Indukcija chromosomų nestabilumo ir skrandžio vėžio keičiant išraiška modelio mitozės Checkpoint genų Pelių, Areca-veržle

Indukcija chromosomų nestabilumo ir skrandžio vėžio keičiant išraiška modelio mitozės Checkpoint genų Pelių, Areca-veržle
tezės
Background
Yra aiškių požymių, dėl priežastinio ryšys tarp arekų riešutų vartojimas ir vėžio. Be Meghalaja, Indija, iš Areca-veržle įvairovė yra naudojamas kaip žaliava ir neapdorota forma, kurio cheminė sudėtis ir farmakologiniai veiksmai buvo pranešta. Tačiau mes tiek pradiniame keliu dalyvauja arekų riešutų susijusių kancerogenezėje žinoti, nes sunku įvertinti jo poveikį genetinių pakitimų be trukdžių kitų Sudėties veiksnių. Todėl ši studija buvo atlikta su pelėmis patikrinti žalio arekų riešutų (RAN) gebėjimą sukelti vėžį ir stebėti tam tikrų genų, dalyvaujančių kancerogenezėje išraiška. Šis tyrimas nebuvo skirtas izoliuoti visus aktyvius ingredientus iš RAN ir ieškoti savo veiksmus.
Metodai
Trys grupės pelių (n = 25 kiekvienam) buvo imtasi, ir naudojama skirtingais laiko momentais, skirtų įvairaus eksperimentinės analizės , Buvo apsvarstytos kitos trys grupės pelėms (n = 15 kiekvienoje) ir naviko indukcinių studijas. Kiekviename rinkinyje, dvi grupės buvo skiriami RAN-ekstraktas iki soties
geriamajame vandenyje su arba be kalkių. Tam tikrų genų išraiška buvo įvertintas įprastiniu RT-PGR ir munoblotingu. Pelėms buvo suteikta visa RAN-ekstraktas su ir be kalkių, siekiant imituoti žmonių maistui stilių RAN.
Rezultatai
histologinio preparato skrandžio audinio atskleidė, kad RAN sukeltas skrandžio vėžiu. Palaipsniui padidėjo ankstyvas Anafaza ir aneuploidija ląstelių dažnis buvo stebėtas kaulų čiulpų ląstelių su didesniu prieaugio šiais RAN + kalkių administeration. Lygiai p53, Bax, Securin parsisiųsti ir 65 psl
stemplės ir skrandžio ląstelės buvo padidėjusi metu pirmųjų dienų RAN poveikio, o tie, įvairių mitozinis Checkpoint baltymų buvo downregulated. Aprotoninis ląstelių mirtis buvo aptiktas nevėžinės skrandžio ląstelėse, bet ne vėžinių ląstelių, kurios parodė raiška Bax
ir nesant Partnerystės taikos labui
.
Išvada
dabartis tyrimas rodo (A) tęsėsi skatina skrandžio vėžiu, Tačiau buvimas kalkių skatino didesnį ląstelių transformaciją ir tokiu būdu sukūrė vėžį anksčiau, (b) pasipiktinimas sudedamosiose chromosomos segregacijos mašinų galėtų dalyvauti pradiniame proceso kancerogeniškumo ir (c) ankstyvas Anafaza svarbą atrankos persekiotoją identifikavimo mitozinių Checkpoint defektų per anksti dienų.
Raktiniai žodžiai
chromosomų nestabilumas mitozinę Checkpoint genai Securin
Apoptozę Fono
Stemplės suragėjusių ląstelių karcinoma (ESCC) ir skrandžio vėžio yra dažniausios vėžio Indijoje, su aukščiausia dažnis ESCC yra šiaurės rytų Indijos valstijos ir teritorijos [1]. Yra aiškių požymių, dėl priežastinio ryšys tarp Areca-veržle arba quid kramtomoji įpročius ir šių vėžio. Keletas tyrimų įvairių rūšių gyvūnais parodė teigiamą indukcijos auglių tiek taikinį (skruosto maišelis, stemplės ir skrandžio) ir netiksliniams (plaučių ir kepenų) audinių, kai arecoline (ARC) arba arekų riešutų ekstraktas vartojamas įvairiais būdais tokiems kaip [2] burnos intubacijos, sumaišyti su mityba [3], ir skruosto maišelis taikymo [4]. Todėl atrodo, kad metabolinės aktyvacijos alkaloidų reikia galutinį konvertavimo į aukščiausią kancerogenų, kurie stipriai įtakoja fiziologinius sąlygų ir buvimo tam tikrų veiksnių [5]. Ataskaitos nurodė kartos reaktyvių deguonies formų (ROS) nuo arekų riešutų ingredientų pagal šarminėje terpėje [6, 7]. Dėl kalkių buvimo betelio-quid rengimo, arekų riešutų chewers "seilės paprastai keičia iš neutralios į šarminės būklės, kurios gali būti idealiai tinka kurti ROS [7]. Nair ir kt. [6] taip pat pažymėjo, kad be ARC, automatinis oksidacija arekų riešutų polifenolių gali generuoti O 2O 2 ir superoksido radikalai at šarminės pH.
