CD44 men inte CD24 uttryck är relaterad till dålig prognos i icke-cardia adenocarcinom i stomach

CD44 men inte CD24 uttryck är relaterad till dålig prognos i icke-cardia adenocarcinom i magen Bild Sammanfattning
Bakgrund Nybyggt studier har fokuserat på den diagnostiska och prognostiska betydelsen av CD24 och CD44 uttryck i humana cancerformer. Denna studie syftade till att undersöka förändringar i CD44 och CD24 expressionsnivåer hos patienter med magcancer och att bedöma deras prognostiska värde.
Metoder
CD44 och CD24 expressionsnivåer undersöktes immunohistokemiskt i tumörprover från 290 patienter med icke-magmunnen gastric adenokarcinom, varav 77 hade parat intill normal magslemhinna. CD24 och CD44 mRNA-nivåer bestämdes genom kvantitativ polymeraskedjereaktion i 34 patienter. Serum anti-Helicobacter pylori
IgG detekterades genom enzymkopplad immunabsorberande analys. Relationer mellan CD44 och CD24 proteinexpressionsnivåer och tumör parametrar analyserades och deras prognostiska värden utvärderades genom Cox proportional hazards modeller.
Resultat
CD24 och CD44 expressionsnivåer var signifikant högre hos patienter med magsäckscancer jämfört med dem i parade kontroller (45,5% vs 0,0%, och 61,0% jämfört med 0,0%, P Hotel < 0,001). Bland 290 patienter, var den totala överlevnaden signifikant högre i CD44 (-) jämfört med CD44 (+) patienter (log-rank test, P
= 0,035). Det fanns dock ingen signifikant korrelation mellan CD24 uttryck och total överlevnadstid (log-rank test, P
= 0,115). Multivariat regressionsanalys indikerade att positiv CD44 expression (P
= 0,029), TNM staging (P
< 0,001), och lymphovascular invasion (P
= 0,016), men inte CD24-uttryck (P
= 0,065), var oberoende prognostiska faktorer i magcancer.
slutsatser
individuella uttryck av CD44 var förenat med dålig överlevnad hos patienter med magsäckscancer.
Nyckelord
CD44 CD24 Prognos magcancer expression Helicobacter pylori
bakgrund
Gastric cancer är den tredje vanligaste cancerformen i Kina. Trots förbättringar i kirurgiska tekniker och utveckling av nya kemoterapeutiska regimer, fanns 989,600 nya fall, och mer än 738,000 dödsfall i världen under 2008. Hälften av dessa fall och dödsfall beräknas ske i Kina. Prognosen för patienter med avancerad magsäckscancer är fortfarande dålig, även efter kurativ kirurgi [1-3]. Även om många studier har undersökt molekylära markörer för magcancer, mekanismerna för cancer förblir oklara. Interaktioner mellan genetiska mottaglighetsvarianter, molekylära förändringar, och miljö- och livsstilsfaktorer är kända för att bidra till utvecklingen av gastrisk cancer. TNM stadieindelning av magcancer används för att bedöma prognosen, men det finns för närvarande ingen bra molekylbaserade biomarkör som kan fungera som en användbar prognostisk prediktor för avancerad magsäckscancer [4]. Både CD24 och CD44 är kända för att bidra till cellulär signalering och celladhesion, och deras roll i cancer har undersökts. CD24 är en mucin-liknande cellytprotein visat sig vara associerade med malignitet i talrika human-vävnadsstudier [5]. CD44 är ett transmembrant glykoprotein involverat i cellulär adhesion, som också har visat sig vara mycket uttryckt i magcancer [6]. Sheridan et al. visade att CD44 (+) /CD24 (-) fenotyp av bröstcancerceller var associerad med invasiva egenskaper och dålig prognos [7]. Cancerstamceller (CSCS) har nyligen identifierats i humana gastriska cancercellinjer i flera studier [8], och CD44 (+) CD24 (+) celler har visat att definiera en i hög grad tumörframkallande, magsäckscancer cellpopulation med egenskaper av själv -regeneration och flera härstamning differentiering [9]. Weichert et al. visade att cytoplasmiskt uttryck av CD24 var oberoende korrelerat med förkortad överlevnad i kolorektal cancer [10]. Yong et al. Nyligen undersökte CD44 /CD24 uttryck i en retrospektiv analys av patienter med återkommande magcancer, men fann inga samband mellan enskilda eller kombinerade uttrycket av CD24 och CD44 och återfall av magsäckscancer [11]. Baserat på dessa tidigare studier, hypotes vi att CD24 och CD44 uttryck kan korreleras med magcancer prognos. Syftet med denna studie var därför att utvärdera uttrycksnivåer av CD24 och CD44 i magcancer och utvärdera deras eventuella prediktiva relevans för framtida klinisk praxis. Helicobacter pylori
infektion anses vara en riskfaktor för magcancer, och en nyligen genomförd studie rapporterade att H. pylori
via CagA presenterade CSC-liknande egenskaper i gastric epitelceller [12]. Vi har därför undersökt också sambandet mellan H. pylori
infektion och CD24 /CD44 uttryck.
