La inducción de la inestabilidad cromosómica y cáncer de estómago mediante la alteración del patrón de expresión de genes de punto de control de la mitosis en ratones expuestos a areca-tuerca

La inducción de la inestabilidad cromosómica y cáncer de estómago mediante la alteración del patrón de expresión de los genes de control mitótico en ratones expuestos a areca tuerca
Resumen Antecedentes

Hay fuertes indicios de una asociación causal entre el consumo de areca tuerca y cánceres. En Meghalaya, India, la variedad de areca tuerca se utiliza como forma de crudo y sin procesar, cuya composición y acciones farmacológicas química han sido reportados. Sin embargo, se sabe poco sobre la vía inicial involucrado en areca tuerca de la carcinogénesis asociada, ya que es difícil evaluar sus efectos sobre las alteraciones genéticas sin interferencia de otros factores de complicación. Por lo tanto, el presente estudio se realizó en ratones para verificar la capacidad de crudo areca-tuerca (RAN) para inducir el cáncer y para controlar la expresión de ciertos genes implicados en la carcinogénesis. Este estudio no se pretende aislar los ingredientes activos de la RAN y para buscar su acción.
Métodos
fueron tomados y utilizados en diferentes puntos de tiempo para diferentes análisis experimental Tres grupos de ratones (n = 25 en cada uno) . Se consideraron los otros tres grupos de ratones (n = 15 en cada uno) para los estudios de inducción de tumor. En cada serie, dos grupos se les administró extracto de RAN-ad libitum
en el agua potable con o sin cal. La expresión de ciertos genes se evaluó mediante RT-PCR e inmunotransferencia convencional. Los ratones recibieron la totalidad RAN-extracto con y sin cal con el fin de imitar el estilo de consumo humano de RAN.
Resultados
preparación histológica de tejido del estómago revelado que RAN indujo cáncer de estómago. Se observó un aumento gradual en la frecuencia de células anafase y aneuploides precoces en las células de médula ósea con un incremento mayor siguientes RAN + administeration cal. Los niveles de p53, Bax, Securin Opiniones y p65 en las células
esófago y estómago fueron elevados durante los primeros días de exposición RAN mientras que las de diferentes proteínas mitótico puesto de control se downregulated. La muerte celular apoptótica se detectó en las células del estómago no cancerosas pero no en células tumorales que mostraron sobreexpresión de Bax
y ausencia de PARP
.
Conclusión
El presente estudio sugiere (a) RAN induce cáncer de estómago, Sin embargo, la presencia de cal promovió mayor transformación celular y el cáncer con ello desarrollado anteriormente, (b) las perturbaciones en los componentes de la maquinaria de la segregación cromosómica podrían estar involucrados en el proceso inicial de carcinogenicidad y (c) la importancia de la anafase precoz como un marcador de selección para la identificación de los defectos de control mitótico durante los primeros días.
Palabras clave
inestabilidad cromosómica mitótico puesto de control de los genes Securin
Antecedentes la apoptosis
carcinoma de células escamosas de esófago (CECA) y los cánceres gástricos son los cánceres más comunes en la India, con el más alto incidencia de la CECA estar en estados del noreste de la India [1]. Hay fuertes indicios de una asociación causal entre areca tuerca o hábitos de masticación quid y estos tipos de cáncer. Varios estudios realizados en diferentes especies animales han demostrado la inducción positiva de tumores tanto en destino (mejilla-bolsa, esófago y estómago) y no diana (pulmón e hígado) tejidos cuando arecolina (ARC) o de areca tuerca extracto se administra por diferentes medios tales como intubación oral [2], se mezcla con la dieta [3], y la aplicación de mejilla bolsa [4]. Por lo tanto, parece que es necesaria la activación metabólica de alcaloides para la conversión final en los carcinógenos