Genetische oscillator legt veranderingen vast in groeipatronen van het darmmicrobioom

Ondanks alle aandacht die het menselijk microbioom de afgelopen jaren heeft gekregen, een aspect van dergelijk onderzoek haalt zelden de krantenkoppen:de moeilijkheid om te observeren hoe het in de loop van de tijd verandert als reactie op verschillende stimuli. De meest gebruikelijke analysemethode is het extraheren van bacteriën uit fecale monsters en vervolgens het sequencen van hun genomen, maar deze benadering hoewel minimaal invasief, cruciale informatie verliest over waar en wanneer bacteriële veranderingen in de darm optreden, wetenschappers een onvolledig beeld geven van de dynamiek van het microbioom.

Nutsvoorzieningen, een nieuwe tool gemaakt door onderzoekers van het Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering aan de Harvard University en de Harvard Medical School (HMS) biedt een oplossing voor dit probleem in de vorm van een reeks bacteriële genen die zijn ontwikkeld om veranderingen in de groei van verschillende populaties bacteriën in de loop van de tijd in de ingewanden van levende muizen met eencellige precisie, en kan dienen als platform voor complexe, op synthetische biologie gebaseerde diagnostiek en therapie voor een verscheidenheid aan toepassingen in de darm. De studie is gepubliceerd in Natuurcommunicatie .

Tijd houden

Het systeem maakt gebruik van een oscillerend gencircuit, een repressilator genoemd, als een soort genetische klok om bacteriegroei te meten. De repressilator bestaat uit drie bacteriële genen die coderen voor drie eiwitten (tetR, cl, en lacI), die elk de expressie van een van de andere eiwitten blokkeren. De genen zijn gekoppeld in een negatieve feedbacklus, zodat wanneer de concentratie van een van de repressoreiwitten onder een bepaald niveau daalt, het eiwit dat het onderdrukte, wordt uitgedrukt, die de expressie van het derde eiwit blokkeert, en het proces herhaalt zich op een cyclische manier.

Wanneer alle drie de genen in een plasmide worden ingebracht en in bacteriën worden geïntroduceerd, het aantal voltooide negatieve feedbackluscycli kan dienen als een record van hoeveel celdelingen de bacteriën hebben ondergaan. Elke keer dat de bacteriën zich delen, eventuele repressoreiwitten die in hun cytoplasma aanwezig zijn, worden verdund, dus hun concentratie daalt geleidelijk en triggert de expressie van het volgende eiwit in de repressilatorcyclus. Cruciaal, de repressilatorcyclus herhaalt zich na 15,5 bacteriegeneraties, ongeacht hoe snel of langzaam de bacteriën groeien. Hierdoor kan het fungeren als een objectieve meting van de tijd, net als een klok of een horloge.

"Stel je voor dat twee mensen twee verschillende horloges dragen, en de secondewijzer van de ene persoon bewoog twee keer zo snel als die van de andere persoon, " verklaarde eerste auteur David Riglar, doctoraat, een voormalig postdoc aan het Wyss Institute en HMS die nu een onderzoeksgroep leidt als Sir Henry Dale Fellow aan het Imperial College London. "Als je beide horloges na een uur stopt, ze zouden het niet eens zijn over hoe laat het was, omdat hun meting van tijd varieert op basis van de snelheid van de beweging van de secondewijzer. In tegenstelling tot, onze repressilator is als een horloge dat altijd met dezelfde snelheid beweegt, dus het maakt niet uit hoeveel verschillende mensen er een dragen, ze zullen allemaal een consistente meting van de tijd geven. Deze kwaliteit stelt ons in staat om het gedrag van bacteriën in de darm nauwkeuriger te bestuderen."

De onderzoekers koppelden elk van de drie repressor-eiwitten aan een verschillend gekleurd fluorescerend molecuul, en ontwikkelde een beeldverwerkingsworkflow genaamd RINGS (Repressilator-based Inference of Growth at Single-cell level) om bij te houden welk eiwit op verschillende tijdstippen tijdens de groei van de bacterie tot expressie wordt gebracht. "Als een bacteriekolonie naar buiten groeit, het repressilatorcircuit creëert deze verschillende fluorescerende, boomring-achtige handtekeningen op basis waarvan repressor-eiwit actief was in de enkele bacterie die de kolonie begon, "zei Riglar. "Het patroon van de fluorescerende ringen geeft aan hoeveel cycli van de repressilator zijn opgetreden sinds de groei begon, en we kunnen dat patroon analyseren om te bestuderen hoe groeisnelheden variëren tussen verschillende bacteriën en in verschillende omgevingen."

