L'oscillateur génétique capture les changements dans les schémas de croissance du microbiome intestinal

Malgré toute l'attention que le microbiome humain a suscitée ces dernières années, un aspect de ces recherches fait rarement la une des journaux :la difficulté d'observer son évolution dans le temps en réponse à divers stimuli. La méthode d'analyse la plus courante consiste à extraire des bactéries d'échantillons fécaux puis à séquencer leurs génomes, mais cette approche, tout en étant peu invasif, perd des informations cruciales sur où et quand les changements bactériens se produisent dans l'intestin, fournir aux scientifiques une image incomplète de la dynamique du microbiome.

Maintenant, un nouvel outil créé par des chercheurs du Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering de l'Université Harvard et de la Harvard Medical School (HMS) apporte une solution à ce problème sous la forme d'un ensemble de gènes bactériens qui ont été conçus pour détecter et enregistrer les changements dans le croissance de différentes populations de bactéries au fil du temps dans les intestins de souris vivantes avec une précision unicellulaire, et peut servir de plate-forme pour des complexes, diagnostics et thérapeutiques basés sur la biologie synthétique pour une variété d'applications dans l'intestin. L'étude est publiée dans Communication Nature .

Garder le temps

Le système utilise un circuit génétique oscillant, appelé un répressilateur, comme une sorte d'horloge génétique pour mesurer la croissance bactérienne. Le répressilateur est constitué de trois gènes bactériens qui codent pour trois protéines (tetR, cl, et lacI), dont chacune bloque l'expression de l'une des autres protéines. Les gènes sont liés dans une boucle de rétroaction négative, de sorte que lorsque la concentration de l'une des protéines répresseurs tombe en dessous d'un certain niveau, la protéine qu'elle réprimait est exprimée, qui bloque l'expression de la troisième protéine, et le processus se répète de façon cyclique.

Lorsque les trois gènes sont insérés dans un plasmide et introduits dans des bactéries, le nombre de cycles de boucle de rétroaction négative terminés peut servir d'enregistrement du nombre de divisions cellulaires subies par la bactérie. Chaque fois que les bactéries se divisent, les éventuelles protéines répresseurs présentes dans leur cytoplasme sont diluées, ainsi leur concentration diminue progressivement et déclenche l'expression de la protéine suivante dans le cycle du répressilateur. Surtout, le cycle du répressilateur se répète après 15,5 générations bactériennes, quelle que soit la vitesse ou la lenteur de la croissance des bactéries. Cela lui permet d'agir comme une mesure objective du temps, un peu comme une horloge ou une montre.

"Imaginez si vous aviez deux personnes portant deux montres différentes, et la trotteuse de la montre d'une personne se déplaçait deux fois plus vite que celle de l'autre personne, " a expliqué le premier auteur David Riglar, Doctorat., un ancien post-doctorant au Wyss Institute et au HMS qui dirige maintenant un groupe de recherche en tant que Sir Henry Dale Fellow à l'Imperial College de Londres. "Si vous arrêtez les deux montres après une heure, ils ne seraient pas d'accord sur l'heure qu'il était, parce que leur mesure du temps varie en fonction de la vitesse du mouvement de la trotteuse. En revanche, notre répressilateur est comme une montre qui bouge toujours à la même vitesse, donc peu importe combien de personnes différentes en portent un, ils donneront tous une mesure cohérente du temps. Cette qualité nous permet d'étudier plus précisément le comportement des bactéries dans l'intestin."

