Induktion von Chromosomen Instabilität und Magenkrebs durch das Expressionsmuster von mitotischen checkpoint Gene in Mäusen zu verändern areca-nut

Induktion von Chromosomen Instabilität und Magenkrebs durch Änderung des Expressionsmusters von mitotischen checkpoint Gene in Mäusen ausgesetzt areca-nut
Zusammenfassung ausgesetzt
Hintergrund
Es gibt starke Anzeichen für einen kausalen Zusammenhang zwischen Areca-Nuss Verbrauch und Krebserkrankungen. In Meghalaya, Indien, ist die Vielfalt der Areca-Nuss als roh und unverarbeiteter Form, deren chemische Zusammensetzung und pharmakologischen Wirkungen berichtet wurden verwendet. Wir wissen jedoch wenig über die erste Bahn in areca Mutter zugeordnet Karzinogenese beteiligt, da es schwierig ist, seine Auswirkungen auf die genetischen Veränderungen, ohne andere Faktoren Compoundierung Interferenz zu bewerten. Daher wurde dieser Studie bei Mäusen unternommen, um die Fähigkeit von rohem Areca-Nuss (RAN), um sicherzustellen, Krebs zu induzieren und die Expression bestimmter Gene in der Karzinogenese beteiligt zu überwachen. Diese Studie wurde keine Wirkstoffe aus der RAN zu isolieren soll und deren Wirkung zu suchen.
Methods
Drei Gruppen von Mäusen (n = 25 in jeder) wurden zu verschiedenen Zeitpunkten für verschiedene experimentelle Analyse entnommen und . Die anderen drei Gruppen von Mäusen (n = 15 in jeder) wurden zur Tumorinduktion Studien betrachtet. In jedem Satz wurden zwei Gruppen RAN-Extrakt verabreicht ad libitum
im Trinkwasser mit oder ohne Kalk. Die Expression bestimmter Gene wurde durch herkömmliche RT-PCR und Immunoblotting untersucht. Die Mäuse wurden die ganze RAN-Extrakt mit und ohne Kalk, um den menschlichen Verzehr Stil von RAN zu imitieren gegeben.
Ergebnisse | Histologische Herstellung von Magengewebe ergab, dass Magenkrebs induzierte RAN. Eine allmähliche Zunahme der Häufigkeit von precocious Anaphase und aneuploid Zellen in den Knochenmarkzellen mit einer größeren Schrittweite folgenden RAN + lime administeration beobachtet. Levels von p53, Bax, Securin
und p65
in der Speiseröhre und Magen-Zellen wurden während der frühen Tage von RAN Exposition erhöht, während diejenigen von verschiedenen mitotischen Checkpoints Proteine ​​nach unten reguliert wurden. Der apoptotische Zelltod wurde in nicht-Krebs Magen-Zellen, aber nicht in Tumorzellen nachgewiesen, die eine Überexpression von Bax
und Abwesenheit von PARP
zeigte.
Fazit
vorliegende Studie vorgeschlagen (a) RAN Magenkrebs induziert, jedoch Gegenwart von Kalk gefördert höhere Zelltransformation und damit entwickelt Krebs früher, (b) Störungen in Komponenten der Chromosomensegregation Maschinen konnten in der Anfangszeit der Kanzerogenität und (c) die Bedeutung der altklug anaphase als Screening-Marker für die Identifizierung beteiligt sein der mitotischen Checkpoints Mängel während der frühen Tage.
Schlüsselwörter Chromosome Instabilität mitotischen Checkpoints Gene Securin
Apoptosis hintergrund und Plattenepithelkarzinom des Ösophagus (ESCC) und die Magen-Krebs sind die häufigsten Krebsarten in Indien, mit dem höchsten Inzidenz von ESCC im Nordosten der Staaten Indiens [1] zu sein. Es gibt starke Anzeichen für einen kausalen Zusammenhang zwischen Areca-Nuss oder quid Kauen Gewohnheiten und diese Krebsarten. Mehrere Studien in verschiedenen Tierarten haben positive Induktion von Tumoren in beiden Ziel (Wangentasche, Speiseröhre und Magen) und Nicht-Ziel (Lunge und Leber) Gewebe, wenn Arecolin (ARC) oder Areca-Nuss-Extrakt gezeigt durch verschiedene Mittel verabreicht wurde so als orale Intubation [2], gemischt mit der Ernährung [3], und Wangentasche Anwendung [4]. Daher scheint es, dass metabolische Aktivierung von Alkaloiden zur endgültigen Umwandlung in die ultimative Karzinogene benötigt wird, die stark von physiologischen Bedingungen und in Gegenwart von bestimmten Faktoren beeinflusst wird [5]. Berichte haben Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) von Areca-Nuss Zutaten unter alkalischen Bedingungen angegeben [6, 7]. Aufgrund der Anwesenheit von Kalk in betel-quid Zubereitung, areca-nut chewers 'Speichel ändert typischerweise von neutral bis alkalischen Bedingungen, die zur Erzeugung von ROS ideal sein könnte [7]. Nair et al. [6] haben auch darauf hingewiesen, dass neben ARC, Auto-Oxidation von Areca-Nuss Polyphenole könnte erzeugen H 2 O 2 und Superoxid-Radikalen bei alkalischen pH-Wert.
