Genetski oscilator bilježi promjene u obrascima rasta crijevnih mikrobioma

Uz svu pozornost koju ljudski mikrobiom dobiva posljednjih nekoliko godina, jedan aspekt takvog istraživanja rijetko dolazi na naslovnice:poteškoće promatranja kako se mijenja s vremenom kao odgovor na različite podražaje. Najčešća metoda analize je vađenje bakterija iz fekalnih uzoraka, a zatim sekvenciranje njihovih genoma, ali ovaj pristup, minimalno invazivna, gubi ključne informacije o tome gdje i kada se bakterijske promjene događaju u crijevima, pružajući znanstvenicima nepotpunu sliku o dinamici mikrobioma.

Sada, novi alat koji su stvorili istraživači na Wyss Institutu za biološki nadahnuto inženjerstvo na Sveučilištu Harvard i Harvard Medical School (HMS) pruža rješenje za ovaj problem u obliku skupa bakterijskih gena koji su projektirani za otkrivanje i bilježenje promjena u rast različitih populacija bakterija tijekom vremena u utrobi živih miševa s jednostaničnom preciznošću, i može poslužiti kao platforma za složene, dijagnostiku i terapiju temeljenu na sintetičkoj biologiji za razne primjene u crijevima. Studija je objavljena u Nature Communications .

Čuvanje vremena

Sustav koristi oscilirajući krug gena, naziva se represator, kao svojevrsni genetski sat za mjerenje rasta bakterija. Represival se sastoji od tri bakterijska gena koji kodiraju tri proteina (tetR, cl, i lacI), od kojih svaki blokira ekspresiju jednog od drugih proteina. Geni su povezani u negativnu povratnu spregu, tako da kada koncentracija jednog od proteina represora padne ispod određene razine, izražen je protein koji je potiskivao, koji blokira ekspresiju trećeg proteina, a proces se ponavlja ciklički.

Kad se sva tri gena umetnu u plazmid i uvedu u bakterije, broj završenih ciklusa negativne povratne sprege može poslužiti kao zapis o tome koliko je dioba stanica prošlo bakteriju. Svaki put kad se bakterije podijele, svi proteini represori prisutni u njihovoj citoplazmi su razrijeđeni, pa njihova koncentracija postupno opada i pokreće ekspresiju sljedećeg proteina u ciklusu represivatora. Ključno, ciklus potiskivača ponavlja se nakon 15,5 generacija bakterija, bez obzira na to koliko brzo ili polako bakterije rastu. To mu omogućuje da djeluje kao objektivno mjerenje vremena, slično kao sat ili sat.

"Zamislite da imate dvije osobe koje nose dva različita sata, a druga kazaljka na satu jedne osobe kretala se dvostruko brže od sata druge osobe, "objasnio je prvi autor David Riglar, Dr. Sc., bivši postdoktor na Wyss Institutu i HMS -u koji sada vodi istraživačku skupinu kao stipendist Sir Henry Dalea na Imperial Collegeu u Londonu. "Ako ste zaustavili oba sata nakon jednog sata, ne bi se složili koliko je sati, jer njihovo mjerenje vremena varira ovisno o brzini kretanja druge ruke. U kontrastu, naš represator je poput sata koji se uvijek kreće istom brzinom, pa bez obzira na to koliko različitih ljudi nosi jedno, svi će oni dosljedno mjeriti vrijeme. Ta nam kvaliteta omogućuje preciznije proučavanje ponašanja bakterija u crijevima. "

Istraživači su spojili svaki od tri represorska proteina s različito obojenom fluorescentnom molekulom, i razvio tijek slikanja nazvan RINGS (Zaključak o rastu na temelju reprezentativatora na razini jedne stanice) kako bi pratio koji se protein eksprimira u različitim vremenskim točkama tijekom rasta bakterije. "Kako bakterijska kolonija raste prema van, krug potiskivača stvara ove različite fluorescentne, potpise slične prstenu na temelju kojih je protein represor bio aktivan u jednoj bakteriji koja je započela koloniju, "rekao je Riglar." Uzorak fluorescentnih prstenova bilježi koliko se ciklusa potiskivača dogodilo od početka rasta, i možemo analizirati taj obrazac kako bismo proučili kako se stope rasta razlikuju među različitim bakterijama i u različitim okruženjima. "

