Indução de instabilidade cromossômica e câncer de estômago, alterando o padrão de expressão de genes checkpoint mitótico em camundongos expostos à indução areca-nut

de instabilidade cromossômica e câncer de estômago, alterando o padrão de genes checkpoint mitótico expressão em camundongos expostos a areca-porca da arte abstracta
Fundo
Há fortes indicações de uma associação causal entre o consumo de areca-porca e cânceres. Em Meghalaya, Índia, a variedade de areca-porca é usado como forma bruta e não transformados cuja composição e ações farmacológicas química têm sido relatados. No entanto, sabemos pouco sobre o percurso inicial envolvido em areca-nut carcinogênese associada uma vez que é difícil avaliar os seus efeitos sobre alterações genéticas sem a interferência de outros fatores de composição. Portanto, o presente estudo foi realizado em ratinhos para verificar a capacidade da matéria-areca-porca (RAN) para induzir o cancro e para monitorar a expressão de certos genes envolvidos na carcinogênese. Este estudo não foi concebido para isolar os ingredientes ativos da RAN e procurar a sua acção.
Métodos
Três grupos de ratos (n = 25 em cada) foram tomadas e utilizadas em diferentes pontos de tempo para análise experimental diferente . Os outros três grupos de ratinhos (n = 15 em cada uma) foram considerados para estudos de indução de tumor. Em cada conjunto, dois grupos foram administrados RAN-extract ad libitum
na água potável com ou sem calcário. A expressão de certos genes foi avaliada por RT-PCR e imunotransferência convencionais. Os ratos receberam a totalidade ran-extracto com e sem calcário, a fim de imitar o modelo de consumo humano RAN.

Resultados da preparação histológica de tecido de estômago revelou que corria induzida cancro do estômago. Um aumento gradual na freqüência de células anáfase e aneuploides precoces foi observado nas células da medula óssea com um incremento maior seguintes RAN + administeration cal. Níveis de p53, Bax, Securin Comprar e p65
em células do esôfago e do estômago foram elevados durante os primeiros dias de exposição RAN enquanto aqueles de diferentes proteínas mitótico checkpoint foram reprimidos. A morte celular apoptótica foi detectada em células do estômago não-cancerosas mas não em células tumorais que mostraram sobreexpressão de Bax
e ausência de PARP
.

Conclusão O presente estudo sugeriu (a) RAN induz o cancro do estômago, no entanto, a presença de cal promoveu maior transformação celular e cancro, assim desenvolvido anteriormente, (b) perturbações em componentes da maquinaria cromossoma segregação pode estar envolvido no processo inicial de carcinogenicidade e (c) a importância da anafase precoce como um marcador de rastreio para identificação de defeitos checkpoint mitótico durante os primeiros dias.
Chromosome instabilidade mitóticas genes checkpoint Securin
Fundo apoptose
carcinoma epidermóide de esôfago (CEE) e os cancros gástricos são cancros mais comuns na Índia | Palavras-chave, com o maior incidência de ESCC estar em estados do nordeste da Índia [1]. Há fortes indícios de uma associação causal entre areca-porca ou hábitos de mastigação quid e estes cancros. Vários estudos em diferentes espécies animais demonstraram indução positiva de tumores em ambos alvo (bochecha-bolsa, esôfago e estômago) e não-alvo tecidos (pulmão e fígado) quando arecolina (ARC) ou areca-porca extrato foi administrado por diferentes meios tais como intubação oral [2], misturou-se com a dieta [3], e aplicação bochecha-bolsa [4]. Portanto, parece que a activação metabólica dos alcalóides é necessária para a conversão final nos agentes cancerígenos final, que é fortemente influenciada pelas condições fisiológicas e presença de certos factores [5]. Os relatórios indicaram geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) a partir de ingredientes areca-porca em condições alcalinas [6, 7]. Devido à presença de cal na preparação de betel-libras, a saliva dos mastigadores Areca-porca normalmente muda de neutro a uma condição alcalina, que pode ser ideal para a geração de ROS [7]. Nair et al. [6] também observaram que além ARC, auto-oxidação de polifenóis areca-porca poderia gerar H 2O 2 e radicais superóxido em pH alcalino.