Im Staat Meghalaya, Indien, die Vielfalt der Arecanuß, lokal 'Kwai "genannt, als unreif und nicht verarbeitete Rohform verwendet werden, die einen höheren Gehalt an Alkaloiden, Polyphenole und Tannine hat als auf die getrocknete Form verglichen [8]. Die Betel-quid in Meghalaya verwendet wird, enthält rohes Areca-Nuss (RAN), Kalkpaste und kleinen Teil der Betelblatt ohne Tabak und andere Bestandteile. Hier Menschen schlucken die ganze quid nach dem Kauen, anstatt es zu spucken, die ein wichtiger Faktor für ESCC und Magenkrebs sein könnte. Vor kurzem 40% Speiseröhrenkrebs Proben von Patienten von Meghalaya Zustand gesammelt nur RAN-Kauen Habitus zeigte Löschung der Mikrosatelliten-Marker D9S1748 und D9S1749, in der Nähe bei 9p21 1β von CDKN2A /ARF
Gen Exon. Der Promotor-Hypermethylierung von CDKN2A
Gen war signifikant höher als bei den Proben mit der Gewohnheit des RAN-Kauen allein als die Gewohnheit der Verwendung sowohl RAN und Tabak mit [9]. Bis jetzt wissen wir nicht viel auf die anfängliche Weg in Betelnuß assoziierten Karzinogenese in der Speiseröhre und Magen geht. Es ist auch schwierig, die Auswirkungen der rein und überwiegend areca-nut-induzierten genetischen Veränderungen in menschlichen ohne Störung durch andere Faktoren wie Compoundierung Kautabak oder Rauchen, Alkoholkonsum, verschiedene Arten von nicht-vegeterian Nahrungsmittel usw. Außerdem beurteilen zu können, das Vorhandensein von Kalk macht einen alkalischen Bedingungen, die für in-vitro-Zellkultur
nicht ideal ist und daher die Wirkung von Areca-Nuss kann nicht in Zellkultursystemen getestet werden. Im Hinblick darauf wurde die vorliegende Studie an Mäusen durchgeführt, die Fähigkeit des RAN-Extrakt mit oder ohne Kalk zu verifizieren, Krebs zu induzieren und gleichzeitig das Expressionsmuster von bestimmten Genen, die eine wichtige Rolle in dem anfänglichen Prozess der Karzinogenese spielen bewerten.
Die chemische Zusammensetzung und pharmakologische Wirkungen von Areca-Nuss wurden von mehreren Arbeitern berichtet und überprüft worden [10, 11]. Mehrere Tierstudien haben bestätigt, dass Areca-Nuss-Produkte und Betel spezifischen Nitros, haben die Fähigkeit, neoplastischen Veränderungen bei Versuchstieren [11] zu induzieren. Erhebliche Hinweise darauf, dass Areca-Nuss-Alkaloide, überwiegend Arecolin (ARC) sind die wichtigsten Faktoren bei der BN-Toxizität [11]. Es war diese ARC gezeigt, DNA-Schäden in Maus-Knochenmarkszellen [12] und solche DNA-Schäden induzieren kann reduziert werden, wenn ARC mit N-Acetyl-L-cystein [13] verabreicht wird. Daher ist es erwähnenswert, dass die vorliegende Studie nicht von der RAN keine Wirkstoffe zu isolieren sollte und seine Wirkung zu suchen. Das Ziel der Studie war es, den ursprünglichen Weg in RAN-assoziierten Karzinogenese in Mäusen und damit Mäuse beteiligt zu identifizieren, wurden mit den ganzen RAN-Extrakt gegeben und ohne Kalk, um den Verbrauch Gewohnheit des Menschen zu imitieren.
Mehrere Gene, wie p53 , p65, Securin Karten und viele andere, sind dafür bekannt, in der Regel während der Karzinogenese [14-16] überexprimiert werden. Darüber hinaus ist die genetische Instabilität auch mit Chromosom Instabilität (CIN) zugeordnet ist, die zu Aneuploidie führt, ein Markenzeichen von Krebs. Solche Aneuploidie kann Tumorigenese durch den Verlust von Tumor-Suppressor-Gen-Funktion zu erleichtern. Es wurde beobachtet, dass der teilweise Verlust der mitotischen checkpoint Kontrolle CIN führt in menschlichen Krebszellen [17, 18]. Daher wird in der vorliegenden Studie haben wir die Expressionsmuster von p53, p65, Securin Karten und mehrere mitotische und Spindelanordnung checkpoint Gene zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Wir beobachteten, dass RAN Magenkrebs durch Stören der Komponenten der Chromosomensegregation Maschinen induzieren kann.