Les chercheurs ont couplé chacune des trois protéines répresseurs à une molécule fluorescente de couleur différente, et a développé un flux de travail d'imagerie appelé RINGS (Inférence de croissance basée sur le repressilateur au niveau d'une seule cellule) pour suivre quelle protéine est exprimée à différents moments au cours de la croissance de la bactérie. "Au fur et à mesure qu'une colonie bactérienne se développe vers l'extérieur, le circuit répressilateur crée ces différents fluorescents, signatures en forme d'anneau d'arbre basées sur la protéine répresseur active dans la seule bactérie qui a démarré la colonie, " a déclaré Riglar. " Le motif des anneaux fluorescents enregistre le nombre de cycles de répressilateur qui se sont produits depuis le début de la croissance, et nous pouvons analyser ce modèle pour étudier comment les taux de croissance varient entre différentes bactéries et dans différents environnements. »

À l'aide des ANNEAUX, l'équipe a réussi à suivre les divisions cellulaires dans plusieurs espèces bactériennes différentes cultivées in vitro, et a observé que la durée du cycle de répressilateur des bactéries restait constante lorsqu'elles étaient cultivées sur des échantillons extraits d'intestin de souris (pour simuler un microenvironnement complexe) ou exposées à un antibiotique (pour simuler des conditions de stress et des schémas de croissance incohérents).

Suivi du changement

Pour évaluer les performances du répressilateur in vivo, l'équipe a administré à des souris E. coli contenant le circuit répressilateur par voie orale, puis analysé les bactéries extraites d'échantillons fécaux. Le répressilateur est resté actif jusqu'à 16 jours après l'introduction, montrant que l'expression génique oscillatoire à long terme pourrait être maintenue dans les bactéries intestinales chez les mammifères vivants. L'analyse RINGS a détecté avec succès des changements dans les schémas de croissance bactérienne, et les bactéries dont les circuits de répressilateur étaient à différents stades pouvaient être « synchronisées » en donnant aux souris un composé dans leur eau de boisson qui arrêtait le cycle de répressilateur à un stade donné.

Finalement, les chercheurs ont testé la capacité du répressilateur à détecter les différences de taux de croissance bactérienne observées à la suite d'une inflammation intestinale. Les souris ont reçu un composé induisant l'inflammation, suivi par des bactéries chargées de répressilateur. Après 15 heures, L'analyse RINGS a montré que les bactéries des souris atteintes d'inflammation avaient des répressilateurs dans une plus large gamme de phases par rapport aux bactéries des souris témoins, suggérant que l'inflammation produit un environnement qui entraîne des incohérences dans la croissance bactérienne, entraînant potentiellement des déséquilibres dans le microbiome intestinal.

Ce répressilateur nous permet de vraiment sonder les subtilités du comportement bactérien dans l'intestin vivant, non seulement dans les états sains et malades, mais aussi spatialement et temporellement. Le fait qu'on puisse resynchroniser le répressilateur alors qu'il est déjà dans l'intestin, ainsi que de le maintenir sans avoir besoin d'administrer des antibiotiques sélectifs, signifie également que nous pouvons étudier le microbiome dans un état plus naturel avec un minimum de perturbations."

Paméla Argent, Doctorat., auteur correspondant, Membre principal du corps professoral du Wyss Institute, Elliot T. et Onie H. Adams Professeur de biochimie et de biologie des systèmes à HMS

En plus de comprendre la dynamique du microbiome, le répressilateur libère le potentiel de complexe, diagnostics et thérapeutiques basés sur la biologie synthétique pour l'intestin humain. Les applications potentielles incluent la création d'un système programmé pour initier une cascade de transcription de gènes à un certain point du rythme circadien, ou un diagnostic qui enregistre combien de temps s'est écoulé après la détection d'un biomarqueur donné.

"Non seulement cette recherche résout un problème spécifique lié à la surveillance des changements dynamiques de la physiologie du microbiome dans l'intestin vivant, il fournit une plate-forme qui pourrait conduire à de tout nouveaux types de diagnostics et même à des thérapies dépendantes du temps », a déclaré le directeur fondateur de Wyss, Donald Ingber, MARYLAND., Doctorat., qui est également le professeur Judah Folkman de biologie vasculaire au HMS et le programme de biologie vasculaire du Boston Children's Hospital, ainsi que professeur de bio-ingénierie à la John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences de Harvard.

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