No Estado de Meghalaya, Índia, a variedade de porca areca, localmente chamado 'Kwai', é usada como forma bruta não madura e não processado que possui teores mais elevados de alcalóides, polifenóis e taninos, em comparação com a forma seca [8]. O betel-quid usado em Meghalaya contém areca-castanha bruta (RAN), pasta de cal e pequena porção de betel folhas sem tabaco e outros componentes. Aqui as pessoas engolir todo o quid depois de mastigar, em vez de cuspi-la o que poderia ser um fator importante para o câncer de ESCC e estômago. Recentemente, 40% das amostras de câncer de esôfago coletadas de pacientes de Estado Meghalaya tendo apenas hábito RAN-mastigação mostrou supressão do D9S1748 marcadores microssatélites e D9S1749, localizado próximo ao exão 1β do gene CDKN2A /ARF
em 9p21. A hipermetilação do promotor do gene CDKN2A
foi significativamente maior nas amostras com o hábito de RAN-mastigação sozinho do que aqueles que têm o hábito de uso tanto RAN e tabaco [9]. Até agora, nós não sabemos muito sobre o percurso inicial envolve em betel-nut carcinogênese associada no esôfago e estômago. Também é difícil avaliar os efeitos da pura e alterações genéticas predominantemente areca-induzida por porca no ser humano sem a interferência de outros fatores de composição como mascar tabaco ou fumo, consumo de álcool, vários tipos de alimentos não-vegeterian etc. Além disso, a presença de cal torna uma condição alcalina que não é ideal para a cultura in vitro de células
e, por conseguinte, o efeito de Areca-porca não pode ser testada em sistemas de cultura de células. Em vista destes, o presente estudo foi realizado em ratos para verificar a capacidade de ran-extracto com ou sem calcário, para induzir cancro e avaliar simultaneamente o padrão de determinados genes que desempenham um papel importante no processo inicial de carcinogénese expressão.
A composição química e as ações farmacológicas de areca-nut foram relatados e revisado por vários trabalhadores [10, 11]. Diversos estudos em animais confirmam que os produtos Areca-porca e nitrosaminas específicas betel, têm a capacidade de induzir alterações neoplásicas em animais experimentais [11]. Muitas evidências sugerem que areca-nut-alcalóides, predominantemente arecolina (ARC) são os principais fatores na BN-toxicidade [11]. Foi mostrado que a arco pode induzir danos no DNA em células de medula óssea de rato [12] e tais danos de ADN pode ser reduzida quando administrado com ARC é N-acetil-L-cisteína [13]. Portanto, vale a pena mencionar que o presente estudo não foi concebido para isolar os ingredientes ativos da RAN e procurar a sua acção. O objectivo do estudo foi identificar o percurso inicial envolvido na RAN associada a carcinogénese em ratos e, portanto, os ratinhos receberam a totalidade ran-extracto com e sem calcário, a fim de imitar o hábito de consumo humano.
Vários genes, como p53 , p65, Securin
e muitos outros, são conhecidos por serem geralmente sobre-expressos durante a carcinogênese [14-16]. Além disso, a instabilidade genética está também associada com instabilidade cromossoma (CIN), que leva a aneuploidia, uma característica do cancro. Tal aneuploidia pode facilitar a tumorigénese através da perda da função de gene supressor de tumor. Observou-se que a perda parcial de controlo do ponto de verificação mitótico leva a CIN em células de cancro humano [17, 18]. Portanto, no presente estudo, avaliou-se o padrão de expressão da p53, p65, Securin
e vários genes checkpoint mitótico e montagem do eixo em diferentes pontos de tempo. Observamos que RAN pode induzir câncer de estômago perturbando os componentes da maquinaria cromossomo segregação.