Methoden
Herstellung von Extrakten
die faserigen Schichten aus unbehandelten rohen und unreife areca Mutter (RAN) Nach dem Beschuss wurden 100 g von RAN wurden gemahlen und in 125 ml destilliertem Wasser und gründlich gemischt, um ein den glatte Paste für die Herstellung eines wässrigen Extrakts von RAN suspendiert. Nach 24 h wurde die Paste für 3 h bei 37 ° C und der wässrige Extrakt wurde durch Zentrifugation gesammelt gerührt. Dieses Extraktionsverfahren wurde noch einmal wiederholt, indem 125 ml Wasser zu dem Rückstand hinzugefügt wird. Beide Extrakte wurden vereinigt, was 100 g des RAN in 250 ml destilliertem Wasser, filtriert und gefroren bei - 80 ° C. Das Filtrat wurde in einem Secfroid Lyolab BII Lyophilizer (Dänemark) lyophilisiert. Die gefriergetrocknete Masse wurde bei 4 ° C bis zur Verwendung aufbewahrt. Der Extrakt enthielt 0,9 g /100 g Wasser extrahierbaren Material.
Tiere Pflege und Behandlung
Swiss Albino-Mäuse (25-30 g), 2-3 Monate alt wurden im Labor in Gemeinschaft Käfigen in einem Raum gehalten mit kontrollierter Temperatur (20 ± 2 ° C) und kontrollierte Beleuchtung (12 h Licht, 12 h Dunkelheit). Standard-Maus-Diät (NMC Oil Mills Ltd., Pune, Indien) und Wasser ad libitum
in allen Experimenten verwendet wurden. Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts durchgeführt und durch unsere bewährten "Institutional Standards für Animal Care und Verwenden" Board.
In Set-1, drei Gruppen von Mäusen (n = 25 in jeder) aufgenommen wurden, die an verschiedenen verwendet wurden Zeitpunkte für verschiedene experimentelle Analyse. In Set-2 sind drei Gruppen von Mäusen (n = 15 in jeder) wurden zur Tumorinduktion Studien betrachtet. Figur 1 gibt einen schematischen Überblick über die allgemeine experimentelle Protokoll, das in dieser Studie betrachtet wurde. In jedem Satz wurde eine Gruppe mit einfachen Trinkwasser behandelt als unbehandelt sein, während zwei Gruppen wurden RAN ad libitum verabreicht extrahieren
im Trinkwasser mit oder ohne Kalk (pH 9,8). Es wurde geschätzt, dass jede Maus 1 mg Extrakt pro Tag verbraucht. Solchen oralen administeration wurde für 60 Tage fortgesetzt, wonach die Dosis von 1 mg bis 2 mg pro Tag bis 120 Tage erhöht wurde. Ebenso wurde von 1 mg pro Tag Verbrauch alle 60 Tage später die Dosis erhöht. Abbildung 1 Flussdiagramm der Versuchsplanung für die Analyse von rohem Areca-Nuss vermittelten Karzinogenese bei Mäusen. RAN- roh Areca-Nuss; d- Tage.
Herstellung von Metaphasen und Scoring von Chromosomenaberrationen
Für Metaphase Vorbereitung, Knochenmarkzellen (BMC) wurden aus unbehandeltem von zwei Mäusen pro Punkt gesammelt, 15 und 30 Tagen nach der behandelten Gruppe und drei Mäuse pro Punkt für den Rest. In den behandelten Gruppen wurden gesammelt BMC nach 15, 30, 60, 120 und 180 Tagen nach der Behandlung. BMC wurden auch aus den zwei Mäusen mit Magentumor gesammelt. BMC wurden nach 2 h Colchicin-Behandlung (15 mg /kg) gesammelt. Die Tiere wurden durch Genickbruch getötet. Die Femora wurden herauspräpariert und die BMC wurden durch Einspritzen von 2 ml 0,075 M KCl vorgewärmt auf 37 ° C ausgespült. (1: 3) wurden die Zellen in hypotonischer Lösung für 15 min fixiert und in Essigsäure und Methanol behandelt. Die Objektträger wurden durch die Flamme Trocknungsverfahren, gefärbt in 5% Giemsa vorbereitet für 5 min und montiert in synthetischem Medium. Bilder von Metaphasespreitungen wurden unter dem Mikroskop Zeiss Axioskop genommen (Deutschland).
