali da esperimento [11]. Notevole la prova suggerisce che Areca-nut-alcaloidi, prevalentemente arecolina (ARC) sono i principali fattori di BN-tossicità [11]. E 'stato dimostrato che ARC può indurre danni al DNA nelle cellule midollo osseo di topo [12] e tali danni del DNA può essere ridotto quando ARC viene somministrato con N-acetil-L-cisteina [13]. Pertanto, si segnala che il presente studio non era destinato ad isolare eventuali principi attivi dalla RAN e di guardare la sua azione. Lo scopo dello studio è stato quello di identificare il percorso iniziale coinvolti in RAN associata cancerogenesi nei topi e, pertanto, i topi sono stati dati l'intero RAN estratto con e senza calce al fine di imitare l'abitudine del consumo di umano.
Diversi geni, come p53 , p65, Securin
e molti altri, sono noti per essere di solito sovraespresso durante la carcinogenesi [14-16]. Inoltre, l'instabilità genetica è anche associata con instabilità cromosomica (CIN) che porta a aneuploidia, un segno distintivo di cancro. Tale aneuploidia può facilitare tumorigenesi attraverso la perdita della funzione del gene soppressore del tumore. È stato osservato che la perdita parziale del controllo checkpoint mitotico porta a CIN in cellule tumorali umane [17, 18]. Pertanto, nel presente studio, abbiamo valutato il pattern di espressione di p53, p65, Securin
e diversi mitotici e di assemblaggio del mandrino geni di checkpoint in diversi punti temporali. Abbiamo osservato che RAN può indurre il cancro allo stomaco perturbando i componenti del macchinario segregazione cromosomica.
Metodi
Preparazione di estratti
Dopo sgranare gli strati fibrosi da non trasformati areca-nut crudo e acerbo (RAN), 100 g di RAN erano a terra e sospesi in 125 ml di acqua distillata e mescolato con cura per dare una pasta liscia per la preparazione di un estratto acquoso di RAN. Dopo 24 h, la pasta è stata agitata per 3 ore a 37 ° C e l'estratto acquoso è stato raccolto per centrifugazione. Questa procedura di estrazione è stata ripetuta ancora una volta aggiungendo 125 ml di acqua al residuo. Entrambi gli estratti sono stati riuniti, che rappresenta 100 g di RAN in 250 ml di acqua distillata, filtrato e congelato a - 80 ° C. Il filtrato è stato liofilizzato in un Secfroid Lyolab BII Liofilizzatori (Danimarca). La massa liofilizzato è stato mantenuto a 4 ° C fino all'utilizzo. L'estratto conteneva 0,9 g /100 g di materiale estraibile-acqua
. Animali manutenzione e il trattamento
topi albini svizzeri (25-30 g), 2-3 mesi sono stati mantenuti in laboratorio in gabbie di comunità in una stanza con temperatura controllata (20 ± 2 ° C) e illuminazione controllata (12 h di luce; 12 h scuro). dieta standard del mouse (NMC Oil Mills Ltd., Pune, India) e acqua ad libitum
sono stati utilizzati in tutti gli esperimenti. Gli esperimenti sono stati condotti in conformità alle linee guida istituzionali e approvati dai nostri "Standards istituzionali per cura degli animali e l'uso" Consiglio.
In Set-1, tre gruppi di topi (n = 25 in ciascuna) sono state prese che sono stati utilizzati in diversi time-punti per l'analisi sperimentale diverso. In Set-2, tre gruppi di topi (n = 15 in ciascuno) sono stati considerati per studi induzione tumorale. La figura 1 fornisce una panoramica schematica sul protocollo sperimentale generale che è stato considerato in questo studio. In ogni set, un gruppo è stato trattato con acqua potabile semplice considerato non trattati, mentre due gruppi sono stati somministrati RAN estrarre ad libitum