últimos, que está fuertemente influenciada por las condiciones fisiológicas y la presencia de ciertos factores [5]. Los informes han indicado generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) a partir de ingredientes areca-tuerca en condiciones alcalinas [6, 7]. Debido a la presencia de cal en la preparación de betel quid, saliva areca-tuerca acullicadores normalmente cambia de neutral a una condición alcalina, que podría ser ideal para la generación de ROS [7]. Nair et al. [6] También se ha señalado que, además de ARC, auto-oxidación de los polifenoles areca tuerca podría generar H 2O 2 y los radicales superóxido a pH alcalino. Hoteles en el estado de Meghalaya, India, la variedad de nuez de areca, localmente llamado 'Kwai', se utiliza como forma cruda inmadura y sin procesar que tiene un mayor contenido de alcaloides, taninos y polifenoles en comparación con la forma seca [8]. El betel quid utilizado en Meghalaya contiene prima areca tuerca (RAN), pasta de cal y una pequeña porción de hojas de betel sin tabaco y otros constituyentes. Aquí la gente traga todo el quid después de masticar en lugar de escupirla, que podría ser un factor importante para la CECA y cáncer de estómago. Recientemente, el 40% de las muestras de cáncer de esófago recogidas de pacientes de estado de Meghalaya que sólo tienen el hábito de mascar-RAN mostraron supresión de la D9S1748 y D9S1749 marcadores microsatélites, que se encuentra cerca al exón 1β de CDKN2A /ARF
gen en 9p21. El promotor de la hipermetilación de CDKN2A
gen fue significativamente mayor en las muestras con el hábito de RAN-mascar solo que los que tienen la costumbre de uso tanto RAN y el tabaco [9]. Hasta ahora, no se sabe mucho sobre la ruta inicial implica en la nuez de betel carcinogénesis asociada en el esófago y el estómago. También es difícil evaluar los efectos de las alteraciones genéticas y puramente predominantemente areca tuerca inducida en humanos sin interferencia de otros factores de complicación como el tabaco de mascar o fumar, consumo de alcohol, diversos tipos de alimentos no Menú vegetariano, etc. Por otra parte, la presencia de cal hace que una condición alcalina que no es ideal para vitro
cultivo de células en y por lo tanto el efecto de areca-tuerca no se pueden probar en sistemas de cultivo celular. En vista de estos, el presente estudio se llevó a cabo en ratones para verificar la capacidad de RAN-extracto con o sin cal, para inducir el cáncer y evaluar simultáneamente el patrón de expresión de ciertos genes que desempeñan un papel importante en el proceso inicial de la carcinogénesis.
La composición química y las acciones farmacológicas de areca tuerca se ha informado y revisado por varios trabajadores [10, 11]. Varios estudios en animales han confirmado que los productos de areca-tuerca y nitrosaminas específicas de betel, tienen la capacidad de inducir cambios neoplásicos en animales de experimentación [11]. Existen muchas evidencias de que areca-Nut-alcaloides, predominantemente arecolina (ARC) son los principales factores en BN-toxicidad [11]. Se demostró que ARC puede inducir daños de ADN en células de médula ósea de ratón [12] y tales daños de ADN se puede reducir cuando se administra ARC con N-acetil-L-cisteína [13]. Por lo tanto, vale la pena mencionar que el presente estudio no estaba destinado a aislar cualquiera de los ingredientes activos de la RAN y para buscar su acción. El objetivo del estudio fue identificar la vía inicial involucrado en RAN asociado carcinogénesis en ratones y, por tanto, los ratones se les dio el conjunto RAN-extracto con y sin cal con el fin de imitar el hábito de consumo de humano.
Varios genes, como p53 , p65, Securin
