Genetski oscilator zajema spremembe vzorcev rasti črevesnih mikrobiomov

Kljub vsej pozornosti, ki jo človeški mikrobiom v zadnjih nekaj letih namenja, en vidik takšnih raziskav redko pride na naslovnice:težave pri opazovanju, kako se sčasoma spreminja kot odziv na različne dražljaje. Najpogostejša metoda analize je ekstrakcija bakterij iz fekalnih vzorcev in nato sekvenciranje njihovih genomov, ampak ta pristop, minimalno invazivno, izgubi bistvene informacije o tem, kje in kdaj pride do bakterijskih sprememb v črevesju, ki znanstvenikom ponuja nepopolno sliko o dinamiki mikrobioma.

Zdaj, novo orodje, ki so ga ustvarili raziskovalci na Wyssovem inštitutu za biološko navdihnjeno inženirstvo na univerzi Harvard in Harvard Medical School (HMS), ponuja rešitev tega problema v obliki niza bakterijskih genov, ki so bili zasnovani za zaznavanje in beleženje sprememb v rast različnih populacij bakterij skozi čas v drobovju živih miši z enocelično natančnostjo, in lahko služi kot platforma za zapletene, diagnostiko in terapijo, ki temelji na sintetični biologiji, za različne aplikacije v črevesju. Študija je objavljena leta Nature Communications .

Ohranjanje časa

Sistem uporablja nihajno vezje genov, imenovan represor, kot nekakšna genetska ura za merjenje rasti bakterij. Represivalnik je sestavljen iz treh bakterijskih genov, ki kodirajo tri proteine ​​(tetR, cl, in mlečni), od katerih vsak blokira izražanje enega od drugih proteinov. Geni so povezani v zanko negativnih povratnih informacij, tako da, ko koncentracija enega od proteinskih represorjev pade pod določeno raven, je izražen protein, ki ga je zatiral, ki blokira izražanje tretje beljakovine, in postopek se ciklično ponavlja.

Ko so vsi trije geni vstavljeni v plazmid in vneseni v bakterije, število zaključenih ciklov negativne povratne zanke lahko služi kot zapis, koliko celičnih delitev so bakterije doživele. Vsakič, ko se bakterije razdelijo, so vsi represivni proteini, prisotni v njihovi citoplazmi, razredčeni, zato njihova koncentracija postopoma pada in sproži izražanje naslednje beljakovine v ciklu represivalcev. Bistveno, cikel zatiralcev se ponovi po 15,5 generacijah bakterij, ne glede na to, kako hitro ali počasi bakterije rastejo. To mu omogoča, da deluje kot objektivno merjenje časa, podobno kot ura ali ura.

"Predstavljajte si, če bi imeli dve osebi, ki nosita dve različni uri, in druga roka na uri ene osebe se je gibala dvakrat hitreje kot ura druge osebe, "je pojasnil prvi avtor David Riglar, Doktor znanosti, nekdanji podoktor na Inštitutu Wyss in HMS, ki zdaj vodi raziskovalno skupino kot sodelavec Sir Henry Dale na Imperial College London. "Če ste po eni uri ustavili obe uri, se ne bi strinjali, koliko je ura, ker se njihovo merjenje časa razlikuje glede na hitrost gibanja druge roke. V nasprotju, naš zatiralnik je kot ura, ki se vedno premika z enako hitrostjo, zato ne glede na to, koliko različnih ljudi nosi eno, vsi bodo dosledno merili čas. Ta kakovost nam omogoča natančnejše preučevanje obnašanja bakterij v črevesju. "

Raziskovalci so povezali vsakega od treh represorskih proteinov na različno obarvano fluorescenčno molekulo, in razvil slikovni potek dela, imenovan RINGS (sklepanje rasti na podlagi reprezentativatorjev na enocelični ravni), da bi sledil, kateri protein je izražen v različnih časovnih točkah med rastjo bakterij. "Ko bakterijska kolonija raste navzven, vezje zatiralnika ustvarja te različne fluorescenčne, podpisi, podobni drevesnemu obroču, na podlagi katerih je bil protein represor aktiven v eni sami bakteriji, ki je začela kolonijo, "je dejal Riglar." Vzorec fluorescenčnih obročev beleži, koliko ciklov zatiranja se je zgodilo od začetka rasti, in ta vzorec lahko analiziramo, da preučimo, kako se stopnje rasti razlikujejo med različnimi bakterijami in v različnih okoljih. "