in acqua potabile, con o senza calce (pH 9,8). È stato stimato che ogni topo consumato 1 mg di estratto al giorno. Tale administeration orale è stato continuato per 60 giorni dopo di che la dose è stata aumentata da 1 mg a 2 mg al giorno fino a 120 giorni. Allo stesso modo, ogni 60 giorni dopo la dose è stata aumentata da 1 mg al giorno di consumo. Figura 1 Diagramma di flusso di disegno sperimentale per l'analisi di greggio areca-nut mediata cancerogenesi nei topi. RANDOM grezzo areca-nut; giorni D-.
Preparazione di metafasi e scoring di aberrazioni cromosomiche Compra di preparazione metafase, cellule del midollo osseo (BMC) sono stati raccolti da due topi per punto da non trattate, 15 e 30 giorni di gruppo trattato e di tre topi per punto per il resto. Nei gruppi trattati, BMC sono stati raccolti dopo 15, 30, 60, 120 e 180 giorni di trattamento. BMC sono stati raccolti anche dalle due topi con tumore allo stomaco. BMC sono stati raccolti dopo 2 ore di trattamento colchicina (15 mg /kg). Gli animali sono stati uccisi da dislocazione cervicale. I femori sono stati sezionati fuori e BMC sono state svuotate iniettando 2 ml 0,075 M KCl preriscaldata a 37 ° C. Le cellule sono state trattate in soluzione ipotonica per 15 minuti e fissati in acido acetico e metanolo (1: 3). I vetrini sono stati preparati con il metodo di fiamma essiccazione, tinto in 5% Giemsa per 5 minuti e montato in terreno sintetico. Immagini di spread metafase sono state prese sotto Zeiss Axioskop microscopio (Germania). Compra di studio cromosomico, le diapositive sono stati codificati in modo casuale e almeno 100 lastre in metafase ben distribuite sono stati selezionati per lo studio da ogni mouse. Abbiamo eseguito i conteggi cromosomici sulla diffusione metafase. aberrazioni cromosomiche sono stati segnati come pause e le interruzioni isocrmatidico cromatidiche. Vedere procedure sperimentali estese per i dettagli nel file 1 Ulteriori:. Informazioni supplementari
immunoblotting
cellule dal midollo osseo, esofago (da graffi strato interno) e dello stomaco (da graffi parte interna) sono stati lavati due volte con PBS (fosfato buffered saline) e sono state lisate in tampone radioimmuno-precipitazione (0,1% SDS, 2 mM EDTA, 1% NP-40, 1% sodio desossicolato, 50 mM sodio fluoruro e 100 U /ml aprotinina). Dopo 30 min di incubazione in ghiaccio, i lisati cellulari sono stati centrifugati per 15 min a 4 ° C e la quantità di proteina è stata determinata utilizzando il saggio proteico dell'acido bicinconinico. Pari quantità di proteina (40 mg) di ciascun campione è stato caricato in ciascun pozzetto; pari di carico è stata ulteriormente verificata da immunoblotting con anticorpi actina. I campioni sono stati caricati in Novex Tris-glicina 4-20% gel gradiente e l'elettroforesi è stata eseguita nel sistema di elettroforesi NuPAGE (Invitrogen, USA). Le proteine ​​sono state trasferite ad una membrana di polivinilidene difluoruro (PVDF) (Sigma) seguendo il protocollo standard. Le membrane sono state sondate con una diluizione 1: 1000 di un anticorpo monoclonale di topo contro p53
(PAB 240; ab-26; Abcam, Stati Uniti d'America), Bax
(6A7; ab5714; Abcam, Stati Uniti d'America), Securin
(DCS-280; ab3305; Abcam, Stati Uniti d'America), β-actina
(AC-15; ab6276; Abcam, USA) e il coniglio anticorpo policlonale contro NF-P65 κβ
(ab31481; BCAM, Stati Uniti d'America). Blots sono stati lavati 3 volte per 10 minuti ciascuno in TBST a pH 7,6 (1 M Tris Cl, 5 M NaCl e 0,05% Tween 20) ed incubate con anticorpo secondario (alcalino-fosfatasi coniugata anti-topo IgG o alcalino-fosfatasi coniugata antirabbit IgG 1: 2000; Abcam, USA) per 1 ha temperatura ambiente. Dopo approfondite il lavaggio, la macchia è stato immerso in 4 ml di soluzione substrato BCIP /NBT (Bangalore Genei, India). colorazione sufficiente è stata ottenuta entro 15 minuti. Ogni immunoblotting è stata effettuata in tre topi per-punto. Valutazione istopatologica

