A genetikai oszcillátor rögzíti a bél mikrobioma növekedési mintáinak változásait

Annak a figyelemnek ellenére, amelyet az emberi mikrobióma az elmúlt években kapott, az ilyen kutatások egyik aspektusa ritkán kerül címlapokra:nehéz megfigyelni, hogyan változik az idő múlásával a különböző ingerek hatására. A leggyakoribb elemzési módszer a baktériumok kivonása a székletmintákból, majd azok genomjainak szekvenálása. de ez a megközelítés, miközben minimálisan invazív, elveszíti a legfontosabb információkat arról, hogy hol és mikor fordulnak elő bakteriális elváltozások a bélben, hiányos képet nyújtva a tudósoknak a mikrobióma dinamikájáról.

Most, a Harvard Egyetem és a Harvard Orvostudományi Iskola (HMS) Wyss Biológiailag Inspirált Mérnöki Intézetének kutatói által létrehozott új eszköz megoldást kínál erre a problémára, egy sor bakteriális gén formájában, amelyeket úgy terveztek, hogy észleljék és rögzítsék a különböző baktériumpopulációk növekedése az idő múlásával élő egerek belében, egysejtes pontossággal, és platformként szolgálhat a komplexumokhoz, szintetikus biológián alapuló diagnosztika és terápia a bélrendszer különböző alkalmazásaihoz. A tanulmány közzétételre került Nature Communications .

Az idő megtartása

A rendszer oszcilláló génáramkört használ, elnyomónak nevezik, mint egyfajta genetikai óra a baktériumok szaporodásának mérésére. A represszátor három bakteriális génből áll, amelyek három fehérjét kódolnak (tetR, cl, és laci), amelyek mindegyike blokkolja a másik fehérje egyikének expresszióját. A gének negatív visszacsatolási hurokba kapcsolódnak, úgy, hogy amikor az egyik represszorfehérje koncentrációja egy bizonyos szint alá csökken, az elnyomott fehérje kifejeződik, gátolja a harmadik fehérje expresszióját, és a folyamat ciklikusan megismétlődik.

Amikor mindhárom gént behelyezzük egy plazmidba és bevisszük a baktériumokba, a befejezett negatív visszacsatolási ciklusok száma rekordként szolgálhat a baktériumok hány sejtosztódásán. Minden alkalommal, amikor a baktériumok osztódnak, a citoplazmájukban lévő represszorfehérjék hígulnak, így koncentrációjuk fokozatosan csökken, és kiváltja a következő fehérje expresszióját az elnyomó ciklusban. Lényeges, A represszátor ciklus megismétlődik 15,5 baktériumgeneráció után, függetlenül attól, hogy a baktériumok milyen gyorsan vagy lassan növekednek. Ez lehetővé teszi, hogy objektív időmérőként működjön, mint egy óra vagy egy óra.

"Képzeld el, ha két ember két különböző órát viselne, és az egyik ember órája kétszer olyan gyorsan mozgott, mint a másik, " - magyarázta David Riglar első szerző. Ph.D., a Wyss Intézet és a HMS egykori posztdoktora, aki most kutatócsoportot vezet Sir Henry Dale ösztöndíjasként a londoni Imperial College -ban. "Ha egy óra múlva abbahagyta mindkét órát, nem értenek egyet abban az időben, mert időmérésük a használt kéz mozgásának ütemétől függően változik. Ellentétben, elnyomónk olyan, mint az óra, amely mindig azonos sebességgel mozog, tehát nem számít, hány különböző ember visel egy, mind következetes időmérést adnak. Ez a minőség lehetővé teszi számunkra, hogy pontosabban tanulmányozzuk a baktériumok viselkedését a bélben. "

A kutatók mind a három represszorfehérjét különböző színű fluoreszkáló molekulához kötötték, és kifejlesztett egy képalkotó munkafolyamatot RINGS (Repressilator-based Inference of Growth at Single-cell level) néven, amely nyomon követi, hogy melyik fehérje expresszálódik különböző időpontokban a baktériumok növekedése során. "Ahogy a baktériumtelep kifelé nő, a represszátor áramkör ezeket a különböző fluoreszkáló anyagokat hozza létre, fagyűrűhöz hasonló aláírások, amelyek alapján a represszorfehérje aktív volt a baktériumban, amely elindította a kolóniát, "mondta Riglar." A fluoreszkáló gyűrűk mintázata rögzíti, hogy hány represszió ciklus történt a növekedés kezdete óta, és elemezhetjük ezt a mintát annak tanulmányozására, hogy a növekedési sebesség hogyan változik a különböző baktériumok között és különböző környezetekben. "