Für chromosomale Studie wurden die Objektträger zufällig codiert und mindestens 100 gut verteilt Metaphaseplatten wurden für die Studie von jeder Maus ausgewählt. Wir führten Chromosomenzählungen auf Metaphasespreitung. Chromosomenaberrationen wurden als Isochromatiden Pausen und Chromatidbrüchen erzielt. Siehe Ausführliche experimentelle Verfahren für Details in der Zusatzdatei. 1: Ergänzende Informationen
Immunoblotting
Zellen aus dem Knochenmark, der Speiseröhre (durch innere Schicht Kratzen) und Magen (von Innenteil Kratzen) wurden zweimal mit PBS (Phosphat gepufferte Salzlösung) und wurden in Radioimmunpräzipitation Puffer (0,1% SDS, 2 mM EDTA, 1% NP-40, 1% Natriumdesoxycholat, 50 mM Natriumfluorid und 100 U /ml Aprotinin) lysiert. Nach 30 min Inkubation auf Eis wurden die Zell-Lysate 15 min bei 4 ° C und die Menge des Proteins zentrifugiert wurde unter Verwendung des Bicinchoninsäure-Proteintest bestimmt. Gleiche Menge an Protein (40 &mgr; g) aus jeder Probe in jede Vertiefung geladen wurde; gleiche Beladung wurde durch Immunoblotting mit Aktin-Antikörpern nachgewiesen. Proben wurden in Novex Tris-Glycin 4-20% Gradienten-Gelen und Elektrophorese geladen wurde in NuPAGE-Elektrophorese-System (Invitrogen, USA) durchgeführt. Proteine ​​wurden auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF) -Membran (Sigma) nach Standardprotokoll übertragen. Die Membranen wurden mit einer 1 sondiert: 1000-Verdünnung eines monoklonalen Maus-Antikörpers gegen p53
(PAb 240; ab-26; Abcam, USA), Bax
(6A7; ab5714; Abcam, USA), Securin
(DCS-280; ab3305; Abcam, USA), β-Actin
(AC-15; ab6276; Abcam, USA) und Kaninchen-polyklonalen Antikörpers gegen NF-κβ P65
(ab31481; BCAM, USA). Blots wurden jeweils in TBST-Puffer pH 7,6 (1 M Tris Cl, 5 M NaCl und 0,05% Tween 20) 3 mal für 10 min gewaschen und mit sekundärem Antikörper (mit alkalischer Phosphatase konjugiertem anti-Maus-IgG oder alkalische-Phosphatase-anti-Kaninchen-IgG konjugiert ist, inkubiert 1: 2000; Abcam, USA) für 1 h bei Raumtemperatur. Nach gründlichem Waschen wurde in 4 ml Substratlösung von BCIP /NBT (Bangalore Genei, Indien) der Blot eingetaucht. Ausreichende Färbung wurde innerhalb von 15 min erhalten. Jede Immunoblotting wurde in drei Mäuse pro-Punkt durchgeführt.
Histopathologischen Auswertung
Magengewebe wurde aus unbehandelten Kontrolle gesammelt und aus zwei RAN + Kalk behandelten Mäuse mit Tumor. In einem anderen Satz wurde Magengewebe auch von unbehandelten sowie aus den Gruppen gesammelt, die 300 Tage lang mit RAN-Extrakt behandelt mit und ohne Kalk. Drei Mäuse wurden zufällig aus jeder Gruppe ausgewählt wird. Diese Mäuse haben keine Hinweise von Tumor nach außen. Gewebeschnitte (5-7 &mgr; m) wurden gemäß dem Standardverfahren für die histologische Schnitte verarbeitet [19] und gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin [20]. Die Schnitte wurden dann unter einem Lichtmikroskop beobachtet und fotografiert (Carl Zeiss, Deutschland).
RNA-Extraktion und konventionellen RT-PCR-Analyse
Die Zellen wurden durch Abkratzen der Innenschicht der Speiseröhre und des Magens von unbehandelten Kontrolle, RAN und RAN gesammelten + Kalk behandelte Maus (drei Mäuse pro Punkt). Knochenmarkszellen wurden aus dem Oberschenkelknochen der Maus gesammelt. Gesamt-RNA wurde mit Trizol isoliert und dann das RNeasy Mini Kit aufgereinigt (Qiagen) nach dem Protokoll des Herstellers. Reverse Transkription wurde mit 1 ug Gesamt-RNA aus jeder Probe unter Verwendung Quantiscript Reverse Transkriptase, RT-Puffer Quantiscript und RT-Primer-Mischung aus QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) gemäß dem Protokoll des Herstellers. Amplifikation von cDNA in 20 ul Lösung, die 2 ul cDNA, 10 pmol Primerpaare für Aurora A durchgeführt wurde, Aurora B, Mad2, Bub1 und GAPDH (für Primer-Sequenzen finden Sie unter Weitere Datei 1: Zusatzinformationen) bzw. und 10 ul RT qPCR Mastermix (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland). Die PCR bestand aus anfängliche Denaturierung bei 94 ° C für 5 min, gefolgt von 30 Reaktionszyklen (30 Sekunden bei 94 ° C, 30 Sekunden bei 60 ° C und 30 Sekunden bei 72 ° C) und einem abschließenden Zyklus bei 72 ° C für 10 min. GAPDH wurde als interne Kontrolle verwendet. Alle PCR-Produkte wurden elektrophoretisch auf Ethidiumbromid-gefärbtes Agarosegel getrennt und mit UV-Licht sichtbar gemacht.