Atsižvelgiant Meghalaja, Indija, iš įvairių valstybės arekų riešutų, lokaliai vadinamas "Kwai", yra naudojamas kaip neprinokę ir neperdirbto žaliavinio forma, kuri turi didesnes turinį kurių sudėtyje yra alkaloidų, polifenolių ir taninų, palyginti su sausos formos [8]. Betelio-quid naudojamas Meghalaja yra žalias Areca riešutų (RAN), kalkių pastos ir mažą betelio palmių lapais be tabako ir kitų sudedamųjų dalių. Čia žmonės nuryti visą quid po kramtomoji vietoj spjaudytis jį, kuris gali būti svarbus veiksnys ESCC ir skrandžio vėžio. Neseniai 40% stemplės vėžio surinkti pacientų Meghalaja narė, tik RAN-kramtomąją įpročio mėginiai parodė naikinimui Mikrosatelitinis žymenų D9S1748 ir D9S1749 netoli nuo Exon 1β iš CDKN2A /ARF
geno ne 9p21. Projekto rengėjas hypermethylation iš CDKN2A
genas buvo gerokai didesnis mėginių su RAN-kramtymo įpročio vien nei turintys naudojimo įpročiai ir pribėgęs tabako [9]. Iki šiol mes nežinome daug apie pradinis kelias apima į betelio riešutų susijusių kancerogenezėje į stemplę ir skrandį. Taip pat sunku įvertinti tik efektai ir daugiausia arekų riešutų sukeltos genetinius pakitimus žmogaus netrukdomam kitų Sudėties veiksnių, pavyzdžiui, tabako kramtymo ar rūkymo, alkoholio vartojimo, įvairių tipų ne vegeterian maisto ir tt Be to, buvimas kalkių daro šarminės būklės, kuri nėra ideali in vitro pervežimas ląstelių kultūrą, todėl iš Areca-veržle poveikio negalima išbandyti ląstelių kultūroje sistemas. Atsižvelgiant į šiuos, šis tyrimas buvo atliktas su pelėmis, kad patikrinti, ar RAN-ekstrakto gebėjimą su arba be kalkių, sukelti vėžį ir tuo pačiu metu įvertinti ekspresijos šabloną tam tikrų genų, kurie vaidina svarbų vaidmenį pradinio proceso kancerogenezės. Viesbutis The cheminė sudėtis ir farmakologiniai veiksmai Areca-veržle buvo pranešta ir peržiūrėjo kelių darbuotojų [10, 11]. Keletas gyvūnų tyrimai patvirtino, kad arekų riešutų produktai ir betelio palmių konkretūs nitrozaminai, turi gebėjimas sukelti neoplastiniq pokyčius eksperimentiniams gyvūnams [11]. Daug duomenys rodo, kad Areca-riešutų-alkaloidai, daugiausia arecoline (ARC) yra pagrindiniai veiksniai, BN-toksiškumą [11]. Buvo parodyta, kad ARC gali sukelti DNR nuostolius pelių kaulų čiulpų ląstelių [12] ir tokių DNR žalą gali būti sumažintas, kai ARC administruoja N-acetil-L-cisteino [13]. Todėl verta paminėti, kad šis tyrimas nebuvo skirtas izoliuoti visus aktyvius ingredientus iš RAN ir ieškoti savo veiksmus. Tyrimo tikslas buvo nustatyti pirminį kelią dalyvauti RAN susijęs kancerogenezėje pelėms ir todėl pelių buvo suteikta visa RAN-ekstraktas su ir be kalkių, siekiant imituoti vartojimo įprotis žmogaus.
Keletas genus, kaip ir p53 , 65 psl, Securin parsisiųsti ir daugelis kitų, yra žinoma, kad paprastai ekspresija kancerogenezėje [14-16] metu. Be to, genetinis nestabilumas taip pat susijęs su chromosomų nestabilumo (CIN), kuris veda į Aneuploidijos, vėžio požymis. Toks Aneuploidija gali palengvinti tumorigenezei per naviko slopintuvas genų funkcijos praradimo. Buvo pastebėta, kad dalinis praradimas mitozinio kontrolės punkto kontrolės veda prie CIN į žmogaus vėžio ląstelių [17, 18]. Todėl šiame tyrime mes įvertino išraiška modelio p53, 65 psl, Securin
ir kelių mitozės ir verpstės surinkimo Checkpoint genų skirtingu metu taškų. Mes pastebėjo, kad RAN gali sukelti skrandžio vėžį netrikdanti į chromosomos segregacijos mašinų dalys.