y muchos otros, se sabe que por lo general se sobreexpresa durante la carcinogénesis [14-16]. Además, la inestabilidad genética también se asocia con la inestabilidad cromosómica (CIN), que conduce a la aneuploidía, un sello del cáncer. Tal aneuploidía puede facilitar la tumorigénesis a través de la pérdida de la función del gen supresor de tumores. Se ha observado que la pérdida parcial de control de punto de control mitótico conduce a CIN en las células cancerosas humanas [17, 18]. Por lo tanto, en el presente estudio, se evaluó el patrón de expresión de p53, p65, Securin Opiniones y varios genes de control mitótico y de montaje del cabezal en diferentes puntos de tiempo. Hemos observado que la RAN puede inducir cáncer de estómago perturbando los componentes de la maquinaria segregación cromosómica.
Métodos
Preparación de extractos
Después de los bombardeos a las capas fibrosas de areca tuerca sin procesar cruda y sin madurar (RAN), 100 g de RAN se trituraron y se suspendieron en 125 ml de agua destilada y se mezcla a fondo para dar una pasta suave para la preparación de un extracto acuoso de la RAN. Después de 24 h, la pasta se agitó durante 3 h a 37 ° C y el extracto acuoso se recogió por centrifugación. Este procedimiento de extracción se repitió una vez más mediante la adición de 125 ml de agua al residuo. Ambos extractos se combinaron, lo que representa 100 g de RAN en 250 ml de agua destilada, se filtra y se congelaron a - 80 ° C. El filtrado se liofilizó en un liofilizador Secfroid Lyolab BII (Dinamarca). La masa liofilizada se mantuvo a 4 ° C hasta su uso. El extracto contenía 0,9 g 100 g /material extraíble con agua.
Animales mantenimiento y tratamiento
ratones albinos suizos (25-30 g), 2-3 meses de edad se mantuvieron en el laboratorio en jaulas de la comunidad en una habitación con temperatura controlada (20 ± 2 ° C) y la iluminación controlada (12 h de luz; 12 h de oscuridad). dieta estándar del ratón (NMC aceite Mills Ltd., Pune, India) y agua ad libitum
se utilizaron en todos los experimentos. Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales y aprobados por nuestros "estándares institucionales para el cuidado y uso de animales" Junta.
En Set-1, tres grupos de ratones (n = 25 en cada uno) fueron tomados los cuales fueron utilizados en diferentes los puntos de tiempo para diferentes análisis experimental. En Set-2, tres grupos de ratones (n = 15 en cada uno) fueron considerados para los estudios de inducción de tumor. La figura 1 ofrece una visión esquemática sobre el protocolo experimental general que se consideró en este estudio. En cada conjunto, un grupo se trató con agua potable sencilla considerado como no tratada, mientras que se administraron dos grupos RAN extraer ad libitum
en el agua potable con o sin cal (pH 9,8). Se ha estimado que cada ratón consumido 1 mg de extracto por día. Tal administeration oral se continuó durante 60 días después de lo cual se aumentó la dosis de 1 mg a 2 mg por día hasta 120 días. Del mismo modo, cada 60 días después de la dosis se incrementó en 1 mg por día de consumo. Figura 1 Diagrama de flujo del diseño experimental para el análisis de prima areca-tuerca mediada Carcinogenesis en ratones. Azar areca tuerca en bruto; día D-.
Preparación de metafases y la puntuación de aberraciones cromosómicas
Para la preparación de la metafase, se recogieron células de médula ósea (BMC) de dos ratones por punto de no tratados, 15 y 30 días de grupo tratado y tres ratones por punto para el resto. En los grupos tratados, BMC se recogieron después de 15, 30, 60, 120 y 180 días de tratamiento. BMC también se obtuvieron de los dos ratones que tienen tumor de estómago. BMC se recogieron después de 2 h de tratamiento con colchicina (15 mg /kg). Los animales se sacrificaron por dislocación cervical. Los fémures fueron disecados y la BMC se lavaron a cabo inyectando 2 ml 0,075 M KCl precalentado a 37 ° C. Las células fueron tratadas en solución hipotónica de 15 min y se fijaron en ácido acético y metanol (1: 3). Los portaobjetos se preparó por el método de secado por llama, manchado en 5% de Giemsa durante 5 min y se monta en un medio sintético. Se tomaron imágenes de metafase para untar bajo microscopio Zeiss Axioskop (Alemania).
