Indukcija kromosomsko nestabilnost in raka na želodcu, ki ga spreminja izraz vzorec mitotićnih kontrolnih točkah genov pri miših izpostavljenih AREKA-nut

indukcije kromosomsko nestabilnost in raka na želodcu, ki ga spreminja izraz vzorec mitotićnih kontrolnih točkah genov pri miših izpostavljenih AREKA-matico
Povzetek
Ozadje
Obstajajo močni znaki za vzročno povezavo med porabo areca-matica in raka. V Meghalaja, Indiji, je raznolikost AREKA matico uporabimo kot surovi in ​​nepredelani obliki, katerih kemična sestava in farmakološke ukrepi so poročali. Vendar vemo, malo na začetni poti, vključenih v areca-nut povezano kancerogenosti, saj je težko oceniti njegove vplive na genskih sprememb brez vmešavanja drugih mešanju dejavnikov. Zato je bila ta študija izvaja pri miših, da se preveri možnost surovega areca-matico (RAN), da povzroči raka in spremljanje izražanje nekaterih genov, ki sodelujejo v rakotvornost. Ta študija ni bil namenjen za izolacijo vse aktivne sestavine iz RAN in iskati svoje delovanje.
Metode
so bili sprejeti in se uporabljajo v različnih časovnih točkah za različne eksperimentalne analize Tri skupine miši (n = 25 v vsaki) . Druge tri skupine miši (n = 15 v vsaki) je štela za indukcijo tumor študij. V vsakem nizu, sta bili dve skupini dajali RAN-ekstrakt ad libitum
s pitno vodo, z ali brez apna. Ekspresijo določenih genov je bila ocenjena s konvencionalnim RT-PCR in imuno. Miši so imele celo RAN-ekstrakt z in brez apna, da se posnemajo slog prehrano ljudi RAN.
Rezultati
histološko pripravo želodčne tkiva razkrila, ki je potekal inducirane raka na želodcu. opazili postopno povečanje pogostosti zgodnejših Anaphase in aneuploidno celic v celicah kostnega mozga z večjim prirastkom naslednjih RAN + apna administeration. Ravni p53, Bax, Securin
in p65
in požiralnika in želodca celic so bili povišani v prvih dneh izpostavljanja RAN, medtem ko so bili tisti različnih mitotska kontrolnih točkah proteinov navzdol reguliranih. Apoptotsko celična smrt je bila odkrita v ne-rakave želodčnih celic, ne pa tudi v tumorskih celicah, ki so pokazale čezmerno Bax
in odsotnosti PARP
.
Zaključek
Sedanja študija je nakazala (a) RAN povzroča raka na želodcu, vendar pa prisotnost apna spodbujati večjo transformacijo celic in s tem razvil rak prej, (b) perturbacije v sestavnih delov strojev segregacije kromosoma lahko sodeluje pri začetnem procesu rakotvornosti in (c) pomen prezgodnjo Anaphase kot presejalnega marker za identifikacijo mitotićnih pomanjkljivosti kontrolnih točk med prvih dneh.
Ključne besede
kromosomov nestabilnost mitotičnem checkpoint geni Securin
Apoptoza Ozadje
požiralnika skvamozni celični karcinom (ESCC) in želodca raka so najpogostejši rak v Indiji, z najvišjo pojavnost ESCC da so v severovzhodnih držav Indije [1]. Obstajajo močni znaki za vzročno zvezo med AREKA matico ali quid žvečilnih navade in te oblike rakavih obolenj. Številne študije v različnih živalskih vrst so pokazale pozitiven indukcijo tumorjev tako v cilju (lica-vrečka, požiralnika in želodca) in neciljne (pljuč in jeter) tkiva, ko se je arecoline (ARC) ali areca matica izvleček upravlja z različnimi sredstvi takšnih kot oralna intubacija [2], v mešanici z dieto [3], in lice-vrečka uporabe [4]. Zato se zdi, da je potrebna aktivacija presnove alkaloidov pri končnem pretvorbo v končnih rakotvornih snovi, ki močno vplivajo fizioloških pogojev in prisotnosti določenih dejavnikov [5]. Poročila so pokazala, nastajanje reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) od areca matica sestavin v alkalnih pogojih [6, 7]. Zaradi prisotnosti apna v betel-quid pripravo, slina areca matica grizejo stvari po hiši "navadno spremeni iz nevtralna do alkalna stanje, ki bi bilo idealno za ustvarjanje ROS [7]. Nair sod. [6] so prav tako ugotovil, da poleg ARC, lahko auto-oksidacijo areca matica polifenolov ustvarjajo H 2O 2 in superoksid radikali v alkalnem pH.