Metoder
Deltagarna Review, en totalt 290 patienter (221 män och 69 kvinnor) med icke-magmunnen magcancer som gick radikal operation (D1 + eller D2) vid första sjukhuset i Jilin University rekryterades i denna studie mellan augusti 2000 och december 2010. patienterna fick inte någon preoperativ kemoradioterapi. Postoperativ kemoterapi gavs till alla patienter med stegen II, III och IV tumörer. Diagnosen av magcancer gjordes på grunderna för morfologiska och immunhistokemiska fynd, utvärderas oberoende av två patologer (MJ och YW). Tumörprover uppsamlades vid kirurgi. Histopatologisk klassificering och kvaliteter av adenokarcinom definierades enligt Laurén klassificering [13] och Världshälsoorganisationen (WHO) klassificering 2010 [14]. De inkluderade papillära adenokarcinom (n = 4), tubulär adenokarcinom (n = 252), mucinöst adenokarcinom (n = 27), och dåligt kohesiva karcinom (klackring cellscancer) (n = 7) enligt WHO klassificering 2010. Intill normal gastrisk epitelceller prover också in från 77 patienter för jämförelse. Patient åldrar från 32 till 87 år, med en medianålder på 64 år. Skriftligt informerat samtycke erhölls från alla patienter och studieprotokollet godkändes av den etiska kommittén i första sjukhuset i Jilin University
Immunohistokemi
vävnadsblock konstruerades med hjälp av en vävnadsuppsättning (Minicore,. Alphelys Impasse Paul Langevin, Plaisir, Frankrike). Sektioner (4 pm tjockt) skars, avparaffinerades, och färgades med användning av en streptavidin-biotin immunoperoxidasteknik. Sektionerna inkuberades sedan med en anti-human CD24-polyklonal antikropp (1: 100 utspätt, sc-7034; Santa Cruz, USA) och en CD44 monoklonal antikropp (1:50 utspätt, MA1-81995; Thermo Fisher Scientific Inc., Chicago , IL, USA), respektive. 3, 3-Diaminobenzidine användes som kromogen. Sektioner motfärgades med hematoxylin. Slides behandlade med IgG-isotyper i stället för primära antikroppar användes som negativa kontroller. De färgade objektglas utvärderades oberoende av två patologer (MJ och YW) som var blind för kliniska data och resultat. Färgningsintensitet och procentandelar av celler färgade vid en specifik storlek av intensitet bedömdes med hjälp av allmänt accepterade HSCORE systemet. Den HSCORE beräknades enligt följande ekvation: HSCORE = ΣPi (i) (I = 0, 1, 2, 3, Pi = 0-100%), där i representerar färgningsintensiteten, dvs 0 = ingen färgning, en = svag färgning, 2 = moderat färgning, och 3 = stark färgning. (Ytterligare fil 1: Figur S1) Fotografier av de referensnivåer som är visade i de kompletterande data. Med tanke på att Pi representerar den procentandel av färgade celler med intensiteter varierar från 0 till 100%, var den slutliga HSCORE varierade från 0 till 300. Procenthalterna av positiva celler räknades i minst 50 fält genom att undersöka minst 1000 celler under ett mikroskop, med användning av 40 × objektiv. De uttrycksnivåer av CD24 och CD44 klassificerades som negativa (HSCORE < 30) och positiva (HSCORE ≥ 30). Cut-off värden för CD24 och CD44 (HSCORE < 30) modifierades i enlighet med resultaten från tidigare studier [11, 15]
Omvänd transkription-polymeraskedjereaktions kvantifiering av CD24 och CD44