Métodos
Preparação de extractos
Depois de descascar as camadas fibrosas de não transformados areca-porca cru e imaturos (RAN), 100 g de RAN foram triturados e suspensos em 125 ml de água destilada e misturou-se homogeneamente para dar uma pasta lisa para a preparação de um extracto aquoso de RAN. Após 24 h, a pasta foi agitada durante 3 h a 37 ° C e o extracto aquoso foi recolhido por centrifugação. Este procedimento de extracção foi repetido mais uma vez através da adição de 125 ml de água ao resíduo. Ambos os extractos foram reunidos, representando 100 g de RAN em 250 ml de água destilada, filtrou-se e congelou-se a - 80 ° C. O filtrado foi liofilizado num Liofilizador Secfroid Lyolab BII (Dinamarca). A massa liofilizada foi mantida a 4 ° C até à sua utilização. O extracto continha 0,9 g de material extraível em água /100 g.
Animais manutenção e tratamento
camundongos albinos Swiss (25-30 g), 2-3 meses de idade foram mantidas em laboratório em gaiolas comunidade em uma sala com a temperatura controlada (20 ± 2 ° C) e de iluminação controlada (12 horas de luz; 12 horas de escuro). dieta padrão do rato (NMC Oil Mills Ltd., Pune, Índia) e água ad libitum
foram usados ​​em todos os experimentos. Os experimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais e aprovado pelos nossos "Normas Institucionais para Animal Care e Use" Board.
Em Set-1, três grupos de ratos (n = 25 em cada) foram tomadas as quais foram utilizadas em diferentes pontos de tempo para análise experimental diferente. Em Set-2, três grupos de ratinhos (n = 15 em cada uma) foram considerados para estudos de indução de tumor. A Figura 1 dá uma vista geral esquemática sobre o protocolo experimental geral que foi considerado neste estudo. Em cada conjunto, um grupo foi tratado com água potável simples considerado não tratada enquanto que dois grupos foram administrados ad libitum RAN extrair
na água de beber, com ou sem calcário (pH 9,8). Foi estimado que cada rato consumido 1 mg de extracto por dia. Tal administeration oral foi continuada durante 60 dias, após o que a dose foi aumentada de 1 mg a 2 mg por dia até 120 dias. Da mesma forma, a cada 60 dias mais tarde a dose foi aumentada até 1 mg por dia de consumo. Figura 1 Diagrama do desenho experimental para a análise de areca-castanha bruta mediada Carcinogênese em camundongos. RAN areca-nut-primas; dias d-.
Preparação de metáfases e pontuação de aberrações cromossómicas Compra de preparação metáfase, células da medula óssea (BMC) foram coletadas de dois ratos por ponto de não tratados, 15 e 30 dias de grupo tratado e três ratinhos por ponto para o resto. Nos grupos tratados, BMC foram coletadas após 15, 30, 60, 120 e 180 dias de tratamento. BMC também foram coletados a partir dos dois ratos com tumor no estômago. CMO foram recolhidas depois de 2 h de tratamento colchicina (15 mg /kg). Os animais foram mortos por deslocamento cervical. Os fêmures foram dissecados ea BMC foram expelidos através da injeção de 2 ml de 0,075 M KCl pré-aquecido a 37 ° C. As células foram tratadas em solução hipotónica durante 15 minutos e fixadas em ácido acético e metanol (1: 3). As lâminas foram preparadas pelo método de secagem por chama, coradas em 5% de Giemsa durante 5 min e montadas em meio sintético. Imagens dos spreads metáfase foram levados sob Zeiss Axioskop microscópio (Alemanha). Compra de estudo cromossômico, as lâminas foram codificadas de forma aleatória e, pelo menos, 100 placas metafásicas bem espalhados foram selecionados para o estudo de cada rato. Foi realizada a contagem de cromossomos em metáfase spread. aberrações cromossómicas foram marcados como quebras isochromatid e quebras cromatídicas. Ver Procedimentos Experimentais de Extensão para detalhes no arquivo 1 adicionais:. Informações Complementares
Immunoblotting
