L'oscillatore genetico cattura i cambiamenti nei modelli di crescita del microbioma intestinale

Nonostante tutta l'attenzione che il microbioma umano ha ricevuto negli ultimi anni, un aspetto di tale ricerca raramente fa notizia:la difficoltà di osservare come cambia nel tempo in risposta a vari stimoli. Il metodo di analisi più comune è l'estrazione di batteri da campioni fecali e quindi il sequenziamento dei loro genomi, ma questo approccio, pur essendo minimamente invasivo, perde informazioni cruciali su dove e quando si verificano cambiamenti batterici nell'intestino, fornendo agli scienziati un quadro incompleto delle dinamiche del microbioma.

Ora, un nuovo strumento creato dai ricercatori del Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering dell'Università di Harvard e della Harvard Medical School (HMS) fornisce una soluzione a questo problema sotto forma di un insieme di geni batterici che sono stati progettati per rilevare e registrare i cambiamenti nel crescita di diverse popolazioni di batteri nel tempo nelle viscere dei topi viventi con precisione unicellulare, e può servire come piattaforma per complessi, diagnostici e terapeutici basati sulla biologia sintetica per una varietà di applicazioni nell'intestino. Lo studio è pubblicato su Comunicazioni sulla natura .

Tenere il tempo

Il sistema utilizza un circuito di geni oscillanti, chiamato un repressore, come una sorta di orologio genetico per misurare la crescita batterica. Il repressilatore è costituito da tre geni batterici che codificano per tre proteine ​​(tetR, cl, e lacI), ognuna delle quali blocca l'espressione di una delle altre proteine. I geni sono collegati in un ciclo di feedback negativo, in modo che quando la concentrazione di una delle proteine ​​repressive scende al di sotto di un certo livello, la proteina che aveva represso è espressa, che blocca l'espressione della terza proteina, e il processo si ripete ciclicamente.

Quando tutti e tre i geni vengono inseriti in un plasmide e introdotti nei batteri, il numero di cicli di feedback negativi completati può servire come registrazione di quante divisioni cellulari hanno subito i batteri. Ogni volta che i batteri si dividono, eventuali proteine ​​repressive presenti nel loro citoplasma sono diluite, quindi la loro concentrazione diminuisce gradualmente e innesca l'espressione della prossima proteina nel ciclo repressilatore. In modo cruciale, il ciclo di repressilazione si ripete dopo 15,5 generazioni batteriche, indipendentemente da quanto velocemente o lentamente i batteri crescono. Questo gli permette di agire come una misura oggettiva del tempo, proprio come un orologio o un orologio.

"Immagina di avere due persone che indossano due orologi diversi, e la lancetta dei secondi sull'orologio di una persona si muoveva due volte più veloce di quella dell'altra persona, " ha spiegato il primo autore David Rigar, dottorato di ricerca, un ex postdoc presso il Wyss Institute e HMS che ora guida un gruppo di ricerca come Sir Henry Dale Fellow presso l'Imperial College di Londra. "Se hai fermato entrambi gli orologi dopo un'ora, non sarebbero d'accordo su che ora fosse, perché la loro misurazione del tempo varia in base alla velocità del movimento della lancetta dei secondi. In contrasto, il nostro repressore è come un orologio che si muove sempre alla stessa velocità, quindi non importa quante persone diverse ne indossano uno, daranno tutti una misurazione coerente del tempo. Questa qualità ci consente di studiare in modo più preciso il comportamento dei batteri nell'intestino".

I ricercatori hanno accoppiato ciascuna delle tre proteine ​​repressive a una molecola fluorescente di colore diverso, e ha sviluppato un flusso di lavoro di imaging chiamato RINGS (Repressilator-based Inference of Growth at Single-cell level) per tenere traccia di quale proteina viene espressa in diversi momenti durante la crescita dei batteri. "Quando una colonia batterica cresce verso l'esterno, il circuito di repressilazione crea questi diversi fluorescenti, firme ad anello di albero basate su quale proteina repressore era attiva nel singolo batterio che ha dato origine alla colonia, " ha detto Riglar. "Il modello degli anelli fluorescenti registra quanti cicli di repressilazione si sono verificati dall'inizio della crescita, e possiamo analizzare quel modello per studiare come i tassi di crescita variano tra i diversi batteri e in ambienti diversi".