Metodai
paruošimas ekstraktų
Po kiaukutus pluoštines paltai iš neperdirbtos žaliavos ir neprinokę Areca-veržle (RAN), 100 g Ran buvo žemės ir sustabdytas 125 ml distiliuoto vandens ir gerai išmaišyti, kad sklandžiai pasta rengimo vandeninio ekstrakto RAN. Po to, kai 24 h, pasta buvo maišomas 3 valandas 37 ° C temperatūroje ir vandeninis ekstraktas buvo nucentrifuguojamos. Tai išskyrimo procedūrą buvo pakartotas dar kartą, pridedant 125 ml vandens į liekaną. Abu ekstraktai buvo kartu, sudaro 100 g RAN 250 ml distiliuoto vandens, filtruojamas ir užšaldyti - 80 ° C temperatūroje. Filtratas liofilizuotas į Secfroid Lyolab BII Lyophilizer (Danija). Liofilinta masė buvo laikomas 4 ° C temperatūroje, kol naudojimo. Ekstraktas pateikta 0,9 g /100 g vandens-ekstrahuojama medžiaga.
Gyvūnai priežiūros ir gydymo
Šveicarijos Albino pelėms (25-30 gm), 2-3 mėnesių amžiaus buvo prižiūrimi, kad į Bendrijos narvuose laboratorijos kambaryje su kontroliuojama temperatūra (20 ± 2 ° C) ir reguliuojamą apšvietimą (12 h šviesos; 12 val tamsi). Standartinė pelė dieta (NMC Nafta Mills Ltd, Puna, Indija) ir vandens iki soties
buvo naudojami visų eksperimentų. Eksperimentai buvo atliekami laikantis įstaigoje patvirtintas gaires ir mūsų patvirtinti "institucinis standartų gyvūnų priežiūrai ir naudojimui" valdyba.
Set-1 tris grupes pelių (n = 25 kiekvienam) buvo imtasi, kurie buvo naudojama skirtingais laiko-taškų už skirtingų eksperimentinių analizė. Rinkinys-2, trys grupės pelėms (n = 15 kiekvienoje) buvo laikomi už naviko indukcinių studijas. 1 paveiksle schematiškai apžvalgą apie bendrą eksperimento protokolu, kuris buvo laikomas šiame tyrime. Kiekviename rinkinyje, viena grupė buvo gydomi paprasčiau geriamojo vandens, kuris laikomas neapdorotas kadangi dvi grupės buvo skiriami RAN išgauti iki soties
į geriamojo vandens su arba be kalkių (pH 9,8). Buvo apskaičiuota, kad kiekvienas pelės suvartoti 1 mg ekstrakto per dieną. Toks žodinis administeration buvo tęsiamas 60 dienų po to, kai kurių dozė buvo padidinta nuo 1 mg iki 2 mg per dieną iki 120 dienų. Taip pat, kaip kas 60 dienų vėliau dozė buvo padidinta 1 mg per dieną vartoti. 1 pav Srauto diagrama eksperimentinės dizaino žaliavinio Areca-veržle tarpininkaujant Kancerogeninis pelėms analizė. Atsitiktinių žaliavos arekų riešutų; D- dienas.
paruošimas metafazių ir netikėtai chromosomų aberacijos
Dėl metafazę preparato, kaulų čiulpų ląstelės (BMC) buvo surinkti iš dviejų pelių per tašką nuo neapdorotų, 15 ir 30 dienų gydytų pacientų grupėje ir trijų pelių per tašką poilsio. Apdorotame grupių BMC buvo surinkti po 15, 30, 60, 120 ir 180 dienų gydymo. BMC taip pat buvo surinkti iš dviejų pelių, kurių skrandžio naviko. BMC buvo surinkti po 2 h kolchicinavimo (15 mg /kg). Gyvūnai buvo nužudyti slankstelių dislokaciją. Šlaunikauliais buvo išpjaustytų iš ir BMC buvo išstumiamas injekcijų 2 ml 0,075 M KCl pašildyto iki 37 ° C. Ląstelės buvo gydomi hipotoninį tirpalą 15 min ir fiksuoto acto rūgšties ir metanolio (1: 3). Skaidres buvo paruošti liepsnos džiovinimo metodą, nudažomi 5% Giemsa 5 min ir sumontuotas sintetinėje terpėje. Vaizdai iš metafazėje pastos buvo imtasi pagal Zeiss® Axioskop mikroskopu (Vokietija).