Durchflusszytometrische Analyse von Zellen
Maus-Knochenmarkzellen und die gesammelten Zellen durch die innere Schicht der Speiseröhre und des Magens sowohl Kratzen unbehandelt und für 260 Tage mit RAN mit oder ohne Kalk behandelt wurden mit 70% Ethanol fixiert. Magentumorzellen wurden ebenfalls gesammelt und fixiert. Die fixierten Zellen wurden in PBS resuspendiert und in 500 &mgr; l Propidiumjodid-Lösung (50 &mgr; g /ml Propidiumiodid, 0,2 mg /ml RNase) gewaschen, für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln. 10.000 Zellen wurden für jede Probe analysiert und mit einem FACS Calibur (Becton-Dickinson) erworben. Cellquest Pro-Software wurde verwendet, Zellzyklus-Kompartimenten zu quantifizieren den Prozentsatz an Zellen in den verschiedenen Zellzyklusphasen verteilt abzuschätzen.
Annexin V Markierungsstudien
apoptotischen Zelltod wurde unter Verwendung AnnexinV-Fluorescein-Isothiocyanat-Methode in den Magen-Tumorzellen und auch in der inneren Schicht von Zellen des Magens und der Speiseröhre von unbehandeltem und RAN mit und ohne Kalk behandelte Maus nach 260 Tage kontinuierlicher administeration. Das Zellpellet wurde in PBS resuspendiert. FITC Apoptosis Detection Kit (BD-Pharmingen Biosciences, San Diego, CA) gemäß Herstelleranweisung: Die Zellen wurden mit Propidiumiodid und Annexin-V-FITC mit BD PharmingenTM Annexin V gefärbt. Kurz gesagt, nach zweimal mit PBS Sammeln und Waschen in Bindungspuffer (500 &mgr; l) wurden die Zellen resuspendiert. FITC-Annexin-V (5 ul) wurde zu den Zellen durch Zugabe von 5 ul PI zugegeben, gefolgt nach dem Protokoll. Die Proben wurden dann für 15 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert und einer Cytometrie Auswertung zu fließen.
Statistical analysis
Werte als Mittelwert ± SEM ausgedrückt oder Mittelwert ± SEM für Kontroll- und experimentellen Proben und statistische Analysen wurden durchgeführt, von Student t-Test mit GraphPad Prism Software 5.1. Die Werte wurden als statistisch signifikant angesehen, wenn der p-Wert 0,05 oder weniger betrug.
Ergebnisse | Allgemeine Bemerkungen
von fünfzehn Mäuse, zwei Mäuse Magenkrebs nach 220 und 256 Tagen nach der Fütterung von RAN mit Kalk extrahieren entwickelt (2A a und b). Kein Tumor wurde in der Maus entwickelt entweder unbehandelt oder nur mit RAN verabreicht. Die histologischen Schnitt deutlich zwischen normal (2A c) und tumorösen Magen (2A d-f) unterschieden. histologischen Präparat von Magengewebe wurde jedoch auch aus dieser Gruppe nach 300 Tagen Fütterung mit RAN-Extrakt mit und ohne Kalk zufällig ausgewählt aus drei scheinbar normal aussehende Mäuse gemacht. Sowohl RAN mit und ohne Kalk zeigte seine Fähigkeit, Krebs im Magen zu induzieren. Zwei von drei Mäusen mit nur RAN behandelt wurden, zeigten präkanzeröse Stufe (Dysplasien), wohingegen alle drei Mäuse, behandelt mit RAN + Kalk zeigte Karzinom (2B). Abbildung 2 Dissected Maus und Histopathologie von normalen und Tumorgewebe von Magen nach der Behandlung mit RAN mit und ohne Kalk. A. Dissected Maus mit (a) normalen Magen und (b) tumorösen Magen mit einem Pfeil gekennzeichnet. Histopathologie der normalen (c) und Tumor Magen (d, e und f), die mit Kalk von RAN-Extrakt induziert. Die Pfeile zeigen vereitert Neoplasie in (d) und Tumorriesenzellen in (e und f). Die Vergrößerung wird angezeigt, entweder 10X oder 40X. B. Histopathologie von normalen und Tumor Magen von Mäusen nach RAN und RAN + Kalkung 300 Tage. In allen Panels, "Normal" Mäuse ohne Tumor anzeigt, "Dysplasie" zeigt an Mäuse mit präkanzerösen Magengewebe. "Karzinom" zeigt an Mäuse mit Tumor Magen. Dysplasia zeigt anisokaryosis (Variation in der Größe der Kerne) und Anisozytose (Variation in der Größe der Zellen). Die Vergrößerung angezeigt wird entweder 10X, 40X und 100X. Auf Metaphase Studium