Para el estudio cromosómico, los portaobjetos se codifican de forma aleatoria y se seleccionaron al menos 100 placas de metafase bien repartidos para el estudio de cada ratón. Se realizó el recuento de cromosomas en metafase propagación. Las aberraciones cromosómicas se anotó como roturas isochromatid y roturas de cromátidas. Ver Procedimientos Experimentales ampliadas para detalles en el archivo adicional 1:. Información adicional
Immunoblotting
Las células de la médula ósea, el esófago (por el rascado capa interna) y estómago (por el rascado parte interior) se lavaron dos veces con PBS (fosfato solución salina tamponada) y se lisaron en tampón de radioinmunoprecipitación (0,1% de SDS, EDTA 2 mM, NP-40, desoxicolato de sodio al 1%, fluoruro de sodio 50 mM 1% y 100 U /ml de aprotinina). Después de 30 min de incubación en hielo, los lisados ​​celulares se centrifugaron durante 15 min a 4 ° C y se determinó la cantidad de proteína utilizando el ensayo de proteína de ácido bicinconínico. La misma cantidad de proteína (40 mg) de cada muestra se cargó en cada pocillo; la igualdad de carga fue verificado por inmunotransferencia con anticuerpos de actina. Las muestras se cargaron en Novex Tris-glicina al 4-20% geles de gradiente y electroforesis se realizó en el sistema de electroforesis NuPAGE (Invitrogen, EE.UU.). Las proteínas se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Sigma) siguiendo el protocolo estándar. Las membranas se probaron con una dilución 1: 1000 de un anticuerpo monoclonal de ratón contra p53 gratis (Pab 240; ab-26; Abcam, EE.UU.), Bax gratis (6A7; ab5714; Abcam, EE.UU.), Securin
(DCS-280; ab3305; Abcam, EE.UU.), β-actina gratis (AC-15; ab6276; Abcam, EE.UU.) y el anticuerpo policlonal de conejo contra NF-P65 κβ gratis (ab31481; BCAM, EE.UU.). Las transferencias se lavaron 3 veces durante 10 min cada uno en TBST tampón de pH 7,6 (1 M Tris Cl, 5 M NaCl y 0,05% de Tween 20) y se incubaron con anticuerpo secundario (con fosfatasa alcalina conjugada anti-IgG de ratón o con fosfatasa alcalina conjugado anticonejo IgG 1: 2.000; Abcam, EE.UU.) durante 1 h a temperatura ambiente. Después de un extenso lavado, la transferencia se sumerge en solución de sustrato de 4 ml de BCIP /NBT (Bangalore Genei, India). se obtuvo tinción suficientes dentro de 15 min. Cada inmunotransferencia se realizó en tres ratones por punto.
Evaluación histopatológica
tejido del estómago se recogió de control sin tratar y de dos ratones RAN + cal tratados con tumor. En otra serie, también se recogió el tejido del estómago de no tratado, así como de los grupos que se trataron durante 300 días con RAN-extracto con y sin cal. Tres ratones fueron seleccionados al azar de cada grupo. Estos ratones no tenían ninguna manifestación de un tumor en el exterior. Las secciones de tejido (5-7 M) se procesaron para seccionamiento histológico según el protocolo estándar [19] y se tiñeron con hematoxilina y eosina [20]. Las secciones fueron observadas bajo un microscopio de luz y se fotografiaron (Carl Zeiss, Alemania). La extracción de RNA Opiniones y análisis de RT-PCR convencional
células se recogieron mediante rascado la capa interna del esófago y del estómago de control no tratado, corrió y corrió + ratón tratado de cal (tres ratones por punto). Se recogieron las células de la médula ósea del hueso fémur del ratón. El ARN total se aisló con Trizol y después se purificó usando el kit RNeasy Mini (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La transcripción inversa se realizó con 1 g de ARN total de cada muestra utilizando Quantiscript de la transcriptasa inversa, Quantiscript RT-buffer y RT Primer-mezcla de kit QuantiTect transcripción inversa (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La