tessuto dello stomaco è stato raccolto da controllo non trattato e da due topi RAN + calce trattati con tumore. In un altro set, tessuto dello stomaco è stato raccolto anche da non trattati così come dai gruppi che trattati per 300 giorni con RAN estratto con e senza calce. Tre topi sono stati scelti a caso da ciascun gruppo. Questi topi non hanno alcuna indicazione di tumori esternamente. Le sezioni di tessuto (5-7 micron) sono stati trattati per sezionamento istologico secondo la procedura standard [19] e colorate con ematossilina eosina [20]. Le sezioni sono state quindi osservate al microscopio ottico e fotografato (Carl Zeiss, Germania).
Estrazione dell'RNA e convenzionali di analisi RT-PCR
cellule sono state raccolte da graffi lo strato interno dell'esofago e dello stomaco dal controllo non trattato, corse e corse + calce topo trattato (tre topi per punto). cellule del midollo osseo sono state raccolte dal midollo femore del mouse. L'RNA totale è stato isolato con Trizol e poi purificato utilizzando il kit RNeasy Mini (Qiagen) secondo il protocollo del produttore. La trascrizione inversa è stata eseguita con 1 mg di RNA totale di ogni campione usando Quantiscript della trascrittasi inversa, Quantiscript RT-buffer e RT Primer-mix di kit QuantiTect trascrizione inversa (Qiagen GmbH, Hilden, Germania) secondo il protocollo del produttore. L'amplificazione del cDNA è stato condotto in 20 soluzione ml contenente 2 ml di cDNA, 10 coppie di primer pmol per Aurora A, Aurora B, Mad2, Bub1 e GAPDH (per le sequenze di primer, vedere sui file 1: Informazione di riferimento), rispettivamente, e 10 ml di RT qPCR master mix (Qiagen GmbH, Hilden, Germania). La PCR consisteva di denaturazione iniziale a 94 ° C per 5 minuti, seguiti da cicli di 30 reazione (30 secondi a 94 ° C, 30 secondi a 60 ° C e 30 secondi a 72 ° C) e un ciclo finale a 72 ° C per 10 min. GAPDH è stato utilizzato come controllo interno. Tutti i prodotti della PCR sono stati separati su elettroforesi etidio bromuro di gel macchiati e visualizzati con luce UV.
Mediante citometria a flusso di cellule
cellule del midollo osseo del mouse e le cellule raccolte da graffi lo strato interno dell 'esofago e lo stomaco di entrambi non trattati e trattati per 260 giorni con RAN, con o senza calce sono stati fissati con il 70% di etanolo. cellule dello stomaco tumorali sono stati anche raccolti e fissati. Le cellule fissate sono state lavate in PBS e risospese in 500 pl di soluzione di ioduro di propidio (50 ug /ml di ioduro di propidio, 0,2 mg /ml RNasi) per 1 ora a temperatura ambiente al buio. 10.000 cellule sono state acquisite per ogni campione e analizzati con un FACS Calibur (Becton-Dickinson). software CellQuest Pro è stato utilizzato per quantificare comparti del ciclo cellulare per stimare la percentuale di cellule distribuite nelle diverse fasi del ciclo cellulare. studi di etichettatura
annessina V
morte cellulare per apoptosi è stata valutata utilizzando il metodo isotiocianato annexinV-fluoresceina in cellule tumorali dello stomaco e anche nello strato interno di cellule dello stomaco e l'esofago non trattato e RAN con e senza calce topo trattato dopo 260 giorni di administeration continuo. Il pellet cellulare è stato risospeso in PBS. Le cellule sono state colorate con ioduro di propidio e annessina V-FITC utilizzando BD PharmingenTM annessina V: FITC apoptosi Detection Kit (BD-Pharmingen Biosciences, San Diego, CA) come da istruzioni del produttore. Brevemente, dopo aver raccolto e lavaggio due volte con PBS, le cellule sono state risospese in tampone di legame (500 microlitri). FITC-annessina V (5 mL) è stato aggiunto alle cellule seguita da aggiunta di 5 microlitri PI secondo il protocollo. I campioni sono stati poi incubate per 15 minuti al buio a temperatura ambiente e sottoposte a citometria a flusso valutazione. Analisi statistica
valori sono espressi come media ± SEM o media ± SEM di controllo e campioni sperimentali e analisi statistiche sono state effettuate con il test t di Student con il software GraphPad Prism 5.1. I valori sono stati
considerato statisticamente significativo, se il valore p è stato 0.05 o meno. I risultati
Osservazioni generali