células de medula óssea, esôfago (riscando camada interna) e estômago (riscando parte interna) foram lavadas duas vezes com PBS (fosfato solução salina tamponada) e foram lisadas em tampão de radioimuno-precipitação (0,1% de SDS, EDTA 2 mM, 1% de NP-40, 1% desoxicolato de sódio, fluoreto de sódio 50 mM e 100 U /ml de aprotinina). Após 30 min de incubação em gelo, os lisados ​​celulares foram centrifugados durante 15 min a 4 ° C e a quantidade de proteína foi determinada utilizando o ensaio de proteína do ácido bicinconínico. Igual quantidade de proteína (40 ug) de cada amostra foi carregada em cada poço; o carregamento igual foi adicionalmente verificada por imunotransferência com anticorpos de actina. As amostras foram carregadas em Tris-glicina Novex de 4-20% de gel de gradiente e a electroforese foi realizada em sistema de electroforese NuPAGE (Invitrogen, EUA). As proteínas foram transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) (Sigma), seguindo o protocolo padrão. As membranas foram sondadas com uma diluição 1: 1000 de um anticorpo monoclonal de ratinho contra a p53
(PAB 240; AB-26; Abcam, EUA), Bax
(6A7; ab5714; Abcam, EUA), Securin
(DCS-280; ab3305; Abcam, EUA), β-actina
(AC-15; ab6276; Abcam, EUA) e anticorpo policlonal de coelho contra NF-P65 κβ
(ab31481; BCAM, EUA). As membranas foram lavadas 3 vezes durante 10 minutos cada em TBST pH anti-IgG de ratinho 7,6 (1 M de Tris Cl, NaCl 5 M e 0,05% de Tween 20) e incubou-se com anticorpo secundário (com fosfatase alcalina conjugado ou com fosfatase alcalina conjugada anti-coelho IgG 1: 2000; Abcam, EUA) durante 1 h à temperatura ambiente. Depois de lavagem exaustiva, a membrana foi imersa em solução de substrato de 4 ml de BCIP /NBT (Bangalore Genei, India). coloração suficiente foi obtido no prazo de 15 min. Cada immunoblotting foi realizado em três ratos por ponto.
Avaliação histopatológica
tecido do estômago foram coletados a partir de controlo não tratado e de dois ratinhos RAN + cal tratado com tumor. Num outro conjunto, tecido do estômago foi também colhido a partir de não tratada, bem como de entre os grupos tratados para que 300 dias com RAN-extracto com e sem calcário. Três ratos foram selecionados aleatoriamente a partir de cada grupo. Estes ratos não têm qualquer indicação de tumor externamente. As secções de tecido (5-7 um) foram processados ​​para seccionamento histológico de acordo com protocolo padrão [19] e coradas com hematoxilina e eosina [20]. As secções foram então observados em microscópio de luz e fotografado (Carl Zeiss, Alemanha). Extração de RNA
e análise de RT-PCR convencional
As células foram recolhidas por raspagem da camada interior do esófago e do estômago de controle sem tratamento, correu e correu + cal rato tratado (três ratos por ponto). células da medula óssea foram recolhidas a partir do osso do fémur do mouse. O ARN total foi isolado com Trizol e depois purificado usando o Kit RNeasy Mini (Qiagen) de acordo com o protocolo do fabricante. A transcrição reversa foi realizada com 1 ug de ARN total de cada amostra utilizando Quantiscript Transcriptase Reversa, Quantiscript RT-tampão e iniciador de RT-mistura de kit QuantiTect Transcrição Reversa (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante. A amplificação de cDNA foi realizada em 20 de solução l contendo 2 cDNA ul, 10 pares de primers pmol para aurora A, aurora B, Mad2, Bub1 e GAPDH (para sequências de iniciadores, consulte arquivo adicionais 1: Informações Complementares), respectivamente, e 10 ml de RT qPCR Mestre mix (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha). O PCR consistiu de uma desnaturação inicial a 94 ° C durante 5 min, seguido de ciclos de 30 de reacção (30 segundos a 94 ° C, 30 segundos a 60 ° C e 30 segundos a 72 ° C) e um ciclo final a 72 ° C durante 10 min. GAPDH foi utilizada como controlo interno. análise de citometria de fluxo de todos os produtos de PCR foram separados por electroforese em gel de agarose de etídio corado com brometo e visualizada com luz UV.
