Genetisk oscillator fanger opp endringer i tarmmikrobiomets vekstmønstre

For all oppmerksomheten det menneskelige mikrobiomet har fått de siste årene, ett aspekt av slik forskning kommer sjelden til overskrifter:Vanskeligheten med å observere hvordan den endres over tid som svar på ulike stimuli. Den vanligste analysemetoden er å trekke ut bakterier fra fekale prøver og deretter sekvensere genomene deres, men denne tilnærmingen, mens den er minimalt invasiv, mister avgjørende informasjon om hvor og når det skjer bakterielle endringer i tarmen, gi forskere et ufullstendig bilde av dynamikken i mikrobiomet.

Nå, et nytt verktøy laget av forskere ved Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering ved Harvard University og Harvard Medical School (HMS) gir en løsning på dette problemet i form av et sett med bakteriegener som er konstruert for å oppdage og registrere endringer i vekst av forskjellige populasjoner av bakterier over tid i tarmen til levende mus med encellet presisjon, og kan fungere som en plattform for komplekse, syntetisk-biologisk basert diagnostikk og terapi for en rekke bruksområder i tarmen. Studien er publisert i Naturkommunikasjon .

Holder tid

Systemet bruker en oscillerende genkrets, kalt en repressilator, som en slags genetisk klokke for å måle bakterievekst. Repressilatoren består av tre bakteriegener som koder for tre proteiner (tetR, cl, og lacI), som hver blokkerer uttrykket for et av de andre proteinene. Genene er knyttet til en negativ tilbakemeldingssløyfe, slik at når konsentrasjonen av et av repressorproteinene faller under et visst nivå, proteinet det hadde undertrykt kommer til uttrykk, som blokkerer uttrykket for det tredje proteinet, og prosessen gjentas på en syklisk måte.

Når alle tre genene settes inn i et plasmid og introduseres i bakterier, Antall negative tilbakemeldingssløyfesykluser som er fullført, kan tjene som en oversikt over hvor mange celledelinger bakteriene har gjennomgått. Hver gang bakteriene deler seg, eventuelle repressorproteiner som er tilstede i cytoplasma, fortynnes, så deres konsentrasjon faller gradvis og utløser uttrykket for det neste proteinet i repressilatorsyklusen. Avgjørende, repressilatorsyklusen gjentas etter 15,5 bakterielle generasjoner uavhengig av hvor raskt eller sakte bakteriene vokser. Dette gjør at den kan fungere som en objektiv måling av tid, omtrent som en klokke eller en klokke.

"Tenk om du hadde to personer på seg to forskjellige klokker, og den andre hånden på en persons klokke beveget seg dobbelt så fort som den andre personens, "forklarte første forfatter David Riglar, Ph.D., en tidligere postdoktor ved Wyss Institute og HMS som nå leder en forskningsgruppe som Sir Henry Dale Fellow ved Imperial College London. "Hvis du stoppet begge klokkene etter en time, de var ikke enige om hva klokken var, fordi måling av tid varierer basert på hastigheten på den andre håndens bevegelse. I motsetning, repressilatoren vår er som en klokke som alltid beveger seg i samme hastighet, så uansett hvor mange forskjellige mennesker som har på seg en, de vil alle gi en konsekvent måling av tid. Denne kvaliteten lar oss mer presist studere oppførselen til bakterier i tarmen. "

Forskerne koblet hvert av de tre repressorproteinene til et fluorescerende molekyl med forskjellige farger, og utviklet en bildebehandlingsflyt kalt RINGS (Repressilator-based Inference of Growth på enkeltcellet nivå) for å spore hvilket protein som uttrykkes på forskjellige tidspunkter under bakteriens vekst. "Når en bakteriekoloni vokser utover, repressilatorkretsen skaper disse forskjellige fluorescerende, tre-ringlignende signaturer basert på hvilket repressorprotein som var aktivt i den enkelte bakterien som startet kolonien, "sa Riglar." Mønsteret til de fluorescerende ringene registrerer hvor mange repressilatorsykluser som har skjedd siden veksten begynte, og vi kan analysere dette mønsteret for å studere hvordan vekstrater varierer mellom forskjellige bakterier og i forskjellige miljøer. "

Bruke RINGER, teamet var i stand til å spore celledelinger i flere forskjellige bakteriearter dyrket in vitro, og observerte at lengden på bakteriens repressilatorsyklus forble konsistent når de ble dyrket på ekstraherte prøver av musetarmen (for å simulere et komplekst mikromiljø) eller utsatt for et antibiotikum (for å simulere stressforhold og inkonsekvente vekstmønstre).

Sporingsendring

For å evaluere repressilatorens ytelse in vivo, teamet administrerte E. coli som inneholder repressilator -kretsen til mus oralt, analyserte deretter bakterier ekstrahert fra fekale prøver. Repressilatoren forble aktiv i opptil 16 dager etter introduksjonen, viser at langsiktig oscillerende genuttrykk kan opprettholdes i tarmbakterier hos levende pattedyr. RINGS -analysen oppdaget endringer i bakterielle vekstmønstre, og bakterier hvis repressilator -kretser var i forskjellige stadier, kunne "synkroniseres" ved å gi musene en forbindelse i drikkevannet som stoppet repressilator -syklusen på et gitt stadium.

Endelig, forskerne testet repressilatorens evne til å oppdage forskjeller i bakterieveksthastigheter som er observert som følge av tarmbetennelse. Mus fikk en betennelsesfremkallende forbindelse, etterfulgt av repressilatorbelastede bakterier. Etter 15 timer, RINGS -analyse viste at bakteriene fra mus med betennelse hadde repressilatorer i et bredere spekter av faser sammenlignet med bakterier fra kontrollmus, antyder at betennelse produserer et miljø som driver inkonsekvenser i bakterievekst, potensielt føre til ubalanser i tarmmikrobiomet.

Denne repressilatoren lar oss virkelig undersøke forviklingene ved bakteriell oppførsel i den levende tarmen, ikke bare i både friske og syke tilstander, men også romlig og tidsmessig. Det faktum at vi kan synkronisere repressilatoren på nytt når den allerede er i tarmen, samt vedlikeholde det uten behov for å administrere selektive antibiotika, betyr også at vi kan studere mikrobiomet i en mer naturlig tilstand med minimal forstyrrelse. "

Pamela Silver, Ph.D., tilsvarende forfatter, Kjernefakultetsmedlem ved Wyss Institute, Elliot T. og Onie H. Adams Professor i biokjemi og systembiologi ved HMS

I tillegg til å forstå dynamikken i mikrobiomet, repressilatoren låser opp potensialet for komplekse, syntetisk-biologi-basert diagnostikk og terapi for menneskets tarm. Potensielle applikasjoner inkluderer opprettelsen av et system som er programmert til å starte en gentranskripsjonskaskade på et bestemt tidspunkt i døgnrytmen, eller en diagnostikk som registrerer hvor mye tid som har gått etter deteksjonen av en gitt biomarkør.

"Denne forskningen løser ikke bare et spesifikt problem knyttet til overvåking av dynamiske endringer i mikrobiomfysiologi i den levende tarmen, det gir en plattform som kan føre til helt nye typer diagnostikk og til og med tidsavhengig terapi. "sa Wyss Founding Director Donald Ingber, M.D., Ph.D., som også er Judah Folkman professor i vaskulær biologi ved HMS og vaskulærbiologiprogrammet ved Boston Children's Hospital, samt professor i bioingeniør ved Harvards John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences.

• Hjerneprotein spiller en fremtredende rolle i vedlikehold av kroniske smerter
• Nytt verktøy registrerer og sporer mikrobiomvekst