Genetischer Oszillator erfasst Veränderungen der Wachstumsmuster des Darmmikrobioms

Bei aller Aufmerksamkeit, die dem menschlichen Mikrobiom in den letzten Jahren zuteil wurde, Ein Aspekt solcher Forschungen macht selten Schlagzeilen:die Schwierigkeit zu beobachten, wie sie sich im Laufe der Zeit als Reaktion auf verschiedene Reize verändert. Die gebräuchlichste Analysemethode ist die Extraktion von Bakterien aus Stuhlproben und die anschließende Sequenzierung ihrer Genome. aber dieser Ansatz während minimal-invasiv, verliert wichtige Informationen darüber, wo und wann bakterielle Veränderungen im Darm auftreten, Wissenschaftlern ein unvollständiges Bild der Dynamik des Mikrobioms zu liefern.

Jetzt, ein neues Tool, das von Forschern des Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering der Harvard University und der Harvard Medical School (HMS) entwickelt wurde, bietet eine Lösung für dieses Problem in Form einer Reihe von bakteriellen Genen, die entwickelt wurden, um Veränderungen im Wachstum verschiedener Bakterienpopulationen im Laufe der Zeit im Darm lebender Mäuse mit Einzelzell-Präzision, und kann als Plattform für komplexe, synthetisch-biologisch basierte Diagnostik und Therapeutika für eine Vielzahl von Anwendungen im Darm. Die Studie ist veröffentlicht in Naturkommunikation .

Zeit halten

Das System verwendet einen oszillierenden Genkreislauf, als Repressilator bezeichnet, als eine Art genetische Uhr zur Messung des Bakterienwachstums. Der Repressilator besteht aus drei bakteriellen Genen, die für drei Proteine ​​kodieren (tetR, kl, und lacI), von denen jedes die Expression eines der anderen Proteine ​​blockiert. Die Gene sind in eine negative Rückkopplungsschleife eingebunden, so dass, wenn die Konzentration eines der Repressorproteine ​​unter einen bestimmten Wert fällt, das Protein, das es unterdrückt hatte, wird exprimiert, welches die Expression des dritten Proteins blockiert, und der Prozess wiederholt sich zyklisch.

Wenn alle drei Gene in ein Plasmid eingefügt und in Bakterien eingeführt werden, Die Anzahl der abgeschlossenen Zyklen der negativen Rückkopplungsschleife kann als Aufzeichnung dienen, wie viele Zellteilungen die Bakterien durchlaufen haben. Jedes Mal, wenn sich die Bakterien teilen, alle in ihrem Zytoplasma vorhandenen Repressorproteine ​​werden verdünnt, so sinkt ihre Konzentration allmählich und löst die Expression des nächsten Proteins im Repressilator-Zyklus aus. Entscheidend, der Repressilatorzyklus wiederholt sich nach 15,5 Bakteriengenerationen, unabhängig davon, wie schnell oder langsam die Bakterien wachsen. Dies ermöglicht es, als objektive Zeitmessung zu fungieren, ähnlich wie eine Uhr oder eine Uhr.

„Stellen Sie sich vor, Sie hätten zwei Leute, die zwei verschiedene Uhren tragen, und der Sekundenzeiger der Uhr einer Person bewegte sich doppelt so schnell wie der der anderen Person, " erklärte Erstautor David Riglar, Ph.D., ein ehemaliger Postdoc am Wyss Institute und HMS, der heute als Sir Henry Dale Fellow am Imperial College London eine Forschungsgruppe leitet. "Wenn Sie beide Uhren nach einer Stunde angehalten haben, Sie waren sich nicht einig, wie spät es war, weil ihre Zeitmessung abhängig von der Geschwindigkeit der Bewegung des Sekundenzeigers variiert. Im Gegensatz, unser Repressilator ist wie eine Uhr, die sich immer mit der gleichen Geschwindigkeit bewegt, Also egal wie viele verschiedene Leute einen tragen, sie alle liefern eine konsistente Zeitmessung. Diese Qualität ermöglicht es uns, das Verhalten von Bakterien im Darm genauer zu studieren."

Die Forscher koppelten jedes der drei Repressorproteine ​​an ein unterschiedlich gefärbtes fluoreszierendes Molekül, und entwickelte einen Bildgebungsworkflow namens RINGS (Repressilator-based Inference of Growth at Single-cell level), um zu verfolgen, welches Protein zu verschiedenen Zeitpunkten während des Bakterienwachstums exprimiert wird. "Wenn eine Bakterienkolonie nach außen wächst, die Repressilatorschaltung erzeugt diese unterschiedlichen fluoreszierenden, baumringartige Signaturen basierend darauf, welches Repressorprotein in dem einzelnen Bakterium aktiv war, das die Kolonie gegründet hat, " sagte Riglar. "Das Muster der fluoreszierenden Ringe zeichnet auf, wie viele Repressilatorzyklen seit Beginn des Wachstums stattgefunden haben. und wir können dieses Muster analysieren, um zu untersuchen, wie die Wachstumsraten zwischen verschiedenen Bakterien und in verschiedenen Umgebungen variieren."