V državi Meghalaja, Indija, različnih areca matica, lokalno imenovana "kwai" se uporablja kot nezrela in nepredelani surovi obliki, ki ima višjo vsebnost alkaloidov, polifenolov in taninov v primerjavi s suho obliko [8]. Betel-quid uporablja v Meghalaja vsebuje surovo AREKA-matica (RAN), apno paste in majhen del betel-listov brez tobaka in drugih sestavin. Tu ljudje pogoltniti celo funtov po žvečenju namesto da bi jo izpljunil, ki je lahko pomemben dejavnik za ESCC in želodčni rak. V zadnjem času, 40% vzorcev, rak požiralnika, zbrani bolnikih Meghalaja države, ki imajo le RAN-žvečilni navado pokazala izbris mikrosatelitna označevalcev D9S1748 in D9S1749, ki se nahajajo v bližini EXON 1β v CDKN2A /ARF
gena na 9p21. Promotor hypermethylation od CDKN2A
gena je bila bistveno višja pri vzorcih z navado samo tistih, ki imajo navado uporabe tako RAN in tobaka za RAN-žvečenje [9]. Do sedaj, ne vemo veliko o začetni pot vključuje v betel-nut povezano kancerogenosti na požiralniku in želodcu. Prav tako je težko oceniti učinke zgolj in predvsem areca-matic-povzroča genetske spremembe v človeku brez vmešavanja drugih mešanju dejavnikov, kot tobaka žvečenje ali kajenje, uživanje alkohola, različnih vrst, ki niso Vegeterianski živil itd Poleg tega prisotnost apno naredi alkalno stanje, ki ni primerna za in vitro
celični kulturi in zato učinek areca-matice ne more biti testirane v sistemu celične kulture. Glede na to, je ta študija izvedena na miših za preverjanje sposobnosti RAN ekstrakta z ali brez apnom, da povzročijo raka in hkrati oceniti ekspresijski vzorec določenih genov, ki igrajo pomembno vlogo v začetnem procesu karcinogeneze.
kemična sestava in farmakološke dejanja aREKA-matice so poročali in pregledali več delavcev [10, 11]. Številne študije na živalih so potrdili, da imajo areca-matica izdelki in betel posebne nitrozaminov, sposobnost, da izzove neoplastične spremembe pri poskusnih živalih [11]. Dokazi kažejo, da so AREKA-matica-alkaloidi, predvsem arecoline (ARC), glavni dejavniki v BN-toksičnosti [11]. Izkazalo se je, da je ARC lahko povzroči poškodbe v molekuli DNK v celicah miši kostnega mozga [12] in je to DNK odškodnine se lahko zmanjša, če je ARC dajemo z N-acetil-L-cistein [13]. Zato je treba omeniti, da ta študija ni bila namenjena izločanju vse aktivne sestavine iz RAN in iskati svoje delovanje. Namen raziskave je bil ugotoviti začetno pot, vključenih v RAN povezana kancerogenosti pri miših in zato miši so imele celo RAN-ekstrakt brez in z apnom, da se posnemajo navado porabe človeških.
Na več genov, kot p53 , p65, Securin
in mnogi drugi, je znano, da se običajno prekomerno med rakotvornost [14-16]. Poleg tega je genska nestabilnost povezana tudi s kromosomsko nestabilnost (CIN), ki vodi do aneuploidija, ki je zaščitni znak raka. Kot anevploidijo lahko olajšajo tumorigeneze z izgubo tumorski supresor genov funkcijo. Ugotovljeno je bilo, da je delna izguba genske kontrole kontrolnih točk vodi do CIN v človeških rakavih celic [17, 18]. Zato je v tej raziskavi smo ocenili izraz vzorec p53, p65, Securin
in več mitotićnih in montaže vretena kontrolnih točkah genov v različnih časovnih točkah. Opazili smo, da lahko RAN povzročijo raka na želodcu, ki ga moti komponente strojev segregacije kromosoma.