de células
mouse células da medula óssea e as células colhidas por raspagem da camada interior do esófago e do estômago de ambos não tratada e tratada durante 260 dias com correu com ou sem cal foram fixadas com etanol a 70%. células tumorais estômago também foram recolhidos e fixados. As células fixadas foram lavadas em PBS e ressuspensas em 500 ul de solução de iodeto de propídio (/ml de iodeto de propídio 50 ug, 0,2 mg /ml de ARNase) durante 1 h à temperatura ambiente no escuro. 10.000 células foram adquiridos para cada amostra e analisados ​​com um FACS Calibur (Becton-Dickinson). CELLQuest Pro software foi utilizado para quantificar os compartimentos do ciclo celular para estimar a percentagem de células distribuídas nas diferentes fases do ciclo celular. Estudos de rotulagem
anexina V
morte celular por apoptose foi avaliada usando o método de isotiocianato de fluoresceína-annexinV nas células tumorais estômago e também na camada interna das células do estômago e do esófago de não tratada e correu com e sem calcário rato tratado após 260 dias de administeration contínua. O sedimento celular foi ressuspenso em PBS. As células foram coradas com iodeto de propídio e anexina-V-FITC utilizando BD PharmingenTM Anexina V FITC Apoptosis Detection Kit (BD-Pharmingen Biosciences, San Diego, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, após a recolha e lavagem duas vezes com PBS, as células foram ressuspensas no tampão de ligação (500 ul). FITC-anexina-V (5 mL) foi adicionado às células, seguido por adição de 5 ul de PI de acordo com o protocolo. As amostras foram então incubadas durante 15 minutos no escuro à temperatura ambiente e submeteu-se a citometria de fluxo de avaliação.
Análise estatística
Os valores são expressos como média ± SEM ou média ± SEM para o controlo e amostras experimentais e análise estatística foi realizada pelo teste t de Student com o software GraphPad Prism 5.1. Foram considerados estatisticamente significantes os valores, se o valor p foi de 0,05 ou menos.
Resultados
Observações gerais
dos quinze ratos, dois ratos desenvolveram câncer de estômago após 220 e 256 dias de alimentação de RAN extrair com cal (2A uma figura e b). Nenhum tumor foi desenvolvido no rato quer não tratada ou administrada com apenas RAN. A secção histológica claramente diferenciados entre normal (Figura 2A c) e estômago tumoral (Figura 2A d-f). No entanto, a preparação histológica de tecido do estômago também foi feita a partir de três ratos à procura de aparência normal, selecionados aleatoriamente a partir deste grupo após 300 dias de alimentação com RAN-extracto com e sem calcário. Ambos correu com e sem calcário mostrou sua capacidade de provocar o cancro no estômago. Dois dos três ratos tratados com apenas RAN mostrou fase pré-cancerosas (displasias), enquanto todos os três ratos tratados com RAN + cal mostrou carcinoma (Figura 2B). Figura 2 Dissected mouse e histopatologia de ambos tecido normal e tumor de estômago após o tratamento com RAN com e sem calcário. rato A. dissecado com (a) estômago normal e (b) estômago tumoral indicado com uma seta. Histopatologia do normal (C) e do estômago do tumor (d, e, f) que induzida por extracto RAN com cal. As setas indicam ulcerada neoplasia em células (d) e gigantes do tumor em (E e F). A ampliação é indicado quer 10X ou 40X. B. A histopatologia de estômago normal e tumoral de ratos após correu e correu + tratamento de cal para 300 dias. Em todos os painéis, "Normal" indica ratinhos sem tumor, "Displasia" indica ratos com tecido do estômago pré-cancerosa. "Carcinoma" indica ratos com estômago tumoral. Displasia mostra anisocariose (variação no tamanho dos núcleos) e anisocitose (variação no tamanho das células). A ampliação é indicado quer 10X, 40X e 100X.