amplificación de cDNA se llevó a cabo en solución al 20 l que contiene 2 ADNc l, 10 pares de cebadores pmol de Aurora A, Aurora B, Mad2, Bub1 y GAPDH (para secuencias de los cebadores, véase la disposición 1: Información de consulta), respectivamente, y 10 l de RT qPCR Master mix (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). La PCR consistió en una desnaturalización inicial a 94 ° C durante 5 min, seguido de ciclos 30 de reacción (30 segundos a 94 ° C, 30 segundos a 60 ° C, y 30 segundos a 72 ° C) y un ciclo final a 72 ° C por 10 min. GAPDH se utilizó como control interno. Todos los productos de PCR se separaron por electroforesis en gel de agarosa de etidio bromuro manchados y se visualizaron con luz UV.
Análisis de citometría de flujo de células
células de médula ósea de ratón y las células recogidas por el rascado de la capa interna del esófago y el estómago de tanto sin tratar y tratadas durante 260 días con RAN con o sin cal se fijaron con etanol al 70%. También se recogieron y se fijaron las células tumorales estómago. Las células fijadas se lavaron en PBS y se resuspendieron en 500 l de solución de yoduro de propidio (/yoduro de propidio 50 mg ml, 0,2 mg /ml de RNasa) durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad. 10.000 células fueron adquiridas para cada muestra y se analizaron con un FACS Calibur (Becton-Dickinson). CELLQuest software Pro se utilizó para cuantificar los compartimentos del ciclo celular para estimar el porcentaje de células distribuidas en las diferentes fases del ciclo celular. Estudios de etiquetado
anexina V
se evaluó la muerte celular apoptótica usando el método de isotiocianato de AnnexinV-fluoresceína en las células del tumor de estómago y también en la capa interna de células del estómago y el esófago sin tratar y de la RAN con y sin cal ratón tratado después de 260 días de administeration continua. El sedimento de células se resuspendió en PBS. Las células se tiñeron con yoduro de propidio y Anexina-V-FITC usando BD PharmingenTM Anexina V: Kit FITC Apoptosis Detección (BD-Pharmingen Biosciences, San Diego, CA) según las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, después de recoger y lavar dos veces con PBS, las células se resuspendieron en el tampón de unión (500 l). Se añadió FITC-anexina-V (5 l) a las células seguido de la adición de 5 PI l de acuerdo con el protocolo. Las muestras se incubaron a continuación durante 15 min en la oscuridad a temperatura ambiente y se sometieron a citometría de flujo de evaluación. Análisis estadístico
Los valores se expresan como media ± SEM o media ± SEM para el control y las muestras experimentales y análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba t de Student con el software GraphPad Prism 5.1. Los valores fueron considerados estadísticamente significativos, si el valor de p fue de 0,05 o menos.
Resultados
observaciones generales
Fuera de quince ratones, dos ratones desarrollaron cáncer de estómago después 220 y 256 días de alimentación de la RAN extraer con cal (Figura 2A a y b). Ningún tumor se desarrolló en ratones sin tratar o se administra con solamente RAN. La sección histológica claramente diferenciada entre normal (Figura 2A c) y el estómago tumoral (Figura 2A d-f). Sin embargo, la preparación histológica de tejido del estómago también se hizo de tres ratones en busca de apariencia normal, seleccionados al azar de este grupo después de 300 días de alimentación con RAN-extracto con y sin cal. Ambos corrieron con y sin cal mostraron su capacidad para inducir el cáncer en el estómago. Dos de tres ratones tratados con solamente RAN mostraron etapa precancerosa (displasia), mientras que todos los tres ratones tratados con RAN + cal mostraron carcinoma (Figura 2B). Figura 2 disecado del ratón y la histopatología de tanto tejido normal y tumoral del estómago después del tratamiento con la RAN con y sin