metod
Priprava ekstraktov
Po odstranjevanju vlaknate plašče iz neobdelanega surovega in nezrela AREKA-matico (RAN), 100 g z RAN smo zmleli in suspendiramo v 125 ml destilirane vode in temeljito zmešamo, da dobimo gladko pasto za pripravo vodnega ekstrakta RAN. Po 24 urah smo pasta mešali 3 h pri 37 ° C in vodno ekstrakt smo zbrali s centrifugiranjem. Ta postopek ekstrakcije smo ponovili še enkrat z dodajanjem 125 ml vode k ostanku. Oba ekstrakte združimo, kar predstavlja 100 g RAN v 250 ml destilirane vode, filtriramo in zamrznemo pri - 80 ° C. Filtrat liofiliziramo v Secfroid Lyolab bii liofilizatorju (Danska). Liofiliziran maso smo vzdrževali pri 4 ° C do uporabe. Ekstrakt vsebuje 0,9 g /100 g vode, ki se ekstrahira material.
Živali vzdrževanje in obdelave
švicarski albino miši (25-30 gm), stare 2-3 mesece so se ohranili v laboratoriju v kletkah skupnosti v sobi z nadzorovano temperaturo (20 ± 2 ° C) in nadzorovano razsvetljavo (12 h lahka; 12 ur temno). Standardna prehrana miške (NMC Oil Mills Ltd, Pune, Indija) in vodo ad libitum
so bili uporabljeni v vseh poskusih. Eksperimenti so bili izvedeni v skladu s smernicami ustanove in naša odobril "Institucionalni standardi za oskrbo živali in uporabite" Board.
In Set-1, treh skupinah miši (n = 25 v vsaki) so bili sprejeti, ki so bili uporabljeni na različnih časovne točke za različne eksperimentalne analize. V set-2, tri skupine miši (n = 15 v vsaki) je štela za indukcijo tumor študij. Slika 1 prikazuje shematski pregled o celotni eksperimentalni protokol, ki je veljalo v tej študiji. V vsakem nizu je ena skupina obdelamo z enostavnim pitno vodo šteje za neobdelano ker smo dali dvema skupinama RAN ekstrakt ad libitum
v pitni vodi, z ali brez apna (pH 9,8). Ocenjeno je bilo, da vsaka miš porabljene 1 mg ekstrakta dnevno. Tako ustno administeration smo nadaljevali 60 dni po katerem je odmerek povečal od 1 mg do 2 mg na dan do 120 dni. Prav tako vsakih 60 dni kasneje odmerek je povečala za 1 mg na porabo dan. Slika 1 Shema eksperimentalnega oblikovanja za analizo surovega AREKA-matico posredovane Kancerogeneze pri miših. Tekel- surovo areca-matica; D- dni.
Priprava metafaz in točkovanje kromosomskih aberacij
Za pripravo metafazi, so celice kostnega mozga (BMC), zbranih iz dveh miši na točke od neobdelanih, 15 in 30 dneh od zdravljeni skupini in tri miši na točki za počitek. V obdelanih skupinah so BMC po 15, 30, 60, 120 in 180 dni zdravljenja zbrali. BMC zberemo tudi iz dveh miši, ki imajo želodčne tumor. BMC smo po 2 urah kolhicina zdravljenju (15 mg /kg) zberemo. Živali so ubili cervikalno dislokacijo. Stegnenic so izrežemo in BMC so izprati z vbrizganjem 2 ml 0,075 M KCl segreta na 37 ° C. Celice smo obdelali v hipotonični raztopini 15 minut in fiksna v ocetni kislini in metanola (1: 3). Ploščice smo pripravili po metodi sušenja plamen, obarvane v 5% Giemsa 5 minut in montiran na sintetičnem mediju. Slike metafaznih namazi so bili sprejeti v okviru Zeiss Axioskop mikroskopom (Nemčija).