RINGE verwenden, konnte das Team Zellteilungen in mehreren verschiedenen Bakterienarten, die in vitro gezüchtet wurden, erfolgreich verfolgen, und beobachteten, dass die Länge des Repressilatorzyklus der Bakterien konstant blieb, wenn sie auf extrahierten Proben von Mäusedarm gezüchtet wurden (um eine komplexe Mikroumgebung zu simulieren) oder einem Antibiotikum ausgesetzt wurden (um Stressbedingungen und inkonsistente Wachstumsmuster zu simulieren).

Änderung verfolgen

Um die Leistung des Repressilators in vivo zu bewerten, das Team verabreichte Mäusen oral E. coli, das den Repressilatorkreislauf enthielt, dann analysierte Bakterien, die aus Fäkalienproben extrahiert wurden. Der Repressilator blieb bis zu 16 Tage nach der Einführung aktiv, Dies zeigt, dass eine langfristige oszillierende Genexpression in Darmbakterien lebender Säugetiere aufrechterhalten werden könnte. Die RINGS-Analyse hat erfolgreich Veränderungen der bakteriellen Wachstumsmuster nachgewiesen, und Bakterien, deren Repressilatorkreise sich in verschiedenen Stadien befanden, konnten "synchronisiert" werden, indem den Mäusen eine Verbindung in ihrem Trinkwasser gegeben wurde, die den Repressilatorzyklus in einem bestimmten Stadium stoppte.

Schließlich, Die Forscher testeten die Fähigkeit des Repressilators, Unterschiede in den Bakterienwachstumsraten zu erkennen, die als Folge einer Darmentzündung beobachtet wurden. Mäusen wurde eine entzündungsauslösende Verbindung verabreicht, gefolgt von repressilatorbeladenen Bakterien. Nach 15 Stunden, Die RINGS-Analyse zeigte, dass die Bakterien von Mäusen mit Entzündungen Repressilatoren in einem breiteren Spektrum von Phasen aufweisen als Bakterien von Kontrollmäusen. was darauf hindeutet, dass eine Entzündung eine Umgebung erzeugt, die Inkonsistenzen im Bakterienwachstum fördert, Dies kann zu Ungleichgewichten im Darmmikrobiom führen.

Dieser Repressilator ermöglicht es uns, die Feinheiten des bakteriellen Verhaltens im lebenden Darm wirklich zu untersuchen. nicht nur im gesunden und kranken Zustand, aber auch räumlich und zeitlich. Die Tatsache, dass wir den Repressilator neu synchronisieren können, wenn er bereits im Darm ist, sowie die Aufrechterhaltung ohne selektive Antibiotikagabe, bedeutet auch, dass wir das Mikrobiom in einem natürlicheren Zustand mit minimaler Störung studieren können."

Pamela Silber, Ph.D., korrespondierender Autor, Mitglied der Core Faculty am Wyss Institute, Elliot T. und Onie H. Adams Professor für Biochemie und Systembiologie an der HMS

Neben dem Verständnis der Dynamik des Mikrobioms, der Repressilator erschließt das Potenzial für komplexe, synthetisch-biologisch basierte Diagnostik und Therapeutika für den menschlichen Darm. Mögliche Anwendungen umfassen die Schaffung eines Systems, das so programmiert ist, dass es an einem bestimmten Punkt im circadianen Rhythmus eine Gentranskriptionskaskade in Gang setzt, oder eine Diagnose, die aufzeichnet, wie viel Zeit nach der Detektion eines bestimmten Biomarkers verstrichen ist.

„Diese Forschung löst nicht nur ein spezifisches Problem im Zusammenhang mit der Überwachung dynamischer Veränderungen der Mikrobiom-Physiologie im lebenden Darm, Es bietet eine Plattform, die zu völlig neuen Arten von Diagnostik und sogar zeitabhängigen Therapeutika führen könnte", sagte Donald Ingber, Gründungsdirektor von Wyss, M. D., Ph.D., der auch Judah Folkman Professor of Vascular Biology an der HMS und das Vascular Biology Program am Boston Children's Hospital ist, sowie Professor für Bioengineering an der John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences in Harvard.

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