A RINGS használatával, a csapat sikeresen nyomon tudta követni a sejtosztódást több különböző in vitro tenyésztett baktériumfajban, és megfigyelték, hogy a baktériumok elnyomó ciklusának hossza változatlan maradt, amikor egérbél kivont mintáin (komplex mikrokörnyezet szimulálása) tenyésztették őket, vagy antibiotikumnak tették ki (stresszviszonyok és következetlen növekedési minták szimulálása).

A változás követése

A represszorátor in vivo teljesítményének értékeléséhez a csapat orálisan adta be az egereknek a represszátor -áramkört tartalmazó E. coli -t, majd a székletmintákból kivont baktériumokat elemezték. A represszátor a bevezetést követően akár 16 napig is aktív maradt, azt mutatják, hogy az élő emlősök bélbaktériumaiban fenntartható a hosszú távú oszcilláló génexpresszió. A RINGS elemzés sikeresen észlelt változásokat a baktériumok növekedési mintáiban, és azokat a baktériumokat, amelyek represszátor -áramkörei különböző szakaszokban voltak, "szinkronizálni" lehetett, ha az egereknek olyan vegyületet adtak az ivóvizükbe, amely leállította a represszátor -ciklust egy adott szakaszban.

Végül, a kutatók tesztelték a represszátor képességét a bélgyulladás következtében észlelt különbségek kimutatására a baktériumok növekedési ütemében. Az egerek gyulladást kiváltó vegyületet kaptak, majd represszátorral töltött baktériumok. 15 óra elteltével, A RINGS elemzés kimutatta, hogy a gyulladásos egerekből származó baktériumok a fázisok szélesebb tartományában represszorátorokat tartalmaztak, mint a kontroll egerekből származó baktériumok, arra utalva, hogy a gyulladás olyan környezetet teremt, amely következetlenségeket okoz a baktériumok növekedésében, potenciálisan egyensúlyhiányhoz vezethet a bél mikrobiómájában.

Ez a represszátor lehetővé teszi számunkra, hogy valóban megvizsgáljuk az élő bélben a baktériumok viselkedésének bonyodalmait, nemcsak egészséges és beteg állapotban, hanem térben és időben is. Az a tény, hogy újra szinkronizálhatjuk a represszort, ha az már a belekben van, valamint fenntartani szelektív antibiotikumok beadása nélkül, ez azt is jelenti, hogy a mikrobiomot természetesebb állapotban, minimális megszakítással tanulmányozhatjuk. "

Pamela Silver, Ph.D., Levelezési cím, A Wyss Intézet fő karának tagja, Elliot T. és Onie H. Adams, a HMS biokémiai és rendszerbiológiai professzora

A mikrobióma dinamikájának megértése mellett az elnyomó felszabadítja a komplexitás lehetőségét, szintetikus-biológiai alapú diagnosztika és terápia az emberi bél számára. A lehetséges alkalmazások közé tartozik egy olyan rendszer létrehozása, amely úgy van programozva, hogy génátírási kaszkádot indítson el a cirkadián ritmus egy bizonyos pontján, vagy diagnosztika, amely rögzíti, hogy mennyi idő telt el az adott biomarker észlelése után.

"Ez a kutatás nemcsak egy speciális problémát old meg, amely a mikrobiom fiziológiájának dinamikus változásainak megfigyelésével kapcsolatos az élő bélben, olyan platformot biztosít, amely teljesen új típusú diagnosztikához és akár időfüggő terápiákhoz is vezethet. "-mondta a Wyss alapító igazgatója, Donald Ingber, M.D., Ph.D., aki a HMS és a Bostoni Gyermekkórház Érbiológiai Programjának Judah Folkman professzora, valamint a Harvard John A. Paulson Műszaki és Alkalmazott Tudományok Egyetemének biomérnöki professzora.

• Az agyfehérje kiemelkedő szerepet játszik a krónikus fájdalom fenntartásában
• Új eszköz rögzíti és követi a mikrobióma növekedését