verbreitet
Um festzustellen, ob kontinuierliche administeration von RAN-Extrakt (15 bis 180 Tage) mit oder ohne Kalk keine Auswirkungen auf den Chromosomen hat, untersuchten wir Metaphasespreitungen nach 2 h Behandlung mit Colchicin, in Knochenmarkproben. Die Daten zeigten eine allmähliche Zunahme der Mitosefiguren mit vorzeitig getrennt Schwesterchromatiden (3A und C), die beide in RAN und RAN + Kalk verabreicht Maus, verglichen mit keinem in unbehandelten Mäusen. Es ist auch aus der Studie deutlich, dass RAN + Kalk verabreicht Knochenmark der Maus deutlich höhere Häufigkeit solcher altklug anaphase zeigte als nur verabreicht RAN (3A). Nach 180 Tagen kontinuierlicher administeration von RAN + Kalk, 34,4% altklug anaphase verglichen mit 18,4% (p = 0,002) in RAN-verabreicht Maus BMC beobachtet. Abbildung 3 Karyotyp Analyse genomischer Instabilität in Knochenmarkzellen von Maus nach Exposition mit RAN-Extrakt mit (RAN + L) oder ohne Kalk (RAN). (A) Prozentsatz der Metaphasen mit vorzeitigem Schwester-Chromatid-Trennung. Zwei Mäuse pro Punkt für unbehandelte, 15 und 30 Tagen nach der behandelten Gruppe und drei Mäuse pro Punkt für den Rest. Mindestens 100 Metaphasen wurden jeder Maus erzielt. (B) Normal Metaphasespreitung von Maus-Knochenmarkszellen. (C) Vorzeitige Schwester-Chromatid-Trennung von der Maus zum RAN ausgesetzt. Klammern zeigen Schwester-Chromatiden in mitotischen Figuren, die den Phänotyp zeigen, getrennt liegt. (D und E) Metaphase Ausbreitung zeigten 37 und 38 Chromosomen sind. (F, G und H) Metaphasespreitung zeigte mehr als 60-Chromosomen. (I) zeigte mehr als 80 Chromosomen.
Wir zählten die Anzahl der Chromosomen in der Metaphase verbreitet die Bedeutung von altklug Anaphasen in Bezug auf Chromosomenstabilität zu verstehen. Die unbehandelten Mäuse haben eine stabile (2n = 40) Karyotyp (3B) und zeigten keine aneuploid Zellen. Wir haben beobachtet niedrigen Frequenz von aneuploid Zellen (3D-I; Tabelle 1) in RAN-Verabreichung mit und ohne Kalk, 120 Tage, und es wurde festgestellt, dass die Häufigkeit der aneuploid Zellen wurde allmählich erhöht. Die mittlere Frequenz (13,8%) der aneuploid Zellen wurde in sowohl der Magen tumortragenden Mäuse erzielt. Insgesamt war die Häufigkeit der aneuploid Zellen mehr folgenden RAN + Kalk administeration als allein RAN (Tabelle 1) .Tabelle 1 Chromosome Analyse von Mausknochenmarkzellen nach Exposition mit RAN-Extrakt mit oder ohne Kalk
Behandlungsmuster

Behandlungstage
Gesamtspreizung
Chromosome nicht erzielt
.
Aneuploidie
Vorzeitige Schwester

37
38
39
40
41
42
> 60

% (Mittelwert)
Chromatidentypaberration Trennung%
Unbehandelte
0
110
110
0
0
104
104
0
0
RAN
120
105 seite 1 von 1 | 103
1,9
17,5
120
2
1 2
115
4.1
18,7
105 seite 1 von 2
102
2,8 (2,9)
18,3 (18,2)
RAN + Kalk
100
2 2 seite 1 von 95
5,0
31,7
105
2
2 3
98
6.6
28,6
110
3
2 1 | 103 seite 1 von 6,4 (6,0)
28,3 (29,5)
p = 0.015a
RAN
180
101 seite 1 von 2 seite 1 von 97
3.9
18,0
124
2
2
1 119
4.0
17,7
114
3
2 1 | 108
5.3 (4.4)
19,4 (18.4)
RAN + Kalk
112
3
3
3
103
8.0
32,6
105
2 2
1 | 98 seite 1 von 1 | 6.6
34,9
110
4
2 101 2
1 | 8.2 (7.6)
35,6 (34,4)
p = 0.002a
RAN + Kalk
220
232
6 9
12
194
7
2 2
16,4
8.2
(mit fortgeschrittenen Tumor)
256
234
5
4 7
208
5
2 3
11,1 (13,8)
7.1 (7.6) in gepaarter t-Test statistisch signifikant
; two-tailed p-Wert wurde gezeigt.