Za študijo kromosomov, so diapozitivi kodiran naključno in vsaj 100 dobro širijo metafazne plošče so bile za študij iz vsake miši izbrali. Izvedli smo kromosomske šteje v metafazi širjenje. Kromosomske aberacije so ocenili kot odmori isochromatid in odmori kromatidni. Glej Razširjeni poskuse za podrobnosti v dodatnega datotek 1:. Dodatne informacije
imuno
celice iz kostnega mozga, požiralnik (s praskanjem notranjo plast) in želodec (zaradi praskanja notranji del) je bila dvakrat sprali s PBS (fosfat pufrom) in liziramo pri radioimmuno-padavin pufru (0,1% SDS, 2 mM EDTA, 1% NP-40, 1% natrijev deoksiholat, 50 mM natrijevega fluorida in 100 ie /ml aprotinina). Po 30 minutah inkubacije na ledu, so celični lizati centrifugirali 15 minut pri 4 ° C in je količina proteina smo določili s pomočjo kisline protein testa bicinchoninic. Enaka količina beljakovin (40 ug), iz vsakega vzorca je bil naložen v vsako jamico; enako nakladanje je dodatno preveril imunoblotanju z aktinskih protiteles. Vzorce smo naložili na Novex Tris glicin 4-20% gradientnih gelih in elektroforezo smo izvedli NuPAGE elektroforeznem sistemu (Invitrogen, ZDA). Proteine ​​smo prenesli v poliviniliden difluorid (PVDF) membrane (Sigma) po standardnem protokolu. Membrane smo skeniran z 1: 1000 razredčitvijo mišjega monoklonskega protitelesa proti p53
(PAB 240; ab-26; Abcam, ZDA), Bax
(6A7, ab5714, Abcam, ZDA), Securin
(DCS-280; ab3305, Abcam, ZDA), β-aktin
(AC-15; ab6276, Abcam, ZDA) in zajec poliklonsko protitelo proti NF-κβ p65
(ab31481; bcam, ZDA). Blots speremo 3-krat 10 minut vsak v TBST pufru pH 7,6 (1 M Tris Cl, 5 M NaCl in 0,05% Tween 20) in inkubiramo z sekundarnih protiteles (alkalne-fosfataze konjugiran anti-miš IgG ali alkalno fosfatazo konjugiran antirabbit IgG 1: 2000; Abcam, ZDA) 1 uro pri sobni temperaturi. Po obsežni pranju, je madež potopljena v raztopino 4 ml substraktni BCIP /NBT (Bangalore genei, Indija). Zadostna obarvanje je bila dosežena v 15 min. Vsak imunoblot je bila izvedena v treh miši na točke.
Spariti
trebuhu tkiva so bili zbrani od netretirano kontrolo in iz dveh miši Ran + lip zdravljenih s tumorjem. V drugem nizu je bil želodec tkivo tako zbrani iz neobdelane kot tudi iz skupin, ki so se zdravili 300 dni s RAN ekstrakta brez in z apnom. Tri miši smo naključno izbrali iz vsake skupine. Te miši ni bilo nobenih znakov tumorja navzven. Tkivo oddelki (5-7 um) so bili obdelani za histološko odseke kot po standardnem protokolu [19] in obarvali s hematoksilinom in eozinom [20]. Oddelki so nato opazili pod svetlobnim mikroskopom in fotografirali (Carl Zeiss, Nemčija).
Ekstrakcijo RNA in konvencionalne RT-PCR analiziranje
Celice so bili zbrani s praskanjem notranjo plast požiralnika in želodca z nezdravljeno kontrolo, RAN in RAN + apno zdraviti miške (tri miši na točko). Celice kostnega mozga so bili zbrani od stegnenice kosti miško. Total RNA smo izolirali s TRIzola in nato očistimo z RNeasy Mini Kit (Qiagen) po protokolu proizvajalca. Reverzno transkripcijo smo izvedli z 1 ug celotne RNA iz vsakega vzorca z Quantiscript reverzne transkriptaze Quantiscript RT-buffer in RT Primer-mešanico QuantiTect Reverse Transcription kit (Qiagen GmbH, Hilden, Nemčija) po protokolu proizvajalca. Pomnoževanje cDNA je bila izvedena v 20 ul raztopina, ki vsebuje 2 ul cDNA, 10 pmol primarni pari za aurora A Aurora B, Mad2, Bub1 in GAPDH (za primerskega zaporedij, glej dodatno datoteko 1: Dodatne informacije) v tem zaporedju, in 10 xl RT qPCR Master mix (Qiagen GmbH, Hilden, Nemčija). PCR sestavljena iz začetnega denaturacija pri 94 ° C za 5 minut, čemur sledi 30 reakcijskih ciklov (30 sekund pri 94 ° C, 30 sekund pri 60 ° C in 30 sekund pri 72 ° C) in končno cikel pri 72 ° C 10 min. GAPDH smo uporabili kot notranje kontrole. Vsi PCR produkti so bili elektroforetsko ločili na etidijevim bromidom obarvanih agaroznem gelu in vizualizirali z UV-svetlobo.