Chromosominio tyrimo, skaidrės buvo koduojami atsitiktinai ir ne mažiau kaip 100 ir išplito metafazėje plokštelės buvo pasirinktas tyrimo kiekvienos pele. Mes atlikome chromosomų skaičių nuo metafazę plitimą. Chromosomų aberacijos pelnė kaip isochromatid pertraukų ir chromatidės pertraukos. Žiūrėti Extended eksperimentų, dėl detalių papildomo failo 1:. Papildoma informacija
imunoblotas
ląsteles nuo kaulų čiulpuose, stemplė (braižymo vidinis sluoksnis) ir skrandžio (braižymo vidinė dalis) du kartus praplaunamos PBS (fosfato buferinis tirpalas) ir buvo lizuoti į radioimmuno-kritulių buferiniu tirpalu (0,1% SDS, 2 mM EDTA, 1% NP-40, 1% natrio deoksicholatui, 50 mM natrio fluoridas ir 100 V /ml aprotininą). Po to, kai 30 min inkubavimo ant ledo, kad ląstelių Lizatai centrifuguojamas 15 min, esant 4 ° C temperatūroje ir baltymų kiekis buvo nustatomas naudojant bicinchoninic rūgštis baltymų testą. Vienodas baltymų kiekis (40 mikrogramų) Iš kiekvieno mėginio buvo pakrautas į kiekvieną duobutę; lygus pakrovimo buvo patikrinta munoblotingu su aktino antikūnų. Mėginiai buvo įdėtas Novex tri-glicinas 4-20% statumo geliai ir elektroforezės buvo atliktas NuPAGE elektroforezės sistemos (Invitrogen, JAV). Baltymai buvo perkeltas į polivinilideno difluoridas (PVDF) membraną (sigma), po įprastiniame protokole. Membranos buvo tyrinėjo su 1: 1000 praskiesti pelės monokloninis antikūnas prieš p53
(PAB 240; AB-26; Abcam, JAV), Bax
(6A7; ab5714; Abcam, JAV), Securin
(DCS-280; ab3305; Abcam, JAV), β-aktino
(AC-15; ab6276; Abcam, JAV) ir triušių polikloninis antikūnas prieš NF-κβ 65 psl
(ab31481; bcam, JAV). Dėmės buvo plaunamos 3 kartus 10 min kiekvienas TBST buferinio tirpalo pH 7,6 (1 M Tris Cl, 5 M NaCl ir 0,05% Tween 20) ir inkubuojama su antriniu antikūnu (šarminės-fosfatazės konjuguoto anti-pelės IgG arba šarminių fosfatazės konjuguoto antirabbit IgG 1: 2000; Abcam, JAV) 1 valandą, o esant kambario temperatūrai. Po išsamių plovimo, The dėmė buvo panardintas į 4 ml substrato tirpalas BCIP /NBT (Bangaloras genei, Indija). Pakankamas dažymo buvo gautas per 15 min. Kiekvienas imunoblotas buvo atliktas trijų pelių už tašką.
Organų įvertinimas
skrandžio audinyje buvo surinkta iš nevalytų kontrolės ir iš dviejų RAN + kalkių pelių su naviko. Kitoje rinkinio, skrandžio audinio taip pat buvo surinkti iš neapdorotas, taip pat iš grupių, kad, gydytų 300 dienų su RAN-ekstrakto su ir be kalkių. Trys pelės buvo atsitiktinai atrinkti iš kiekvienos grupės. Šios pelės neturėjo naviko požymių išoriškai. Audinių skyriai (5-7 mkm) buvo tvarkomi histologinio pjūviu, kaip nurodyta įprastiniame protokole [19] ir tamsintas hematoksilinu ir eozinu [20]. tada skyriai buvo stebima šviesos mikroskopu ir fotografavo ( "Carl Zeiss, Vokietija).
RNR gavybos ir paprastųjų RT-PGR metodu
Ląstelės buvo renkami braižymo vidinį sluoksnį stemplės ir skrandžio nuo neapdorotų kontrolės, bėgo ir bėgo + kalkių elgiamasi pelė (trijų pelių, kurių vienam taške). Kaulų čiulpų ląstelės buvo surinkti iš šlaunikaulio kaulų pele. Iš viso RNR buvo išskirta su Trizol ir tada išgrynintas naudojant RNeasy Mini rinkinį (QIAGEN) pagal gamintojo protokolą. Atvirkštinės transkripcijos buvo atliktas su 1 mikrogramų visų RNR iš kiekvieno mėginio, naudojant Quantiscript atvirkštinės transkriptazės, Quantiscript RT-buferio ir RT Primer-mix QuantiTect atvirkštinės transkripcijos rinkinys (Qiagen GmbH, Hilden, Vokietija) pagal gamintojo protokolą. Stiprinimas kDNR buvo atlikta 20 mikrol tirpalas, kuriame yra 2 mikrol kDNR, 10 pmol pradmenų poros Aurora A Aurora B, Mad2, Bub1 ir GAPDH (už pradmenų sekas žr Papildoma failą 1: papildoma informacija), o 10 įxL RT qPCR magistras mišinys (Qiagen GmbH Hilden, Vokietija). PGR sudarė pradinio denatūruojant 94 ° C temperatūroje 5 min, o po to 30 reakcijos ciklų (30 sekundžių 94 ° C temperatūroje, 30 sekundžių 60 ° C, ir 30 sekundžių 72 ° C temperatūroje) ir galutinį ciklą, 72 ° C 10 min. GAPDH buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. Visi PGR produktai buvo atskiriama elektroforezės būdu ant etidžio bromido-nudažomi agarozės gelyje ir vizualizuojami su UV šviesos.