Chromosomenaberrationen wurden bewertet in erster Linie als Chromatidbrüchen. Sehr niedrige Frequenz von Isochromatiden Pausen wurde beobachtet und keine Wechselfehler gefunden. Die Häufigkeit der Chromatidbrüchen und anomale Metaphasen wurde mit oder ohne Kalk allmählich von 60 bis 180 Tagen nach der RAN-administeration erhöht. Die Häufigkeit der Abbildungsfehler war folgende RAN + Kalk administeration als allein RAN. Die Häufigkeit der Abbildungsfehler war sowohl in der fortgeschrittenen Magentumortragenden Mäusen. (Für Verirrung Details finden Sie unter Zusätzliche Datei 1: Hintergrundinformationen).
Verminderte Expression von mitotischen Spindel-Checkpoint und Gene in RAN-behandelten Mäusen In Anbetracht der oben genannten Studien
, untersuchten wir die Expression von AuroraA, AuroraB, MAD2
und Bub1
Gene in Knochenmark, Speiseröhre und Magen-Zellen dieser Mäuse, die mit unbehandelten oder verabreicht RAN Extrakt waren und ohne Kalk für 120, 180 und 260 Tage. Die konventionellen RT-PCR-Ergebnisse (Figur 4) zeigte, dass von Speiseröhre und Magen gesammelten Zellen zeigten meist unter Expression dieser Gene in Bezug auf unbehandelte und eine solche Unterexpression war konsistent und signifikant in RAN + Kalk behandelten Mäuse. Allerdings hat der Ausdruck aller dieser Gene in BMC nicht in nennenswertem Weise ändern, außer Überexpression von Mad2
und Bub1
im BMC der Maus nach 260 Tage von administeration gesammelt festgestellt wurde. Abbildung 4 Obere Panel- Expression von mitotischen Checkpoints Gene in der Maus Knochenmark (BM), Speiseröhre und Magen-Zellen nach der Exposition mit RAN-Extrakt mit oder ohne Kalk für 120, 180 und 260 Tage. Lower Panel- Quantitative densitometrische Analyse des Expressionsprofils von mitotischen Checkpoints Gene mRNA-Ebene in der Speiseröhre und Magen-Zellen nach der 260 Tage der Exposition gezeigt wurde. Die Werte sind der Mittelwert ± SEM von drei unabhängigen Experimenten. Die Werte werden mit den jeweiligen Werten GAPDH normalisiert. * P < 0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001. Signifikanter Unterschied im Vergleich zu negativen /positiven Kontrolle (wie durch gepaarte t-Test bestimmt).
Analyse von Überexpression von Genen durch Immunoblotting
Levels von p53, p65, Bax
und Securin
in BMC von Mäusen nach administeration von RAN mit oder ohne Kalk für 60, 90 und 180 Tage extrahieren und diese Speiseröhre und des Magens nach 180 Tagen der Fütterung wurden durch Immunoblotting untersucht. Spiegel dieser Proteine ​​wurden auch aus den Zellen gesammelt Gewebe weise aus den unbehandelten Mäusen getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass die Expression von p53, p65, Bax und
Securin
signifikant in allen Geweben in RAN verabreicht Mäusen erhöht sind. Eine solche Verbesserung war in RAN + Kalk deutlich höher als nur in Mäusen verabreicht RAN (Abbildung 5). Figur 5 Ober Panel- Repräsentative Western-Blot Nachweis von p65, p53, Securin, bax und β-Aktin in Maus-Knochenmark (BM), Speiseröhre und Magen-Zellen nach Exposition mit RAN-Extrakt mit oder ohne Kalk. Für BM wurden die Zellen nach 60, 120 und 180 Tagen gesammelt, wohingegen für die Speiseröhre und des Magens wurden die Zellen erst nach 180 Tagen nach der Exposition gesammelt. ß-Aktin wurde als Ladekontrolle verwendet. Lower Panel- Quantitative densitometrische Analyse der Ebene der Proteine ​​der oben genannten Gene in Knochenmark, Speiseröhre und Magen-Zellen nach 180 Tagen nach der Exposition wurde gezeigt. Die Werte sind der Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Experimenten. Die Werte werden an entsprechende β-Actin-Werte normalisiert. * P < 0,05; ** P < 0,01 Signifikant verschieden gegenüber negativen /positiven Kontrolle (wie durch gepaarte t-Test bestimmt wird).