Pretok citometrična analiza celic
Mouse celic kostnega mozga in celice s praskanjem notranjo plast požiralnika in želodca obeh zbrani neobdelane in obdelamo za 260 dni z RAN z apnom ali brez bile določene s 70% etanolom. Želodec Tumorske celice so tudi zbrali in določen. Osnovna Celice smo sprali v PBS in ponovno suspendirali v 500 ul raztopine propidijevim jodidom (50 ug /ml propidijevim jodidom, 0,2 mg /ml RNaze) 1 uro pri sobni temperaturi v temi. 10.000 celice so bile pridobljene za vsak vzorec in analizirati z FACS Calibur (Becton-Dickinson). Cellquest Pro programska oprema je bila uporabljena za količinsko predele celico cikla oceniti odstotek celic razporejenih v različnih fazah celičnega ciklusa.
Aneksina študij označevanja
je Apoptotsko celična smrt ovrednotene s pomočjo annexinV-fluoresceinsko izotiocianat metodo v želodcu tumorskih celicah in prav tako v notranji plasti celic želodca in požiralnika nepredelanega in RAN z in brez apnom obdelanih miši po 260 dneh neprekinjenega administeration. Celični smo resuspendirali v PBS. Celice smo obarvali z propidijevim jodidom in aneksin-V-FITC uporabo BD PharmingenTM aneksina: FITC Detection Kit apoptozo (BD-Pharmingen Biosciences, San Diego, CA), saj po navodilih proizvajalca. Na kratko, potem ko zbiranje in pranje dvakrat s PBS, smo celice resuspendirali v vezavnem pufru (500 ul). FITC-aneksin-V (5 ul) dodamo k celicam, čemur je sledilo dodajanje 5 ul PI v skladu s protokolom. Vzorce smo nato inkubirali 15 minut v temi pri sobni temperaturi in izpostavimo pretočna citometrija vrednotenja.
Statistična analiza
Vrednosti so izraženi kot povprečje ± SEM ali povprečje ± SEM za nadzor in eksperimentalnih vzorcev in statistične analize so bile izvedene z Studentov t test z GraphPad Prism programske opreme 5.1. Vrednosti so menili statistično pomembna, če je p vrednost 0,05 ali manj.
Rezultati
Splošne ugotovitve
Od petnajstih miši, dveh miši razvil rak na želodcu po 220 in 256 dneh hranjenja RAN citat z apnom (slika 2A a in b). Ne tumor je bil razvit v miško ali neobdelane ali dajemo samo RAN. Histološka odsek jasno razlikovati med normalnim (2A c sliki) in tumorskega želodec (Slika 2A d-f). Vendar pa je tudi histološka priprava želodčne tkiva iz treh na videz normalnih iščejo miši, naključno izbranih iz te skupine po 300 dneh hranjenja z RAN ekstrakta brez in z apnom. Oba RAN z in brez apna pokazala svojo sposobnost, da povzroči raka na želodcu. Dva od treh miši, ki so se zdravili samo z RAN pokazala pred rakavo fazi (displazija), medtem ko so vse tri miši obdelane z RAN + apnom pokazala karcinom (slika 2B). Slika 2 seciramo miške in histopatologija tako normalno in tumorsko tkivo želodca po zdravljenju z RAN z in brez apna. A. seciramo miška z (a) normalni želodca in (b) tumorskega želodca označena s puščico. Histopatologija normalne (c) in tumor želodca (d, e in f), ki jih RAN ekstrakta z apnom inducirane. Puščice kažejo gnojne neoplazme v (d), in tumor velikan celic (E in F). Povečava je navedena bodisi 10X ali 40X. B. Histopatologija normalnega in tumorskega želodcu miši naslednjega RAN in RAN + zdravljenju apna za 300 dni. V vseh plošč, "Normal" označuje miši z brez tumorja, "displazija" označuje miši z predrakavih želodčne tkiva. "Karcinom" označuje miši z tumorskega želodcu. Displazija kaže anisokaryosis (razlike v velikosti jeder) in anisocytosis (razlike v velikosti celic). Povečava je navedena bodisi 10X, 40x in 100x.