uttrycksnivåer av CD24. och CD44 mRNA bestämdes i 34 patienter med magcancer. I korthet extraherades RNA från magen vävnader med hjälp av en RNA Isolation Kit (Axygen, CA, USA) enligt tillverkarens anvisningar. Efter DNas-behandling, var första sträng cDNA syntetiserades med användning av ett cDNA-synteskit (Roche, Basel, Schweiz). Kvantitativ polymeraskedjereaktion av CD24 (framåtriktad primer: AAA CAA CAA CTG GAA CTT CAA GTA ACT C, omvänd primer: GGT GGT GGC ATT AGT TGG ATT T) och CD44v6 (framåtriktad primer: TCC CTG CTA CCA ATA GGA ATG ATG, omvänd primer : GGT CAC TGG GAT GAA GGT CC) utfördes med användning Light Cycler 480-systemet (Roche). Glyceraldehyd 3-fosfatdehydrogenas (GAPDH) kvantifierades som en endogen RNA-kontroll (framåtriktad primer: TGC ACC ACC AAC TGC TTA GC, omvänd primer: GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG).
Bestämning av H. pylori
infektion
Blodprover prover~~POS=HEADCOMP uppsamlades från 103 patienter för att bestämma närvaron av H. pylori
infektion innan operationen. Serum anti-H. pylori
IgG detekterades genom enzymkopplad immunosorbentanalys (Biohit, Helsingfors, Finland). I korthet framställdes prover med titrar över cut-off-värde av 30 EIU betraktas som positiva för H. pylori-
infektion, såsom beskrivits tidigare [16].
Statistisk analys sälja The HSCOREs för CD24 och CD44 uttryck var presenteras som median (interkvartilt intervall). Mann-Whitney U, Kruskal-Wallis H och Wilcoxon signed rank test användes för att jämföra resultat mellan grupperna. Kaplan-Meier-metoden användes för att uppskatta den totala överlevnaden, och skillnadsöverlevnadsanalyserades med användning av log-rank test. En Cox proportional hazards modell användes för att beräkna de relativa riskerna och motsvarande 95% konfidensintervall (CI), efter justering för ålder, kön, lymphovascular invasion, och TNM stadieindelning. Analyser utfördes med hjälp av SPSS 18,0 (SPSS Inc., USA). Alla statistiska tester tvåsidiga och P
värderingar < 0,05 ansågs vara statistiskt signifikant.
Resultat
CD24 och CD44 expressionsnivåer i magcancer
CD24 och CD44 uttryck detekterades i membranet av cancerceller i magcancer prover (Figur 1). Svag färgning för både CD24 och CD44 observerades också i kärnan av gastric cancerceller. Alla negativa kontroller demonstrerade försumbar bakgrundsfärgning. Bland 77 parade prover, var CD24 (+) och CD44 (+) färgningsresultat finns i 35/77 (45,5%) och 47/77 (61,0%) av de magcancer prover. Men de parade normala gastric epitelceller uppvisade negativa uttryck av CD24 och CD44. mRNA expressionsnivåer av både CD24 och CD44 var påtagligt högre i immunhistokemiskt positiva jämfört med immunhistokemiskt negativa grupper. MRNA expressionsnivåer av CD24 och CD44 överensstämde med immunohistokemi resulterar i magcancer (Figur 2). Figur 1 Visualisering av CD24 och CD44 uttryck i gastric cancerceller genom immunohistokemi. CD24 (A) och CD44 (B) immunfärgning i membranet hos gastriska karcinomceller.
Figur 2 mRNA expressionsnivåer av CD24 och CD44. Kvantifiering genom omvänd transkription-polymeraskedjereaktion visade att CD24 (A) och CD44 (B) nivåerna var signifikant högre i immunhistokemiskt positiva jämfört med immunhistokemiskt negativa grupper, respektive. *, P Hotel < 0,001.