Estudou na metáfase espalha
Para determinar se administeration contínuo de extrato de RAN (de 15 a 180 dias), com ou sem calcário tem qualquer efeito sobre cromossomos, estudamos os spreads metáfase , depois de 2 h de tratamento com colchicina, em amostras de medula óssea. Os dados revelaram um aumento gradual figuras mitóticas com cromátides irmãs prematuramente separados (Figura 3A e C), tanto na correu e correu rato + cal administrada, em comparação com nenhum em camundongos não tratados. É também evidente a partir do estudo que RAN + cal administrada medula óssea do rato mostraram significativamente maior frequência de tais anaphase precoce do que apenas ran administrada (Figura 3A). Após 180 dias de administeration contínuo de RAN + cal, 34,4% anaphase precoce em comparação com 18,4% (p = 0,002) no rato administrada-RAN BMC foram vistos. Figura 3 A análise do cariótipo de instabilidade genômica em células da medula óssea de rato após a exposição ao extrato de RAN com (RAN + L) ou sem calcário (RAN). (A) Percentagem de metafases com separação prematura de cromátide irmã. Dois ratos por ponto para não tratada, 15 e 30 dias de grupo tratado e três ratinhos por ponto para o restante. Pelo menos 100 metafases foram marcados para cada rato. (B) metaphase propagação normal a partir de células de medula óssea do rato. (C) a separação de cromátide irmã prematura de rato exposto a RAN. Parêntesis mostram-irmãs chromatids deitado separadas em figuras de mitose que mostram o fenótipo. (D e E) Metaphase propagação mostrou 37 e 38 cromossomos, respectivamente. (F, G e H) Metaphase propagação mostrou que mais de 60 cromossomos. (I) mostrou que mais de 80 cromossomos.
Contamos o número de cromossomos em metáfase se espalha para entender o significado do anáfases precoces em relação à estabilidade cromossomo. Os ratos não tratados têm uma estável (2n = 40) cariótipo (Figura 3B) e não mostrou quaisquer células aneuplóides. Nós foi observada baixa proporção de células aneuplóides (Figura 3D-I; Tabela 1) em, com e sem calcário, por 120 dias e notou-se que a frequência de células aneuplóides foi aumentada gradualmente administrada-RAN. A frequência média (13,8%) de células aneuplóides foi marcado em camundongos tanto o tumor no estômago rolamento. No geral, a frequência de células aneuplóides era mais seguinte RAN + cal administeration que sozinho RAN (Tabela 1) .table análise 1 cromossomo das células da medula óssea de ratos após a exposição à RAN extrair com ou sem calcário
tratamento padrão

dias de tratamento
spread total marcou
Chromosome não.
Aneuploidia
irmã prematura

37
38
39
40
41
42
> 60

% (média)
Cromátide separação%
não tratada
0
110
110
0
0
104
104
0
0
RAN
120
105
1 | 1 | 103
1,9
17,5
120 Página 2
1 | 2
115
4.1
18,7
105
1 | 2
102
2,8 (2,9)
18,3 (18,2)
RAN + cal
100 Página 2 Página 2
1 | 95
5.0
31,7
105 Página 2 Página 2 Sims 3
98
6,6
28,6
110 Sims 3 Página 2
1 | 103
1 | 6,4 (6,0)
28,3 (29,5)
p = 0.015a
RAN
180
101
1 | 2
1 | 97
3,9
18,0
124 Página 2
2
1 | 119
4.0
17,7
114 Sims 3 Página 2
1 | 108
5.3 (4.4)
19,4 (18,4)
RAN + cal
112 Sims 3 Sims 3 Sims 3
103
8,0
32,6
105 Página 2 Página 2
1 | 98
1 | 1 | 6,6
34,9
110 4
2
101 Página 2
1 | 8,2 (7,6)
35,6 (34,4)
p = 0.002a
RAN + cal
220
232
6
9
12
194
7 Página 2 Página 2
16,4
8,2
(com tumor avançado)
256
234
5 4
7
208
5 Página 2 Sims 3
11,1 (13,8)
7,1 (7,6)
um estatisticamente significativa no teste t pareado; bicaudal valor p foi mostrado. aberrações cromossômicas
foram marcados principalmente como quebras cromatídicas. Observou-se muito baixa frequência das interrupções isochromatid e sem aberrações de câmbio foram encontrados. A frequência de quebras cromatídicas e metafases aberrantes foi aumentada gradualmente a partir de 60 a 180 dias de RAN-administeration com ou sem limão. A frequência das aberrações foi mais seguinte RAN + cal administeration que sozinho RAN. A frequência das aberrações foi mais tanto no tumor de estômago avançado rolamento camundongos. (Para mais detalhes aberração, consulte arquivo adicionais 1: Informações Suplementares).