Študij na metafazo
širi Da bi ugotovili, ali ima stalno administeration izvlečka RAN (od 15 do 180 dni), z ali brez apna vpliva na kromosomih, smo proučevali metafazo namazi po 2 h zdravljenju z kolhicina, v vzorcih kostnega mozga. Podatki so pokazali postopno povečanje mitotićnih podatkih s predčasno ločenih sestrskih kromatid (Slika 3A in C) tako v RAN in RAN + apna dajati miši v primerjavi z nobenim pri nezdravljenih miših. Prav tako je iz študije, ki RAN + apno daje miš kostnega mozga je pokazala bistveno večjo pogostost tega prezgodnjo Anaphase kot le Ran upravlja (slika 3A) jasno. Po 180 dneh neprekinjenega administeration od RAN + apno, 34,4% prezgodnja Anaphase v primerjavi s 18,4% (p = 0,002) v-RAN dajemo miške BMC niso opazili. Slika 3 kariotip analiza genomske nestabilnosti v kostnega mozga celicah miši po izpostavljenosti ekstrakta RAN z (RAN + L) ali brez apna (RAN). (A) Odstotek metafaz s prezgodnjim sestra-kromatidami ločitve. Dve miši na točki za neobdelane, 15 in 30 dni zdravljeni skupini in tri miši na točki za počitek. Vsaj 100 metafazi bilo doseženih za vsako miš. (B) Normal metafaza namaz iz celic miši kostnega mozga. (C) Predčasno sestra-kromatidami ločitev od miši izpostavljena RAN. Nosilci kažejo sestra-kromatid, ki leži loči mitotićnih številke, ki kažejo fenotip. (D in E) metafazo širjenje pokazala 37 in 38 kromosomov, oziroma. (F, G in H) metafazo razmik pokazala več kot 60 kromosomov. (I), je pokazala več kot 80 kromosomov.
Smo prešteti število kromosomov v metafazo širi razumeti pomen zgodnejših anaphases v zvezi s stabilnostjo kromosomov. Pri nezdravljeni miši imajo hlev (2n = 40) kariotip (slika 3B) in ne kaže nobenih aneuploidno celic. Nismo opazovati nizka pogostost aneuploidno celic (slika 3D-I, tabela 1) v RAN dajanju, z in brez apna, 120 dni in je bilo ugotovljeno, da je bila pogostost aneuploidno celic postopoma povečuje. je dosegel povprečna frekvenca (13,8%) od Aneuploiden celic pri miših tako želodec tumorskih smer. Na splošno je bila pogostnost aneuploidno celic bolj po RAN + apnom administeration kot sama RAN (tabela 1) .table Analiza 1 kromosomov celic miši kostnega mozga po izpostavljenosti RAN citat z ali brez apna
Zdravljenje vzorec

zdravljenje dni
Skupaj širjenje dosegel
kromosomu št.
aneuploidije
Prezgodnja sestra


37
38
39
40
41
42
> 60

% (povprečje)
kromatid ločitev%
Nezdravljena
0
110
110
0
0
104
104
0
0
RAN
120
105
1
1
103
1.9
17,5
120
2
1
2
115
4.1
18,7
105
1
2
102
2,8 (2,9)
18,3 (18,2)
RAN + apno
100
2
2
1
95
5.0
31,7
105
2
2
3
98
6.6
28,6
110
3
2
1
103
1
6,4 (6,0)
28,3 (29,5)
p = 0.015a
RAN
180
101
1
2
1
97
3,9
18,0
124
2
2
1
119
4,0
17,7
114
3
2
1
108
5.3 (4.4)
19.4 (18.4)
RAN + apno
112
3
3
3
103
8,0
32,6
105
2
2
1
98
1
1
6,6
34,9
110
4
2
101
2
1
8.2 (7.6)
35,6 (34,4)
p = 0.002a
RAN + apno
220
232
6
9
12
194
7
2
2
16,4
8.2
(z napredno tumorja)
256
234
5
4
7
208
5
2
3
11,1 (13,8)
7,1 (7,6)
statistično značilno v seznanjenih t-test; dve zimske p vrednost je bila prikazana.