cal. A. disecado ratón con (a) estómago normal y (b) el estómago tumoral indica con una flecha. La histopatología de la normalidad (c) y el estómago tumor (d, e y f) la inducida por extracto de RAN con cal. Las flechas indican ulceradas neoplasia en las células (d) y el gigante del tumor en (E y F). La ampliación se indica ya sea 10X o 40X. B. Histopatología del estómago normal y tumoral de los ratones después corrió y corrió + tratamiento con cal durante 300 días. En todos los paneles, "Normal" indica los ratones sin tumor "Displasia" indica los ratones con tejido del estómago precancerosa. "Carcinoma" indica los ratones con el estómago tumoral. Displasia muestra anisocariosis (variación en el tamaño de los núcleos) y anisocitosis (variación en el tamaño de las células). La ampliación se indica ya sea 10X, 40X y 100X.
Estudió en metafase se extiende
Para determinar si administeration continua de extracto RAN (de 15 a 180 días), con o sin cal tiene ningún efecto en los cromosomas, se estudió metafase para untar , después de 2 h de tratamiento con colchicina, en muestras de médula ósea. Los datos revelaron un aumento gradual de figuras mitóticas con cromátidas hermanas separadas antes de tiempo (Figura 3 A y C), tanto en corría y corría + cal administrada ratón, en comparación con ninguno de los ratones no tratados. También es evidente a partir del estudio que RAN + cal administrada médula ósea de ratones mostraron significativamente mayor frecuencia de tales anafase precoz que sólo salía administrada (Figura 3A). Después de 180 días de administeration continua de RAN + cal, el 34,4% anafase precoz en comparación con el 18,4% (p = 0,002) en el ratón RAN-administrados BMC fueron vistos. Figura 3 Análisis del cariotipo de la inestabilidad genómica en células de médula ósea de ratón después de la exposición al extracto de RAN con (RAN + L) o sin cal (RAN). (A) El porcentaje de metafases con la separación prematura de cromátidas hermanas. Dos ratones por punto para tratar, 15 y 30 días de grupo tratado y tres ratones por punto para el resto. Al menos 100 metafases se puntuaron a cada ratón. (B) normal propagación de metafase de células de la médula ósea de ratón. (C) la separación prematura de cromátidas hermanas de ratón expuesto a la RAN. Entre paréntesis figura cromátidas hermanas separadas en la mentira figuras de mitosis que muestran el fenotipo. (D y E) metafase mostraron cromosomas 37 y 38, respectivamente. (F, G y H) metafase mostraron más de 60 cromosomas. (I) se observa más de 80 cromosomas.
Se contó el número de cromosomas en metafase se extiende a entender el significado de anafases precoces en relación con la estabilidad de los cromosomas. Los ratones no tratados tienen un establo (2n = 40) cariotipo (Figura 3B) y no mostraron ningún células aneuploides. Nosotros observamos de baja frecuencia de las células aneuploides (Figura 3D-I, Tabla 1) en RAN-administrado, con y sin cal, durante 120 días y se observó que la frecuencia de células aneuploides se aumentó gradualmente. La frecuencia media (13,8%) de células aneuploides se obtuvo en ratones tanto el tumor de estómago cojinete. En general, la frecuencia de células aneuploides era más siguiente RAN + cal administeration de RAN solo (Tabla 1) .Tabla análisis 1 cromosoma de las células de médula ósea de ratón después de la exposición a la RAN extraer con o sin cal
Tratamiento patrón

días de tratamiento
propagación total anotó
cromosoma no.
aneuploidía
hermana prematura

37
38
39
40
41
42
> 60

% (media) guía empresas Cromátida separación%
no tratada
0
110 110

0 0

104 104

0 0

RAN
120 105

1

• La expresión de una variante de la endonucleasa de LINE-1 en el cáncer gástrico: su asociación con la expresión parameters
• mecanismo gastroprotector de Paederia foetida Linn. (Rubiaceae) - una planta comestible popular usado por la comunidad tribal del mecanismo Noreste India