Redução da expressão de genes de mitose e de ponto de verificação do fuso nos ratinhos tratados com RAN
Tendo em conta os estudos acima, examinamos a expressão de AuroraA, AuroraB, MAD2 Comprar e Bub1
genes na medula óssea, esôfago e estômago células desses ratos que foram extrato de RAN não tratada ou administrado com e sem calcário para 120, 180 e 260 dias. Os resultados de RT-PCR convencional (Figura 4) mostrou que as células recolhidas a partir do esófago e estômago mostrou principalmente sob-expressão destes genes com respeito a uma não tratada e tal sub-expressão era consistente e significativa na RAN + cal ratinhos administrados. No entanto, a expressão de todos estes genes no CMO não se alterou de forma significativa excepto a sobre-expressão de Mad2
e Bub1
foi observado no BMC de rato recolhidos, após 260 dias de administeration. Figura 4 superior Painel de expressão de genes checkpoint mitótico em medula óssea de ratinho (BM), as células esófago e do estômago após a exposição com RAN extrair com ou sem calcário para 120, 180 e 260 dias. Lower análise densitométrica quantitativa em painel do perfil dos genes checkpoint mitótico nível de mRNA em células de esôfago e estômago expressão depois de 260 dias de exposição foi mostrado. Os valores são a média ± SEM de três experiências independentes. Os valores são normalizados para os valores respectivos de GAPDH. * P < 0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001. Significativamente diferente em comparação com o controle negativo /positivo (conforme determinado pelo teste t pareado).
Análise da sobre-expressão de genes através immunoblotting
níveis de p53, p65, Bax Comprar e Securin
na BMC de ratos após administeration de RAN extrair com ou sem calcário por 60, 90 e 180 dias, e aqueles esófago e do estômago após 180 dias de alimentação foram examinados por immunoblotting. Os níveis destas proteínas foram também testadas a partir das células colhidas de tecido-sábio a partir de ratinhos não tratados. Os resultados indicam que a expressão da p53, p65, Bax Comprar e Securin Quais são significativamente elevados em todos os tecidos em camundongos administrados RAN. Tal melhoria foi significativamente superior em RAN + cal do que em ratinhos administrados apenas ran (Figura 5). Figura 5 Upper Painel de detecção de western blot Representante da p65, p53, securin, Bax e β-actina na medula óssea de ratinho (BM), as células esófago e do estômago após a exposição com RAN extrair com ou sem limão. Para BM, as células foram recolhidas após 60, 120 e 180 dias, enquanto que para esófago e do estômago, as células foram coletadas apenas depois de 180 dias de exposição. p-actina foi utilizado como controlo de carga. Lower análise densitométrica quantitativa em painel do nível de proteínas dos genes mencionados acima na medula óssea, esôfago e estômago células após 180 dias de exposição foi mostrado. Os valores são a média ± DP de três experiências independentes. Os valores são normalizados para os valores respectivos de p-actina. * P < 0,05; ** P < 0,01 Significativamente diferente em comparação com o controlo negativo /positivo (tal como determinado pelo teste t emparelhado).