Cytometric Untersuchungen an Zellzyklus Strömungs- und Detektion von apoptotischen Zellen durch Doppelfärbung und Immun-Blotting
durchflusszytometrische Analyse der DNA-Gehalt in bone marrow , Speiseröhre und Magen-Zellen der Maus nach 260 Tage von RAN + Kalk Verwaltung (6A) gesammelt, zeigte, dass es eine Zunahme der G1-Phase-Zellen sowohl im Knochenmark und Speiseröhre in Bezug auf unbehandelten Kontrolle. Jedoch im Magen, wurde der Anteil der Zellen in sub-G1-Phase erhöht, was aufgrund der apoptotischen Zelltod zurückzuführen sein könnten. Um dies zu bestätigen, wurde Doppelfärbung mit AnnexinV und PI durchgeführt. Daten in 5B weisen auf erhöhte positive Färbung mit Annexin-V in Quadranten 2 und 3 in Magenzellen, aber nicht in der Speiseröhre Zellen RAN + Kalk behandelten Mäuse. Figur 6: Analyse des Zellzyklus und Apoptose in Mäusen mit RAN mit Kalk (A) Analyse der Zellzyklus 260 Tage nach der Exposition mit RAN behandelte Extrakt mit Kalk in Knochenmark, Speiseröhre und Magen-Zellen von Maus und auch von Magen-Tumorzellen. (B) Repräsentative Zytogrammen von Annexin V gegen PI-Fluoreszenzintensitäten, wie durch Durchflusszytometrie-Analyse in Maus Speiseröhre und Magen-Zellen nach der 260 Tage der Exposition mit RAN mit Kalk bestimmt und von Magentumorzellen. Innerhalb eines Cytogramm, Quadrant 1 und 2 stellen frühen und späten apoptotischen Zellen sind; Quadrant 3, lebende Zellen; Quadrant 4, tote Zellen. (C) Western-Blotting für apoptotische Marker in normalen (unbehandelt) und Tumorzellen Magen. β-Actin als Ladekontrolle verwendet wurde.
Interessanterweise zytometrische Analyse von Tumorzellen aus den Mäusen gesammelt fließen, die nach 220 und 256 Tagen kontinuierlicher administeration von RAN und Kalk Tumor im Magen entwickelt, ergab signifikante Reduktion in G1-Zellen mit einem gleichzeitige Anstieg der sub-G1-Zellen (6A). Dual-Färbung zeigt an, dass sub-G1-Zellen sind meist nekrotischen toten Zellen (Quadrant 4) (6B). Deutlich höhere p53
und Bax
Proteine ​​wurden in Tumor als normale Magen-Zellen (6C) beobachtet. Allerdings PARP
wurde in Abwesenheit, um sowohl die Tumorzellen des Magens, obwohl PARP
und seine 29 kD gespalten Produkt vorhanden waren in der normalen Magen-Proben (6C).
Diskussion
die Gegenwart gefunden Studie war zu sehen, durchgeführt, wenn ad libitum
administeration von RAN-Extrakt mit oder ohne Kalk im Trinkwasser kann Speiseröhre oder Magenkrebs in der Maus induzieren und wenn ja, welche Anfangs Prozesse beteiligt sind. In dieser Studie wurden die Mäuse die ganze RAN-Extrakt mit und ohne Kalk, um den menschlichen Verzehr Stil von RAN zu imitieren gegeben. Darüber hinaus wurde die Dosis auch periodisch erhöht, wie es für die menschliche passiert. Unsere Ergebnisse zeigten, dass sowohl die RAN mit und ohne Kalk Magenkrebs auslösen, obwohl, wird darauf hingewiesen, dass Gegenwart von Kalk mit RAN höheren Zelltransformation gefördert und damit Magenkrebs entwickelt früher als RAN allein. Es scheint, dass der Krebs aufgrund der höheren Belichtung in Magen induziert sein Futter zu RAN hatte, während die Speiseröhre Futter während des Trinkens der RAN Mischwasser nur kurzzeitig ausgesetzt.
Es wurde früher gezeigt worden, daß ein alkalischer pH-Wert zur Erzeugung ideal ROS durch Autoxidation von Areca-Nuss Polyphenole [6, 7]. Es wurde auch gezeigt, dass die Fraktion von Catechin areca-nut Extrakt aktiv ROS bei alkalischem pH erzeugt, die in vitro
DNA-Schädigung induziert [21, 22]. Alle Autoren gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.

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