su quindici topi, due topi hanno sviluppato cancro allo stomaco dopo 220 e 256 giorni di alimentazione di RAN estrarre con calce (Figura 2A a e b). Nessun tumore è stato sviluppato nel topo sia trattata o somministrato solo con RAN. La sezione istologica chiaramente differenziato tra normale (Figura 2A c) e lo stomaco tumorale (Figura 2A d-f). Tuttavia, la preparazione istologica del tessuto dello stomaco è stata fatta anche da tre apparentemente normali topi alla ricerca scelti a caso da questo gruppo, dopo 300 giorni di alimentazione con RAN estratto con e senza calce. Sia correva con e senza calce ha mostrato la sua capacità di indurre il cancro allo stomaco. Due su tre topi trattati con solo RAN ha mostrato fase di pre-cancerose (displasia), mentre tutti e tre i topi trattati con RAN + calce mostrato carcinoma (Figura 2B). Figura 2 Dissected mouse e istopatologia di entrambi i tessuti normali e tumorali dello stomaco dopo il trattamento con RAN con e senza calce. Mouse A. Dissected con (a) dello stomaco normale e (b) stomaco tumorale indicato con una freccia. Istopatologia del normale (c) e lo stomaco tumorale (d, e ed f) indotta da estratto RAN con calce. Le frecce indicano ulcerate neoplasia nelle cellule (d) e giganti del tumore in (E e F). L'ingrandimento è indicato sia 10X o 40X. B. istopatologia del normale e tumorale stomaco di topi dopo correva e correva + trattamento con calce per 300 giorni. In tutti i pannelli, "Normale" indica i topi privi di tumore, "displasia" indica topi con tessuto dello stomaco precancerose. "Carcinoma" indica topi con lo stomaco tumorale. Displasia mostra anisocariosi (variazione nella dimensione dei nuclei) e anisocitosi (variazione nella dimensione delle cellule). L'ingrandimento è indicato o 10X, 40X e 100X.
Studiato in metafase
diffonde Per determinare se administeration continuo di estratto RAN (da 15 a 180 giorni), con o senza la calce ha alcun effetto sui cromosomi, abbiamo studiato spread metafase , dopo 2 ore di trattamento con colchicina, in campioni di midollo osseo. I dati ha rivelato un aumento graduale figure mitotiche con cromatidi fratelli prematuramente separati (Figura 3a e C) sia in corse e corse + calce somministrato mouse, rispetto a nessuno nei topi non trattati. E 'anche chiaro dallo studio che RAN + calce somministrato midollo osseo di topo hanno mostrato significativamente più alta frequenza di tale anaphase precoce di solo RAN somministrata (Figura 3A). Dopo 180 giorni di administeration continuo di RAN + calce, 34,4% anaphase precoce rispetto al 18,4% (p = 0,002) nel topo RAN-somministrato BMC sono stati visti. Figura 3 analisi del cariotipo di instabilità genomica nelle cellule del midollo osseo di topo dopo l'esposizione al estratto RAN con (RAN + L) o senza calce (RAN). (A) percentuale di metafasi con prematura separazione cromatidi fratelli. Due topi per punto per non trattata, 15 e 30 giorni di gruppo trattato e di tre topi per punto per il resto. Almeno 100 metafasi sono stati segnati per ogni mouse. (B) diffusione metafase normale da cellule del midollo osseo di topo. (C) prematura separazione cromatidi fratelli da topo esposto ad RAN. Staffe mostrano sorella-cromatidi giace separati in figure mitotiche che mostrano il fenotipo. (D ed E) Metaphase spread mostrato 37 e 38 cromosomi, rispettivamente. (F, G e H) Metaphase spread mostravano più di 60 cromosomi. (I) ha mostrato più di 80 cromosomi.
Abbiamo contato il numero di cromosomi in metafase diffonde a comprendere il significato di anaphases precoci in relazione alla stabilità dei cromosomi. I topi non trattati hanno una stabile (2n = 40) cariotipo (Figura 3B) e non hanno mostrato cellule aneuploidi. Abbiamo osservato bassa frequenza di cellule aneuploidi (Figura 3D-I; Tabella 1) in RAN-somministrato, con e senza calce, per 120 giorni ed è stato osservato che la frequenza di cellule aneuploidi è stata aumentata gradualmente. La frequenza media (13,8%) delle cellule aneuploidi è stato segnato nei topi sia il tumore dello stomaco cuscinetto. Nel complesso, la frequenza di cellule aneuploidi è stato più seguito RAN + calce administeration rispetto alla sola RAN (Tabella 1) .table analisi 1 cromosomica delle cellule del midollo osseo del mouse dopo l'esposizione a RAN estrarre con o senza calce
Trattamento modello

giorni di trattamento
e diffusione totale ha segnato
cromosoma n.
Aneuploidia
sorella precoce

37
38
39
40
41
42
> 60

% (Mean)
Cromatidio separazione%
non trattata 0
110
110
0 0

104
104
0 0

RAN
120
105
1 1
103
1.9
17,5
120 Pagina 2
1 2
115
4.1
18,7
105
1 2
102
2.8 (2.9)
18,3 (18,2)
RAN + calce
100

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