RINGEN gebruiken, het team was in staat om met succes celdelingen te volgen in verschillende in vitro gekweekte bacteriesoorten, en merkte op dat de lengte van de repressilatorcyclus van de bacteriën consistent bleef wanneer ze werden gekweekt op geëxtraheerde monsters van muizendarm (om een ​​complexe micro-omgeving te simuleren) of blootgesteld aan een antibioticum (om stressomstandigheden en inconsistente groeipatronen te simuleren).

Wijziging bijhouden

Om de prestaties van de repressilator in vivo te evalueren, het team diende oraal E. coli met het repressilatorcircuit toe aan muizen, vervolgens geanalyseerde bacteriën geëxtraheerd uit fecale monsters. De repressilator bleef tot 16 dagen na introductie actief, wat aantoont dat langdurige oscillerende genexpressie kan worden gehandhaafd in darmbacteriën bij levende zoogdieren. De RINGS-analyse detecteerde met succes veranderingen in bacteriële groeipatronen, en bacteriën waarvan de repressilatorcircuits zich in verschillende stadia bevonden, konden worden "gesynchroniseerd" door de muizen een verbinding in hun drinkwater te geven die de repressilatorcyclus in een bepaald stadium stopte.

Eindelijk, de onderzoekers testten het vermogen van de repressilator om verschillen in bacteriële groeisnelheden te detecteren die zijn waargenomen als gevolg van darmontsteking. Muizen kregen een ontstekingsopwekkende stof, gevolgd door met repressilator geladen bacteriën. Na 15 uur, RINGS-analyse toonde aan dat de bacteriën van muizen met ontsteking repressilatoren hadden in een groter aantal fasen in vergelijking met bacteriën van controlemuizen, wat suggereert dat ontsteking een omgeving produceert die inconsistenties in de groei van bacteriën veroorzaakt, mogelijk leidend tot onevenwichtigheden in het darmmicrobioom.

Deze repressilator stelt ons in staat om echt de fijne kneepjes van bacterieel gedrag in de levende darm te onderzoeken, niet alleen in zowel gezonde als zieke toestanden, maar ook ruimtelijk en tijdelijk. Het feit dat we de repressilator opnieuw kunnen synchroniseren als hij al in de darm zit, en het behouden zonder de noodzaak om selectieve antibiotica toe te dienen, betekent ook dat we het microbioom in een meer natuurlijke staat kunnen bestuderen met minimale verstoring."

Pamela Zilver, doctoraat, Corresponderende auteur, Kernfaculteitslid bij het Wyss Institute, Elliot T. en Onie H. Adams hoogleraar biochemie en systeembiologie aan de HMS

Naast het begrijpen van de dynamiek van het microbioom, de repressilator ontsluit het potentieel voor complexe, op synthetische biologie gebaseerde diagnostiek en therapie voor de menselijke darm. Mogelijke toepassingen zijn onder meer het creëren van een systeem dat is geprogrammeerd om op een bepaald punt in het circadiane ritme een gentranscriptiecascade te initiëren, of een diagnose die registreert hoeveel tijd is verstreken na de detectie van een bepaalde biomarker.

"Dit onderzoek lost niet alleen een specifiek probleem op met betrekking tot het monitoren van dynamische veranderingen in de microbioomfysiologie in de levende darm, het biedt een platform dat zou kunnen leiden tot geheel nieuwe soorten diagnostiek en zelfs tijdafhankelijke therapieën", aldus Wyss Founding Director Donald Ingber, MD, doctoraat, die ook de Judah Folkman Professor of Vascular Biology is aan de HMS en het Vascular Biology Program aan het Boston Children's Hospital, evenals hoogleraar bio-engineering aan de John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences van Harvard.

• Herseneiwit speelt een prominente rol bij het in stand houden van chronische pijn
• Nieuwe tool registreert en volgt de groei van het microbioom