Usando ANELLI, il team è stato in grado di monitorare con successo le divisioni cellulari in diverse specie batteriche coltivate in vitro, e hanno osservato che la lunghezza del ciclo repressilatore dei batteri è rimasta costante quando sono stati coltivati ​​su campioni estratti di intestino di topo (per simulare un microambiente complesso) o esposti a un antibiotico (per simulare condizioni di stress e modelli di crescita incoerenti).

Tracciamento del cambiamento

Per valutare le prestazioni del repressilatore in vivo, il team ha somministrato E. coli contenente il circuito repressilatore ai topi per via orale, quindi analizzato i batteri estratti da campioni fecali. Il repressilatore è rimasto attivo fino a 16 giorni dopo l'introduzione, mostrando che l'espressione genica oscillatoria a lungo termine potrebbe essere mantenuta nei batteri intestinali dei mammiferi viventi. L'analisi RINGS ha rilevato con successo cambiamenti nei modelli di crescita batterica, e i batteri i cui circuiti repressilatori erano in stadi diversi potevano essere "sincronizzati" somministrando ai topi un composto nella loro acqua potabile che arrestava il ciclo repressilatore in una data fase.

Finalmente, i ricercatori hanno testato la capacità del repressilatore di rilevare le differenze nei tassi di crescita batterica che sono state osservate a causa dell'infiammazione intestinale. Ai topi è stato somministrato un composto che induce l'infiammazione, seguito da batteri carichi di repressilazione. Dopo 15 ore, L'analisi di RINGS ha mostrato che i batteri dei topi con infiammazione avevano repressilatori in una gamma più ampia di fasi rispetto ai batteri dei topi di controllo, suggerendo che l'infiammazione produce un ambiente che guida le incongruenze nella crescita batterica, potenzialmente portando a squilibri nel microbioma intestinale.

Questo repressilatore ci permette di sondare davvero le complessità del comportamento batterico nell'intestino vivente, non solo negli stati sani e malati, ma anche spazialmente e temporalmente. Il fatto che possiamo risincronizzare il repressilatore quando è già nell'intestino, oltre a mantenerlo senza la necessità di somministrare antibiotici selettivi, significa anche che possiamo studiare il microbioma in uno stato più naturale con un'interruzione minima".

Pamela Argento, dottorato di ricerca, autore corrispondente, Membro principale della Facoltà presso il Wyss Institute, Elliot T. e Onie H. Adams Professore di biochimica e biologia dei sistemi presso HMS

Oltre a comprendere le dinamiche del microbioma, il repressilatore sblocca il potenziale per complessi, diagnostiche e terapeutiche basate sulla biologia sintetica per l'intestino umano. Le potenziali applicazioni includono la creazione di un sistema programmato per avviare una cascata di trascrizione genica a un certo punto del ritmo circadiano, o una diagnostica che registra quanto tempo è trascorso dopo il rilevamento di un determinato biomarcatore.

"Non solo questa ricerca risolve un problema specifico relativo al monitoraggio dei cambiamenti dinamici nella fisiologia del microbioma all'interno dell'intestino vivente, fornisce una piattaforma che potrebbe portare a tipi completamente nuovi di diagnostica e persino a terapie dipendenti dal tempo", ha affermato il direttore fondatore di Wyss, Donald Ingber, M.D., dottorato di ricerca, che è anche Judah Folkman Professor of Vascular Biology presso HMS e Vascular Biology Program presso il Boston Children's Hospital, nonché Professore di Bioingegneria presso la John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences di Harvard.

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