Samband mellan CD24 /CD44 uttrycksnivåer och clinicopathologic parametrar
Patienter med lymphovascular invasion hade betydligt högre CD44 positivitet än de utan invasion (P
= 0,013). CD24 och CD44 expressionsnivåer analyserades också efter ålder, kön, tumördifferentiering, djup invasion, lymfkörtel metastas, och TNM stadium. Det fanns dock inga signifikanta skillnader i CD24 /CD44-uttrycksnivåer i förhållande till dessa parametrar. De kliniska egenskaperna hos de ämnen sammanfattas i tabell 1.Table 1 CD24 och CD44 uttryck i gastriska karcinom enligt kliniskt patologiska parametrar
CD24 positiv ränta n (%)
P-värde

vid CD44 positiv ränta n (%)
P-värde
Kön
Man (n = 221) Review 92 (41,6) Review 0,148
133 (60,2) katalog 0,835
Kvinna (n = 69) Review 22 (31,9) Review 45 (65,2) Review Ålder (y) katalog ≤60 (n = 127 ) Review 48 (37,8) katalog 0,435
85 (66,9) Review 0,087 Hotel > 60 (n = 163) Review 69 (42,3) Review 93 (57,0)
H. pylori
infektion (n = 103) katalog Positiv (n = 67) Review 24 (35,8) Review 0,096
48 (71,6) Review 0,815
Negativ (n = 36) Review 19 (52,8) Review 25 (69,4) Review Lauren klassificering
Intestinal typ (n = 104) Review 42 (40,3) katalog 0,965
67 (64,4)
0,168
Diffus typ (n = 186) Review 77 (41,3) Review 103 (55,3) Review WHO-klassificering
Papillär adenocarcinom (n = 4) Review en (25,0)
0,906
4 (100,0) Review 0,064
Tubular adenocarcinom
Well (n = 1) katalog 0 (0,0) Review 0 (0,0) Review Medel (n = 98) Review 30 (30,6) Review 49 (50,0) Review Dåligt (n = 153) Review 47 (30,7) Review 87 (56,9) Review mucinous adenokarcinom (n = 27)
7 (25,9) Review 13 (48,1)
Dåligt sammanhängande karcinom (signetring cellscancer) (n = 7) katalog 1 (14,3) Review en (14,3) Review lymfa-vaskulära invasion
Frånvarande (n = 134) Review 56 (41,8) Review 0,642
72 (53,7) Review 0,013
Present (n = 156) Review 61 (39,1)
106 (67,9) Review TNM stadium
I (n = 23) Review 10 (43,5) Review 0,844
16 (69,6) Review 0,559
II (n = 47)
19 (40,4) Review 32 (68,1) Review III (n = 187) Review 77 (41,2) Review 110 (58,9) Review IV (n = 33) katalog 11 (33,3) Review 20 (60,6) Review Invasion
T1 (n = 9) katalog 2 (22,2) Review 0,537
7 (77,8) Review 0,485
T2 ( n = 36) Review 14 (38,9) Review 22 (61,1) Review T3 (n = 212) Review 85 (40,1) Review 132 (62,2) Review T4 (n = 33)
16 (48,5) Review 17 (51,5) Review Lymfkörtel metastaser
N0 (n = 62) Review 27 (43,5) Review 0,445
40 (64,5) Review 0,534
N1 (n = 89) Review 39 (43,8) Review 49 (55,1) Review N2 (n = 74) Review 24 (32,4) Review 47 (63,5) Review N3 (n = 65) Review 27 (41,5) Review 42 (64,6) Review Survival
levde (n = 171) Review 62 (36,3) Review 0,089
96 (56,1 ) katalog 0,028
Död (n = 119) Review 55 (46,2) Review 82 (68,9) Review CD44 uttryck förknippas med dålig överlevnad
Uppföljning information tillgänglig för alla 290 patienter för perioder av 3-135 månader (median 41 månader). Ingen patient dog av postoperativa komplikationer inom 30 dagar från början av studieperioden, men 119 (41,0%) patienter dog under uppföljningsperioden. Den totala överlevnadstiden var signifikant längre i CD44 (-) jämfört med CD44 (+) patienter (Figur 3A, log-rank test, P
= 0,035). Även patienter med CD24 (-) tumörer visade en trend mot längre övergripande trenden överlevnad, skillnaden var inte signifikant (Figur 3B, log-rank test, P
= 0,115). TNM stadium och lymphovascular invasion var signifikant relaterade till postoperativ överlevnadstiden (figur 3C, D). Figur 3 Faktorer som påverkar den totala överlevnaden hos patienter med magcancer. Observera ingen signifikant korrelation mellan CD24 uttryck och total överlevnadstid (B). Men CD44 uttryck (A), TNM staging (C), och lymphovascular invasion (D) var signifikant associerade med dålig överlevnad i magcancer.
