Genetisk oscillator fångar upp förändringar i tarmmikrobiomens tillväxtmönster

För all uppmärksamhet som det mänskliga mikrobiomet har fått under de senaste åren, en aspekt av sådan forskning gör sällan rubriker:svårigheten att observera hur den förändras över tid som svar på olika stimuli. Den vanligaste analysmetoden är att extrahera bakterier från avföringsprover och sedan sekvensera deras genom, men detta tillvägagångssätt, samtidigt som den är minimalt invasiv, tappar viktig information om var och när bakteriella förändringar sker i tarmen, ge forskare en ofullständig bild av mikrobiomets dynamik.

Nu, ett nytt verktyg skapat av forskare vid Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering vid Harvard University och Harvard Medical School (HMS) ger en lösning på detta problem i form av en uppsättning bakteriegener som har utvecklats för att upptäcka och registrera förändringar i tillväxt av olika populationer av bakterier över tid i tarmarna hos levande möss med encells precision, och kan fungera som en plattform för komplexa, syntetbiologibaserad diagnostik och terapi för en mängd olika tillämpningar i tarmen. Studien publiceras i Naturkommunikation .

Håller tid

Systemet använder en oscillerande genkrets, kallade en repressilator, som en slags genetisk klocka för att mäta bakterietillväxt. Repressilatorn består av tre bakteriegener som kodar för tre proteiner (tetR, cl, och lacI), var och en blockerar uttrycket av ett av de andra proteinerna. Generna är kopplade till en negativ återkopplingsslinga, så att när koncentrationen av ett av repressorproteinerna sjunker under en viss nivå, proteinet som det hade förtryckt uttrycks, som blockerar uttrycket av det tredje proteinet, och processen upprepas på ett cykliskt sätt.

När alla tre generna sätts in i en plasmid och introduceras i bakterier, antalet slutförda negativa återkopplingsslingcykler kan fungera som ett register över hur många celldelningar bakterierna har genomgått. Varje gång bakterierna delar sig, alla repressorproteiner som finns i deras cytoplasma späds ut, så deras koncentration sjunker gradvis och utlöser uttrycket av nästa protein i repressilatorcykeln. Avgörande, repressilatorcykeln upprepas efter 15,5 bakteriegenerationer oavsett hur snabbt eller långsamt bakterierna växer. Detta gör att den kan fungera som en objektiv mätning av tid, ungefär som en klocka eller en klocka.

"Tänk om du hade två personer som hade två olika klockor, och den andra handen på en persons klocka rörde sig dubbelt så snabbt som den andra personens, "förklarade författaren David Riglar, Ph.D., en tidigare postdoc vid Wyss Institute och HMS som nu leder en forskargrupp som Sir Henry Dale Fellow vid Imperial College London. "Om du stoppade båda klockorna efter en timme, de skulle inte komma överens om vad klockan var, eftersom deras mätning av tid varierar baserat på hastigheten för den andra handens rörelse. I kontrast, vår repressilator är som en klocka som alltid rör sig i samma hastighet, så oavsett hur många olika människor som bär en, de kommer alla att ge en konsekvent mätning av tiden. Denna kvalitet gör att vi mer exakt kan studera beteendet hos bakterier i tarmen. "

Forskarna kopplade vart och ett av de tre repressorproteinerna till en fluorescerande molekyl med olika färg, och utvecklade ett avbildningsarbetsflöde kallat RINGS (Repressilator-based Inference of Growth på encellsnivå) för att spåra vilket protein som uttrycks vid olika tidpunkter under bakteriens tillväxt. "När en bakteriekoloni växer utåt, repressilatorkretsen skapar dessa olika fluorescerande, trädringliknande signaturer baserade på vilket repressorprotein som var aktivt i den enda bakterien som startade kolonin, "sa Riglar." De fluorescerande ringarnas mönster registrerar hur många repressilatorcykler som har inträffat sedan tillväxten började, och vi kan analysera det mönstret för att studera hur tillväxttakten varierar mellan olika bakterier och i olika miljöer. "

Med RINGAR, laget kunde framgångsrikt spåra celldelningar i flera olika bakteriearter odlade in vitro, och observerade att längden på bakteriens repressilatorcykel förblev konsekvent när de odlades på extraherade prover av mustarmen (för att simulera en komplex mikromiljö) eller exponerades för ett antibiotikum (för att simulera stressförhållanden och inkonsekventa tillväxtmönster).

Ändring av spårning

För att utvärdera repressilatorns prestanda in vivo, laget administrerade E. coli innehållande repressilatorkretsen till möss oralt, analyserade sedan bakterier extraherade från avföringsprover. Repressilatorn förblev aktiv i upp till 16 dagar efter introduktionen, visar att långsiktigt oscillerande genuttryck kunde bibehållas i tarmbakterier hos levande däggdjur. RINGS -analysen upptäckte framgångsrikt förändringar i bakterietillväxtmönster, och bakterier vars repressilatorkretsar befann sig i olika stadier kunde "synkroniseras" genom att ge mössen en förening i sitt dricksvatten som stoppade repressilatorcykeln vid ett givet skede.

Till sist, forskarna testade repressilatorns förmåga att upptäcka skillnader i bakterietillväxt som har observerats till följd av tarminflammation. Möss fick en inflammationsframkallande förening, följt av repressilator-laddade bakterier. Efter 15 timmar, RINGS -analys visade att bakterierna från möss med inflammation hade repressilatorer i ett större antal faser jämfört med bakterier från kontrollmöss, tyder på att inflammation skapar en miljö som driver inkonsekvenser i bakterietillväxt, kan leda till obalanser i tarmmikrobiomet.

Denna repressilator tillåter oss att verkligen undersöka invecklingarna i bakteriellt beteende i den levande tarmen, inte bara i både friska och sjuka stater, men också rumsligt och tidsmässigt. Det faktum att vi kan synkronisera repressilatorn när den redan är i tarmen, samt behålla det utan att behöva administrera selektiva antibiotika, betyder också att vi kan studera mikrobiomet i ett mer naturligt tillstånd med minimal störning. "

Pamela Silver, Ph.D., motsvarande författare, Kärnfakultetsmedlem vid Wyss Institute, Elliot T. och Onie H. Adams Professor i biokemi och systembiologi vid HMS

Förutom att förstå mikrobiomens dynamik, repressilatorn låser upp potentialen för komplexa, syntetbiologibaserad diagnostik och terapi för människans tarm. Potentiella tillämpningar inkluderar skapandet av ett system som är programmerat för att initiera en gentranskriptionskaskad vid en viss punkt i dygnsrytmen, eller en diagnos som registrerar hur mycket tid som har gått efter detekteringen av en given biomarkör.

"Inte bara löser denna forskning ett specifikt problem relaterat till övervakning av dynamiska förändringar i mikrobiomfysiologin i den levande tarmen, det ger en plattform som kan leda till helt nya typer av diagnostik och till och med tidsberoende terapier, säger Wyss grundande direktör Donald Ingber, M.D., Ph.D., som också är Judah Folkman professor i vaskulär biologi vid HMS och Vascular Biology Program på Boston Children's Hospital, samt professor i bioingenjör vid Harvards John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences.

• Hjärnprotein spelar en framträdande roll i upprätthållandet av kronisk smärta
• Nytt verktyg registrerar och spårar tillväxt av mikrobiomer