Tėkmės citometrijos analizė ląstelių
pelių kaulų čiulpų ląstelės ir ląstelės surenkamos braižymo vidinis sluoksnis pagamintas iš stemplės ir skrandžio abiejų neapdorotas ir apdorojimo už 260 dienų su RAN su kalkių arba be fiksuota 70% etanolio. Skrandžio naviko ląsteles, taip pat buvo surinkti ir fiksuotas. Fiksuotos ląstelės buvo išplautos PBS ir resuspenduojamos 500 pL propidiumo jodido tirpalo (50 mikrogramų /ml propidiumo jodido, 0,2 mg /ml RNaze) už 1 h kambario temperatūroje tamsoje. 10000 ląstelės buvo įsigyta kiekvieno mėginio ir analizuojami su FACS Calibur (Becton Dickinson-). CELLQuest Pro "programinė įranga buvo naudojama kiekybiškai ląstelės ciklo skyrių apskaičiuoti ląstelių pasiskirsto skirtingų ląstelių ciklo fazėse procentą.
Aneksinu ženklinimo studijas
Apoptozė ląstelių mirtis buvo įvertintas naudojant annexinV-fluoresceino izotiocianato metodą skrandžio naviko ląstelių ir taip pat į vidinis sluoksnis pagamintas iš ląstelių, skrandžio ir stemplės neišvalytų ir RAN su ir be kalkių apdoroto pelės po 260 dienų nepertraukiamo administeration. Ląstelių nuosėdos buvo resuspenduotos PBS. Ląstelės buvo tamsintas su propidiumo jodido ir aneksino-V-FITC naudojant BD PharmingenTM aneksinu: FITC apoptozę Detection Kit (BD-Pharmingen biomokslų, San Diego, CA), kaip už gamintojo nurodymus. Trumpai, po to, kai surinkimo ir skalbimo du kartus su PBS, ląstelės buvo resuspenduotos prisirišimo buferiniu tirpalu (500 pl). FITC ir prie aneksino-V (5 mikrol) buvo įtraukta į ląsteles, po to pridedant 5 mikrol, PI pagal protokolą. tada mėginiai buvo inkubuojamos 15 min į kambario temperatūroje tamsoje ir veikiamas tėkmės citometrijos vertinimo.
statistinę analizę
Reikšmės pateikti kaip vidurkis ± SEM arba vidurkis ± SEM kontrolei ir eksperimentinių pavyzdžių ir statistinę analizę buvo atliktas pagal Stjudento t testą su GraphPad Prism programinė įranga 5.1. buvo laikomi statistiškai reikšmingas vertybes, jei p reikšmė buvo 0,05 ar mažiau.
rezultatai
Bendrosios pastabos
iš penkiolikos pelių, dvi pelės sukūrė skrandžio vėžiu po 220 ir 256 dienų šėrimo RAN išgauti kalkėmis (pav 2A a ir b). Nėra auglys buvo sukurta pele arba neapdorotas arba administruoja tik RAN. Histologinis skyriuje aiškiai skirtųsi nuo įprastos (2a pav C) ir navikinio skrandžio (2a pav D-F). Tačiau histologinis preparatas skrandžio audinių taip pat buvo pagamintas iš trijų akivaizdžiai normaliai ieško pelių atsitiktinai atrinktų iš šios grupės po 300 dienų šeriant RAN-ekstrakto su ir be kalkių. Tiek RAN ​​su ir be kalkių parodė savo sugebėjimą sukelti vėžį skrandį. Du iš trijų pelių, vartojusių tik RAN ​​parodė priešvėžiniai etapas (displazija), o visi trys pelės gydomi RAN + kalkių parodė karcinoma (2b pav.) 2 išpjaustytų pelės pav and histopathology tiek įprastinių, tiek vėžinių audinių skrandžio po gydymo RAN su ir be kalkių. A. išpjaunamas pelė su (a) įprastinis skrandžio ir (b) navikinio skrandžio nurodyta su rodykle. Histopathology normalaus (c) ir naviko skrandžio (d, e ir f) tas, kurį sukelia RAN ekstrakto kalkėmis. Strėlės rodo, opą neoplazmų (D) ir naviko gigantiškų ląstelių (e ir f). Priartinimas yra nurodyta arba 10X arba 40X. B. Histopatologiniai normalus ir navikinio skrandžio pelių po RAN ir bėgo + kalkių gydymo 300 dienų. Visais plokščių, "Normalus" rodo, pelėms su ne auglys, "displazija" rodo peles su ikivėžinių skrandžio audinio. "Vėžys" rodo peles su navikinio skrandžio. Displazija rodo anisokaryosis (variacijos dydį branduolių) ir anizocitozė (variacijos dydį ląstelių). Priartinimas yra nurodyta arba 10X, 40X ir 100x.