CD44 uttryck var en oberoende prognostisk markör
Efter justering för kön, ålder, TNM skede och lymphovascular invasion hade CD44 (+) patienter en signifikant högre risk för magcancer relaterade dödsfall jämfört med CD44 (-) patienter (oddskvot (OR) = 1,57; 95% CI: 1,05-2,36; P
= 0,029). Jämfört med patienter som var CD24 (-), hade CD24 (+) patienter en högre sannolikhet för kortare total överlevnad, men skillnaden var inte signifikant (OR = 1,41; 95% CI: 0,98-2,02; P
= 0,065) . Multivariata analyser identifierat CD44 uttryck, TNM stadium, och lymphovascular invasion som oberoende prognostiska faktorer för dålig patientöverlevnad i magcancer (tabell 2) .table 2 multivariat analys med Cox proportional hazards modell för att förutsäga den totala överlevnaden hos patienter med magcancer

Relativ risk (95% KI)
P-värde *
CD44 uttryck
Negativ (n = 112) katalog Referens
Positiv (n = 178) Review 1,57 (1,05-2,36) Review 0,029
CD24 uttryck
Negativ (n = 173) katalog Referens
Positiv (n = 117) Review 1,41 (0,98-2,02 ) katalog 0,065
TNM staging
I (n = 23) katalog Referens
II (n = 47) Review 1,69 (0,46-6,24) Review 0,433
III ( n = 187) Review 4,32 (1,33 till 14,01) Review 0,015
IV (n = 33) Review 14,53 (4,27-49,41) Hotel < 0,001
Lymfa-vaskulär invasion
Frånvarande (n = 134) katalog Referens
Present (n = 156) Review 1,60 (1,09-2,35) Review 0,016
* Cox proportional hazards model, justerat för kön, ålder, venöst infiltration var TNM staging
CD24 /CD44 uttrycksnivåer och H. pylori
infektion.
Helicobacter pylori
infektion detekteras i 67 av (65,4%) gastric cancerpatienter 103 testade. Det fanns dock ingen korrelation mellan H. pylori
infektion och CD44 uttryck (P
= 0,815), och inget signifikant samband mellan H. pylori
infektion och CD24 uttryck (P
= 0,096).
Diskussion
Flera nya studier har fokuserat på den diagnostiska och prognostiska betydelsen av CD24 och CD44 uttryck i humana cancerformer [17-19], och roller CD24 och CD44 i magcancer har också undersökts [6, 11 , 20, 21]. Takahashi et al. rapporterade att CD24 uppreglering var signifikant associerad med djup invasion och hög patologisk steg i 173 patienter med magcancer [22]. Frekvensen av CD44-uttryck i magcancer varierar kraftigt 31-72%. Ozmen et al. rapporterade signifikanta samband mellan CD44 överuttryck och perineural invasion och lymfkörtel positivitet i gastric cancer [23]. Den aktuella studien analyserades samtidigt CD24 och CD44 expressionsnivåer oberoende och visade att positivt uttryck för CD44 ensam, men inte CD24, var associerat med dålig överlevnad i magcancer. Ingen CD24 (+) eller CD44 (+) färgning återfanns i normal gastrisk yta epitel i föreliggande studie, även om Bessede et al. gjorde upptäcka CD44 uttryck i normal magslemhinna [12]. Ytterligare studier behövs för att förklara denna uppenbara avvikelse. CD24 är en mucin-typ glykosylfosfatidylinositol bunden cellytprotein som uttrycks i utveckla eller regenererande vävnad och i äggstockscancer och hepatocellulär cancer [20, 24]. Tidigare undersökning av korrelationen mellan CD24 /CD44 uttryck och magcancer avslöjade att CD24 (+) patienter hade en högre sannolikhet för magcancer återfall än CD24 (-) patienter [11]. Dock kvarstår den biologiska funktionen av CD24 i cancer okänd. Tidigare studier observerade sambandet mellan hög CD24 uttryck och lymfkörtel metastas, venös invasion, och lymfatiska invasion. Även denna studie fann en trend mot kortare överlevnad i CD24 (-) jämfört med CD24 (+) patienter, var skillnaden inte signifikant. Duckworth et al. upptäckt CD24 uttryck i magsäckens parietalceller och visade att det regleras apoptos och svaret på Helicobacter felis