kromosomske aberacije so dosegel predvsem kot odmori kromatidni. opazili zelo nizka frekvenca isochromatid odmori in niso bile ugotovljene izmenjavo aberacije. Pogostost odmorov kromatidni in zmotna metafazi se je postopoma povečala od 60 do 180 dni RAN-administeration z ali brez apna. Pogostnost aberacij je bil bolj po RAN + apnom administeration kot sama RAN. Pogostnost aberacij je bolj tako naprednih tumorja na želodcu nosi miši. (Za podrobnosti aberacij, glej dodatno datoteko 1: Dodatne informacije).
Zmanjšal ekspresijo mitotićnih in vretena kontrolnih točkah genov pri miših, Ran obdelan
Glede na zgoraj omenjenih študij, smo pregledali izražanje AuroraA, AuroraB, MAD2
in Bub1
geni v kostnem mozgu, požiralnika in želodca celice tiste miši, ki so bile neobdelane ali upravljanju ekstrakt RAN z in brez apna za 120, 180 in 260 dni. Konvencionalne Rezultati RT-PCR (slika 4) je pokazala, da celice zbrani iz požiralnika in želodca pokazala večinoma pod ekspresijo teh genov v zvezi z neobdelanim eno in tako pod ekspresijo je ujemal in pomembno RAN + apna nadzorovane miši. Vendar pa izraz vseh teh genov v BMC ni spremenila v nobenem pomemben način, razen prekomerno izražanje Mad2
in Bub1
je zapisana v BMC miške, zbranih po 260 dneh administeration. Slika 4 Zgornja plošča- Izražanje mitotićnih kontrolnih točkah genov v miš kostnem mozgu (BM), požiralnika in želodca celice po izpostavljenosti s RAN citat z ali brez apna za 120, 180 in 260 dni. Spodnja plošča- Kvantitativna denzitometrično analizo profila izražanja genske checkpoint genov ravni mRNA v požiralniku in želodcu celic, potem ko je bil prikazan 260 dni izpostavljenosti. Vrednosti so srednja ± SEM treh neodvisnih eksperimentov. Vrednosti so normalizirana z ustreznimi vrednostmi GAPDH. * P lt; 0,05; ** P lt; 0,01; *** P lt; 0,001. Bistveno drugačen v primerjavi z negativno /pozitivno kontrolo (kot je seznanjeno t-test določi).
Analiza prekomerno ekspresijo genov z imuno
nivoji p53, p65, Bax
in Securin
in BMC od miši po administeration od RAN izločijo z ali brez apna za 60, 90 in 180 dni, in tistimi, požiralnika in želodca, ko je bilo 180 dni hranjenja pregledal imuno. Ravni teh proteinov smo testirali tudi iz celic, zbranih tkiv pametno iz neobdelanih miši. Rezultati kažejo, da je izražanje p53, p65, Bax
in Securin
znatno povišane v vseh tkivih v Ran nadzorovanih miših. Takšna okrepitev je znatno RAN + apnom višje kot le pretekel nadzorovanih miših (slika 5). Slika 5 Zgornja plošča- predstavnik western blot odkrivanje p65, p53, securin, BAX in P-aktina v miš kostnega mozga (BM), požiralnika in želodca celice po izpostavljenosti s RAN citat z ali brez apna. Za BM, smo celice zbrali po 60, 120 in 180 dni, medtem ko je za požiralnika in želodca, smo celice zbrali šele po 180 dneh izpostavljenosti. beta-aktin uporabimo kot kontrolo obremenitve. Spodnja plošča- Kvantitativna denzitometrično analizo ravni proteinov omenjenih genov v kostnem mozgu, je pokazala, požiralnika in želodca celice po 180 dneh izpostavljenosti. Vrednosti so srednja vrednost ± SD treh neodvisnih poskusov. Vrednosti so normalizirana z ustreznimi beta-aktina vrednosti. * P lt; 0,05; ** P lt; 0,01 Znatna različnost v primerjavi z negativno /pozitivno kontrolo (kot je seznanjeno t-test določi).