Z uporabo RINGS, ekipa je lahko uspešno sledila delitvam celic pri več različnih bakterijskih vrstah, gojenih in vitro, in opazili, da je dolžina cikla represilatorja bakterij ostala konstantna, ko so bile gojene na ekstrahiranih vzorcih mišjega črevesja (za simulacijo kompleksnega mikrookolja) ali izpostavljene antibiotiku (za simulacijo stresnih razmer in nedoslednih vzorcev rasti).

Spremljanje sprememb

Za oceno učinkovitosti represorja in vivo, ekipa je mišem peroralno dajala E. coli, ki vsebuje represivno vezje, nato analizirali bakterije, ekstrahirane iz vzorcev iztrebkov. Zatiralnik je ostal aktiven do 16 dni po uvedbi, ki kažejo, da bi lahko dolgotrajno nihajočo ekspresijo genov ohranili v črevesnih bakterijah pri živih sesalcih. Analiza RINGS je uspešno zaznala spremembe vzorcev rasti bakterij, in bakterije, katerih vezja zatiralcev so bila v različnih fazah, bi lahko "sinhronizirali" tako, da bi miši dali v svoji pitni vodi spojino, ki je v dani fazi zaustavila cikel zatiralcev.

Končno, raziskovalci so preizkusili sposobnost represivalca, da zazna razlike v stopnjah rasti bakterij, ki so bile opažene kot posledica vnetja črevesja. Miši so dobile spojino, ki povzroča vnetje, sledijo bakterije, naložene z represivalci. Po 15 urah, Analiza RINGS je pokazala, da so imele bakterije miši z vnetjem represivalce v širšem razponu faz v primerjavi z bakterijami iz kontrolnih miši, nakazujejo, da vnetje povzroča okolje, ki povzroča nedoslednosti pri rasti bakterij, potencialno vodi do neravnovesja v črevesnem mikrobiomu.

Ta zatiralnik nam omogoča, da resnično preizkusimo zapletenost bakterijskega vedenja v živem črevesju, ne le v zdravih in obolelih stanjih, ampak tudi prostorsko in časovno. Dejstvo, da lahko represivalnik znova sinhroniziramo, ko je že v črevesju, in ga vzdržujte brez dajanja selektivnih antibiotikov, pomeni tudi, da lahko preučujemo mikrobiom v bolj naravnem stanju z minimalnimi motnjami. "

Pamela srebrna, Doktor znanosti, ustrezni avtor, Osnovni član fakultete na Inštitutu Wyss, Elliot T. in Onie H. Adams profesor biokemije in sistemske biologije na HMS

Poleg razumevanja dinamike mikrobioma, zatiralnik odpira potencial zapletenosti, diagnostika in terapevtika za črevesje, ki temelji na sintetični biologiji. Možne aplikacije vključujejo ustvarjanje sistema, ki je programiran za sprožitev kaskade transkripcije genov na določeni točki cirkadianega ritma, ali diagnostiko, ki beleži, koliko časa je minilo po odkritju danega biomarkerja.

"Ne samo, da ta raziskava rešuje poseben problem, povezan s spremljanjem dinamičnih sprememb v fiziologiji mikrobiomov v živem črevesju, zagotavlja platformo, ki bi lahko vodila do povsem novih vrst diagnostike in celo časovno odvisnih terapij. "je povedal ustanovni direktor Wyss Donald Ingber, M.D., Doktor znanosti, ki je tudi profesor Judah Folkman za vaskularno biologijo na HMS in program za vaskularno biologijo v otroški bolnišnici Boston, pa tudi profesor bioinženiringa na Harvardovi šoli za inženiring in uporabne znanosti John A. Paulson.

• Možganske beljakovine igrajo pomembno vlogo pri vzdrževanju kronične bolečine
• Novo orodje beleži in spremlja rast mikrobiomov