Tiriamas metafazėje plinta
nustatyti, ar nuolatinis administeration Ran ekstrakto (nuo 15 iki 180 dienų) su arba be kalkių turi įtakos chromosomų, mes studijavo metafazės pastos , po to, kai 2 h gydymo kolchicino, kaulų čiulpų tyrimai. Duomenys parodė, palaipsniui didinti mitozės skaičiais su per anksti atskirtiems sesuo chromatidžių, (3a ir C pav) tiek RAN ​​ir bėgo + kalkių administruoja pele, palyginti su nė į neapdorotų pelių. Taip pat iš tyrimo, kuri tęsėsi + kalkių administruoja pelių kaulų čiulpų parodė žymiai didesnį dažnį tokį ankstyvas Anafaza nei tik RAN ​​administruoja (3a pav) aiškus. Po 180 dienų nepertraukiamo administeration Ran + kalkių, 34,4% ankstyvas Anafaza, palyginti su 18,4% (p = 0,002) į RAN-administruoja pelės BMC buvo pastebėtas. 3 pav Kariotipas analizė genomo nestabilumo kaulų čiulpų ląstelių pelės po kontakto su RAN ekstraktą (RAN + L) arba be kalkių (RAN). (A), procentas metafazių su priešlaikinio sesuo chromatidžių atskyrimo. Dvi pelės per tašką neapdorotas, 15 ir 30 dienų gydytų pacientų grupėje ir trys pelės per tašką poilsio. Bent 100 metafazėse pelnė kiekvienam pele. (B) Normalus metafazės plitimas nuo pelių kaulų čiulpų ląstelėms. (C), priešlaikinis sesuo chromatidžių atskyrimas nuo pele veikiami RAN. Kilpos parodyti sesuo-chromatidžių, gulėti atskirti mitozės skaičiai, kurie rodo fenotipą. (D ir E) metafazės plitimas parodė 37 ir 38 chromosomas, atitinkamai. (F, G ir H) metafazės plitimas parodė daugiau nei 60 chromosomas. (Aš) parodė daugiau nei 80 chromosomas.
Mes skaičiuojamas chromosomų metafazėje numeris plinta suprasti ankstyvas anaphases svarba atsižvelgiant į chromosomų stabilumo. Negydytos pelės turėti stabilią (2n = 40) kariotipas (3b pav) ir neparodė jokių aneuploidija ląsteles. Mes stebėti nedažnai pasitaikančius aneuploidija ląstelių (pav 3D-I 1 lentelė) į RAN vartojama, su ir be kalkių, 120 dienų ir tai buvo pažymėta, kad aneuploidija ląstelių dažnis laipsniškai didinama. Vidutinis dažnis (13,8%) iš aneuploidija ląstelių pelnytas tiek skrandžio naviko guolio pelių. Apskritai, aneuploidija ląstelių dažnis buvo didesnis po RAN + kalkių administeration nei vien RAN (1 lentelė) .table 1 Chromosomų analizė pelių kaulų čiulpų ląstelėms, po poveikio RAN ekstraktas su arba be kalkių
Gydymo modelis

gydymo dienomis

viso plitimas gavo
chromosomos nėra.
Aneuploidijos
Priešlaikinis sesuo

37
38
39
40
41
42
> 60

% (vidurkis)
Chromotidinė atskyrimas%
Neapdorotos
0
110
110
0
0
104
104
0
0
RAN
120
105
1
1
103
1,9
17,5
120
2
1
2
115 18,7
4,1
105
1
2
102
2,8 (2,9)
18,3 (18,2)
RAN + kalkių
100
2
2
1
95
5,0
31,7
105
2
2
3
98 28,6
6,6
110
3
2
1
103
1
6,4 (6,0)
28,3 (29,5)
p = 0.015A
RAN
180
101
1
2
1
97
3,9 pervežimas 18,0 pervežimas 124 pervežimas 2
2
1
119 17,7
4.0 pervežimas 114
3
2
1
108
5.3 (4.4) pervežimas 19,4 (18,4)
Ran + kalkes
112
3
3
3
103
8,0
32,6
105
2
2
1
98
1
1
6,6
34,9
110
4
2
101
2
1
8,2 (7,6)
35,6 (34,4)
p = 0.002a
Ran + kalkes
220
232
6
9
12
194
7
2
2
16,4
8,2
(su pažangiomis naviko)
256
234
5
4
7
208
5
2
3
11,1 (13,8)
7,1 (7,6)
statistiškai reikšmingas suporuotas t-testas; buvo parodyta dviejų-tailed p reikšmė.