Pretoka študij citometrijo na celični cikel in odkrivanje apoptotskih celic z dvojno barvanjem in imuno
pretoka citometrijo analize vsebine DNK v kostnem mozgu , požiralnika in želodca celice miši, zbranih po 260 dneh RAN + uprave apna (slika 6A), je pokazala, da se je povečalo v G1 fazi celice tako v kostnem mozgu in požiralnika v zvezi z neobdelano kontrolo. Vendar pa v želodcu, je povečal odstotek celic v sub-G1 fazi, ki bi jih lahko pripišemo zaradi apoptotske celične smrti. Da bi to potrdili, smo opravili dvojno obarvanje s annexinV in PI. Podatki na sliki 5B kažejo povečano pozitivno barvanje z aneksinom-V v kvadrantu 2 in 3 v želodcu celicah, vendar ne požiralnika celicah RAN + apna nadzorovane miši. Slika 6 Analiza celičnega cikla in apoptozo pri miših, zdravljenih z RAN z apnom (A) Analiza celičnega ciklusa po 260 dneh izpostavljenosti z RAN izvleček z apnom v kostnem mozgu, požiralniku in želodcu celic miši in tudi iz želodca tumorskih celic. (B) Reprezentativni cytograms z aneksinom V primerjavi PI fluorescence intenzivnosti kot z analizo pretočno citometrijo, določenih v mišjih požiralnika in želodca celic po 260 dneh izpostavljenosti z RAN z apnom in iz želodca tumorskih celic. V cytogram, kvadrant 1 in 2 predstavljata zgodnje in pozne apoptotične celice, v tem zaporedju; kvadrant 3, živih celic; kvadrant 4, mrtve celice. (C) Western blot za apoptotska označevalcev v normalnih (neobdelana) in tumorja na želodcu celic. β-aktina smo uporabili kot kontrolo obremenitve.
Zanimivo je, pretočna citometrična analiza tumorskih celic, zbranih od miši, ki se je razvil tumor v želodcu po 220 in 256 dni neprekinjenega administeration ran in apna, je pokazala znatno zmanjšanje G1 celic z sočasno rast v sub-G1 celic (slika 6A). Dual madeži kažejo, da so sub-G1 celice večinoma Nekrotično odmrle celice (kvadrant 4) (slika 6b). Bistveno višja stopnja p53
in Bax
proteinov v tumorju kot običajna želodčnih celic (slika 6c) niso opazili. Vendar pa je bilo ugotovljeno, PARP
odsotna tako tumorskih celic želodca, čeprav PARP
in njenih 29 kD cepimo bili produkt prisotni v normalnih vzorcih želodčne (slika 6C).
Razprava
predloženega študija je bila izvedena, ali ad libitum
administeration od RAN ekstrakta z ali brez apna v pitni vodi lahko povzroči požiralnika ali raka želodca v miško in če ne, kaj začetni procesi so vključeni. V tej študiji so miši glede na celotno RAN-ekstrakt brez in z apnom, da posnemajo slog prehrano ljudi RAN. Poleg tega je bil odmerek občasno poveča tudi to zgodi človeku. Naši rezultati so pokazali, da sta tekla brez in z apnom povzročijo raka na želodcu, čeprav je treba opozoriti, da je prisotnost apna z RAN spodbujati večjo transformacijo celic, s čimer se je pojavil rak na želodcu prej kot RAN sam. Zdi se, da je rak povzročena v želodcu zaradi večje izpostavljenosti njegova obloga morala RAN medtem ko je požiralnik obloga izpostavljena le za kratek čas med pitjem RAN zmešamo z vodo.
Dokazano je že, da je alkalno pH idealna za generiranje ROS s avtooksidacije za areca matica polifenolov [6, 7]. Pokazalo se je tudi, da je katehin delež ekstrakta areca-matica aktivno ustvarja ROS pri alkalnem pH, ki povzroča poškodbe DNA in vitro
[21, 22]. Vsi avtorji prebrali in potrdil končni rokopis.

• Izraz LINE-1 endonukleazo variante pri raku želodca: njena zveza s clinicopathological parametri
• Gastroprotektivnih mehanizem Paederia foetida Linn. (Rubiaceae) - priljubljena užitnih rastlin, ki jih plemenski skupnosti severovzhodne Indije uporablja