infektion i en musmodell [25]. Men den aktuella studien fann inget signifikant samband mellan Helicobacter
infektion och CD24 uttryck. En möjlig förklaring till den signifikant samband mellan CD44 och överlevnad kan vara relaterade till den stamcells funktion av CD44 (+) celler [26-29]. Under 2009 Takaishi et al. först visade förekomsten av CD44 (+) celler utrustade med stamcells egenskaper i gastriska tumörer. De rapporterade att CD44 (+) gastric cancerceller visade stamcellsegenskaperna hos självförnyelse och förmågan att bilda differentierad avkomma och ge upphov till CD44 (-) celler. Takaishi et al. verifieras ytterligare CD44 som en cellytmarkör av gastriska CSCs i flera humana gastriska cancercellinjer, och visade att CD44 (+) gastriska cancerceller visade ökad resistens mot chemotherapy- eller strålningsinducerad celldöd [29]. Liu et al. rapporterade att CD44 var en direkt och relevant nedströms mål av MIR-34a i prostatacancer. CD44 proteinnivåer minskade i celler som överuttrycker MIR-34a, och slå ner av CD44 funktionellt härmade Mir-34a effekter av inhibition av tumörutveckling och metastaser [30]. Vi ansåg därför att högre uttryck av CD44 i gastric cancerceller kan utgöra en större andel av CSCs, vilket förklarar varför CD44 (+) patienter visar sämre total överlevnad än CD44 (-) patienter. Ytterligare studier är motiverade för att undersöka mekanismerna för miRNA reglering av CSCs.
Slutsatser
Sammanfattningsvis var uttryck av CD44 i samband med dålig överlevnad hos patienter med magsäckscancer. Detta tyder på att CD44 kan vara ett kliniskt användbart prognostisk markör, och kan också representera en användbar terapeutiskt mål. Men funktioner CD24 och CD44 i gastric cancer förblir oklara [31, 33], och ytterligare studier behövs för att klargöra sina roller.
Förklaringar
Bekräftelser
Detta arbete stöddes av Norman Bethune Program Jilin University [2013025], och National Natural Science Foundation i Kina (81072369 och 81273065)
Elektronisk kompletterande material
12876_2014_1181_MOESM1_ESM.pptx Ytterligare fil 1: fig. S1: fotografier av CD44 immunohistokemi färgningsintensitet: 0, 1 , 2 och 3. (PPTX 5 MB) Författare "ursprungliga lämnat filer för Images of Nedan finns länkar till författarnas ursprungliga inlämnade filer för bilder. 12876_2014_1181_MOESM2_ESM.pdf Författaroriginalfilen för figur 1 12876_2014_1181_MOESM3_ESM.pdf Författaroriginalfilen för figur 2 12876_2014_1181_MOESM4_ESM.pdf Författaroriginalfilen för figur 3 Konkurrerande intressen
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.
Författare " bidrag
JJ och XC utformade studien och genomförs de flesta av studien; JJ och XC skrev det första utkastet av manuskriptet; DC utförde de molekylära experiment; HM utfört patologi experiment; MJ, YW, och FK analyserade patologiska data; DC, ZJ, och FK samlat patienternas klinisk information; JJ utförde den statistiska analysen. Alla författare läst och godkänt den slutliga manuskriptet.

• De overmethylated gener i Helicobacter pylori-infekterade magslemhinnan är demetylerade i magcancer
• Spontan bristning av jätte gastric stromal tumör i mag lumen