Chromosomų aberacijos pelnė daugiausia chromatidės pertraukos. buvo stebimas labai mažas dažnis isochromatid pertraukas ir nerasta jokių mainų aberacijos. Iš chromatidės pertraukų ir neįprastos metafazių dažnis buvo palaipsniui didinama nuo 60 iki 180 dienų RAN-administeration su arba be kalkių. Žemiau RAN + kalkių administeration nei vien bėgo aberacijų dažnis buvo didesnis. Iš aberaciją dažnis buvo daugiau tiek pažangiosios skrandžio naviko guolis pelėms. (Dėl aberacijos informacijos žr Papildoma failą 1: papildoma informacija).
Sumažinta išraišką mitozės ir verpstės Checkpoint genų Ran gydytų pelių
Atsižvelgiant į minėtų tyrimų, mes išnagrinėjo AuroraA, AuroraB, MAD2 išraiška parsisiųsti ir Bub1
genai kaulų čiulpuose, stemplės ir skrandžio ląstelėse tų pelių, kurios buvo neapdorotas arba duodamas RAN ekstraktas su ir be kalkių už 120, 180 ir 260 dienų. Įprasti RT-PGR rezultatai (4 paveikslas) rodo, kad duomenys, surinkti iš stemplės ir skrandžio ląstelės parodė daugiausia nepakankamai išraiškos šių genų atžvilgiu neapdorotas vieną ir tokių nepakankamai išraiška buvo nuoseklus ir reikšmingas RAN + kalkių administruojami pelių. Tačiau visų šių genų BMC išraiška nepasikeitė bet gerokai būdu, išskyrus per išraiška Mad2
ir Bub1
buvo pažymėta pele BMC surinktų po 260 dienų administeration. 4 paveiksle viršutiniame skydas- išraiška mitozės Checkpoint genų pelių kaulų čiulpuose (BM), stemplės ir skrandžio ląstelės po kontakto su RAN ekstraktas su arba be kalkių už 120, 180 ir 260 dienų. Žemutinė skydas- Kiekybinis densitometric analizė ekspresijos profilio mitozinę Checkpoint genų iRNR lygio stemplės ir skrandžio ląstelėse po 260 dienų nuo poveikio buvo parodyta. Vertės yra vidurkis ± SEM trijų nepriklausomų eksperimentų. Reikšmės yra normalizuojamas atitinkamų GAPDH vertybes. * P < 0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001. Reikšmingai skiriasi lyginant su neigiamu /teigiamu kontrolės (kaip nustatyta suporuotas t-testas).
Analizė per genų per imunoblotas
Lygiai p53, 65 psl, Bax parsisiųsti ir Securin
BMC nuo pelių po administeration Ran ekstraktas su arba be kalkių 60, 90 ir 180 dienų, ir tas stemplės ir skrandžio po 180 dienų šėrimo buvo išnagrinėti munoblotingu. Lygiai šių baltymų taip pat buvo išbandytas iš ląstelių surinktų audinių-protingas iš nedengtų pelių. Rezultatai rodo, kad p53, 65 psl, Bax
ir Securin išraiškos
gerokai padidėjusi visoms RAN administruojamų pelių audiniuose. Toks patobulinimas buvo reikšmingai didesnis RAN + kalkių nei tik RAN ​​administruojamų pelių (5 paveikslas). 5 pav viršutiniame skydas- atstovas imunoblotingu aptikimas 65 psl, p53, securin, Bax ir beta-aktino pelių kaulų čiulpuose (BM), stemplės ir skrandžio ląstelės po kontakto su RAN ekstraktas su arba be kalkių. BM, ląstelės buvo renkami po 60, 120 ir 180 dienų, tuo tarpu stemplės ir skrandžio ląstelės buvo surinkti tik po 180 dienų nuo poveikio. beta-aktino buvo naudojamas kaip krovimo valdymu. Žemutinė skydas- Kiekybinis densitometric analizė baltymų minėtų genų kaulų čiulpų lygyje, stemplės ir skrandžio ląstelės po 180 dienų nuo poveikio buvo parodyta. Reikšmės yra vidurkis ± SD trijų nepriklausomų eksperimentų. Reikšmės yra normalizuojamas atitinkamų beta-aktino vertybes. * P < 0,05; ** P < 0,01 Žymiai skiriasi lyginant su neigiamu /teigiamu kontrolės (kaip nustatyta suporuotas t-testas).