Estudos de citometria de fluxo no ciclo celular e a detecção de células apoptóticas através de coloração dupla e imunotransferência
análise citométrica de fluxo do conteúdo de DNA na medula óssea , esófago e do estômago células de rato recolhidos, após 260 dias de administração RAN + cal (Figura 6A), mostrou que houve um aumento nas células em fase G1, tanto na medula óssea e do esófago em relação ao controlo não tratado. No entanto, no estômago, a percentagem de células na fase sub-G1 foi aumentada, o que poderia ser atribuída devido a morte celular por apoptose. Para confirmar isto, foi realizada a coloração dupla com annexinV e PI. Os dados na Figura 5B indicam um aumento de coloração positiva com anexina-V no quadrante 2 e 3 em células do estômago, mas não em células esofágicas da RAN + cal ratinhos administrados. Figura 6 Análise do ciclo celular e apoptose em ratinhos tratados com RAN com cal (A) Análise de ciclo celular após 260 dias de exposição com RAN extrair com cal, a medula óssea, esófago e do estômago de rato células e também a partir de células de tumor do estômago. (B) citogramas representativos de Anexina V versus intensidade de fluorescência de PI, como determinado por análise de citometria de fluxo em células esófago e do estômago de rato após 260 dias de exposição com RAN com cal e a partir de células de tumor do estômago. Dentro de um citograma, quadrante 1 e 2 representam precoces e tardios células apoptóticas, respectivamente; quadrante 3, as células viáveis; quadrante 4, as células mortas. (C) para transferência de Western marcadores de apoptose em células normais (não tratados) e estômago do tumor. β-actina foi utilizado como controlo de carga.
Curiosamente, a análise de citometria de fluxo de células tumorais recolhidas de ratinhos que desenvolveram tumor no estômago após 220 e 256 dias de administeration contínua de RAN e cal, revelaram uma redução significativa em células G1 com um aumento concomitante nas células sub-G1 (Figura 6A). coloração dupla indica que as células são sub-G1 células necróticas na sua maioria mortos (quadrante 4) (Figura 6B). Significativamente maior nível de p53 Comprar e proteínas Bax
foram observados em tumor de células do estômago normais (Figura 6c). No entanto, a PARP
foi encontrado a estar ausente em ambas as células de tumor do estômago, embora PARP
e seus 29 kD clivado produto estavam presentes em amostras normais do estômago (Figura 6c).

Discussão O presente estudo foi realizado para ver se ad libitum
administeration de RAN extrair com ou sem calcário na água pode induzir esôfago ou no estômago câncer no rato bebendo e se isso acontecer, o processo inicial estão envolvidos. Neste estudo, os ratos receberam a totalidade ran-extracto com e sem calcário, a fim de imitar o modelo de consumo humano RAN. Além disso, a dose foi aumentada também periodicamente à medida que isso acontece a humanos. Nossos resultados mostraram que tanto correu com e sem calcário induzir câncer de estômago, embora, refira-se que a presença de limão com RAN promoveu a transformação das células superior e, assim, desenvolveu câncer de estômago mais cedo do que RAN sozinho. Afigura-se que o cancro foi induzido no estômago devido à maior exposição seu revestimento teve a RAN, enquanto o revestimento esófago foi exposto apenas brevemente durante beber a RAN água misturada.
Foi demonstrado anteriormente que um pH alcalino é ideal para gerar ROS por auto-oxidação de polifenóis areca-porca [6, 7]. Mostrou-se também que a fracção de extracto de catequina Areca-porca gera activamente ROS a pH alcalino o que induz danos no ADN in vitro
[21, 22]. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

• Expressão de uma variante LINE-1 endonuclease no câncer gástrico: a sua associação com os parâmetros clínico
• mecanismo gastroprotetora do paederia foetida Linn. (Rubiaceae) - uma planta comestível popular usado pela comunidade tribal do Nordeste da Índia