Tėkmės citometrijos tyrimus ląstelės ciklo ir aptikimo apoptozinių ląstelių dviguba dažymo ir munoblotingu pervežimas srauto citometrijos analizę DNR kiekį kaulų čiulpuose , stemplės ir skrandžio ląstelės surinktų po 260 dienų RAN + kalkių administracija (6a pav) pele parodė, kad ten buvo G1 fazės ląstelių ir kaulų čiulpuose ir stemplės padidėjimas dėl nevalytų kontrolę. Tačiau, skrandžio, ląstelių nehigieniškuose-G1 fazės procentas buvo padidintas, kuris gali būti priskirta dėl apoptozės ląstelių žūtį. Norėdami patvirtinti, buvo atliktas dvejopo nudažant annexinV ir PI. Duomenys 5B pav rodo padidėjusią teigiamą dažymą aneksino-V į 3 kvadrantą 2 ir skrandžio ląstelėse, bet ne stemplės ląstelių RAN + kalkių administruojami pelių. 6 pav analizė ląstelės ciklo ir apoptozė pelėms gydomiems RAN su kalkių (A) analizė ląstelės ciklo po 260 dienų ekspozicijos RAN išgauti kalkėmis kaulų čiulpų, stemplės ir skrandžio ląstelių pelės, taip pat iš skrandžio naviko ląstelių. (B), atstovas cytograms aneksino V, palyginti su PI fluorescencijos intensyvumo, kaip nustatyta tekmės citometrijos analizės pelių stemplės ir skrandžio ląstelėse po 260 dienų ekspozicijos RAN kalkėmis ir nuo skrandžio naviko ląstelių. Per cytogram, kvadrantas 1 ir 2 atstovauti ankstyvos ir vėlyvos apoptozinių ląsteles, atitinkamai; kvadrantas 3, gyvybingos ląstelės; kvadrantas 4, negyvas ląsteles. (C) imunoblotingu už apoptozinių žymenų Normal (neapdorotas) ir naviko skrandžio ląstelių. β-aktino buvo naudojamas kaip krovinio kontrolę.
Įdomu, tėkmės citometrijos analizę vėžinių ląstelių, surinktų iš pelių, kurios sukūrė auglį skrandyje po 220 ir 256 dienų nepertraukiamo administeration Ran ir kalkių, atskleidė gerokai sumažinti G1 ląstelės su kartu didėja sub-G1 ląstelės (6a pav.) Dvigubas dažymo rodo, kad sub-G1 ląstelės dažniausiai Nekrotinio negyvas ląsteles (Quadrant 4) (6b pav.) Žymiai aukštesnio lygio p53
ir BAX
baltymų buvo pastebėtas naviko nei normalių skrandžio ląstelių (6c pav). Tačiau buvo nustatyta PARP
nebūti tiek naviko ląstelių, skrandžio, nors PARP parsisiųsti ir jos 29 kDa suskaldyti produktas dalyvavo normaliomis skrandžio mėginius (6c pav.)
Diskusijos
metu tyrimas buvo atliktas norėdami pamatyti, jei iki soties
administeration Ran ekstraktas su arba be kalkių geriamajame vandenyje gali sukelti stemplės arba skrandžio vėžio pele ir, jei jis daro, ką pradinis procesais. Šiame tyrime, pelėms buvo suteikta visa RAN-ekstraktas su ir be kalkių siekiant imituoti žmonių maistui stilių RAN. Be to, dozė buvo taip pat periodiškai padidėjo, kaip tai atsitinka žmogui. Mūsų rezultatai parodė, kad tiek bėgo su ir be kalkių sukelti skrandžio vėžiu, nors, pažymėtina, kad buvimas kalkių Ran skatino didesnį ląstelių transformaciją ir taip sukūrė skrandžio vėžį anksčiau nei RAN vieni. Atrodo, kad vėžys buvo indukuota skrandžio, nes yra daugiau poveikio jos pamušalas turėjo RAN, o geriamojo RAN maišyti vandens per stemplės pamušalas buvo veikiami tik trumpai.
Ji buvo įrodyta, anksčiau, kad šarminis pH yra idealus generuoti ROS iki autoxidation iš arekų riešutų polifenolių [6, 7]. Ji taip pat buvo parodyta, kad katechinas frakcija arekų riešutų ekstrakto aktyviai sukuria ROS ne šarminės pH, kuris sukelia DNR žalą in vitro
[21, 22]. Visi autoriai skaityti ir patvirtino galutinį rankraštį.

• Išraiška linija-1 endonukleazės variantu skrandžio vėžiu: jo asociacija su klinikos parametrus
• Gastroprotektinio mechanizmas Paederia foetida linn. (Rubiaceae) - populiarus valgomųjų augalų naudojami genčių bendruomenės šiaurės rytų India