Koristeći RINGS, tim je uspio uspješno pratiti diobu stanica u nekoliko različitih vrsta bakterija uzgojenih in vitro, i primijetili da je duljina ciklusa represilatora bakterija ostala dosljedna kada su uzgojene na ekstrahiranim uzorcima crijeva miša (za simulaciju složenog mikro okruženja) ili izložene antibioticima (za simulaciju stresnih uvjeta i nedosljednih obrazaca rasta).

Praćenje promjena

Da biste ocijenili performanse represilatora in vivo, tim je miševima oralno davao E. coli koji sadrži krug represivatora, zatim analizirali bakterije izvađene iz fekalnih uzoraka. Represator je ostao aktivan do 16 dana nakon uvođenja, pokazujući da bi se dugotrajna oscilatorna ekspresija gena mogla održati u crijevnim bakterijama u živih sisavaca. RINGS analiza uspješno je otkrila promjene u obrascima rasta bakterija, i bakterije čiji su krugovi potiskivača bili u različitim fazama mogle bi se "sinkronizirati" davanjem miševima spoja u njihovoj vodi za piće koji je zaustavio ciklus potiskivača u danoj fazi.

Konačno, istraživači su testirali sposobnost represivatora da otkrije razlike u brzinama rasta bakterija koje su uočene kao posljedica upale crijeva. Miševi su dobili spoj koji izaziva upale, nakon čega slijede bakterije napunjene represivatorom. Nakon 15 sati, RINGS analiza pokazala je da su bakterije miševa s upalom imale represivatore u širem rasponu faza u usporedbi s bakterijama iz kontrolnih miševa, sugerirajući da upala stvara okruženje koje pokreće nedosljednosti u rastu bakterija, potencijalno dovodi do neravnoteže u crijevnom mikrobiomu.

Ovaj represator nam omogućuje da stvarno ispitamo zamršenosti ponašanja bakterija u živim crijevima, ne samo u zdravim i bolesnim stanjima, ali i prostorno i vremenski. Činjenica da možemo ponovno sinkronizirati represor kada je već u crijevima, kao i održavati ga bez potrebe za primjenom selektivnih antibiotika, također znači da možemo proučavati mikrobiom u prirodnijem stanju uz minimalne smetnje. "

Pamela Silver, Dr. Sc., Odgovarajući autor, Osnovni član Fakulteta na Wyss Institutu, Elliot T. i Onie H. Adams profesor biokemije i sistemske biologije na HMS -u

Osim razumijevanja dinamike mikrobioma, represor otključava potencijal za složene, dijagnostika i terapija za crijeva temeljena na sintetičkoj biologiji. Potencijalne primjene uključuju stvaranje sustava koji je programiran za pokretanje kaskade transkripcije gena u određenoj točki u cirkadijalnom ritmu, ili dijagnostiku koja bilježi koliko je vremena prošlo nakon otkrivanja danog biomarkera.

"Ovo istraživanje ne samo da rješava određeni problem vezan uz praćenje dinamičkih promjena u fiziologiji mikrobioma unutar živih crijeva, pruža platformu koja bi mogla dovesti do potpuno novih vrsta dijagnostike, pa čak i vremenski ovisnih terapija. "rekao je osnivački direktor Wyssa Donald Ingber, DOKTOR MEDICINE., Dr. Sc., koji je također Judah Folkman profesor vaskularne biologije na HMS -u i programa vaskularne biologije u dječjoj bolnici u Bostonu, kao i profesor bioinženjeringa na Harvardskoj školi inženjeringa i primijenjenih znanosti John A. Paulson.

• Proteini mozga imaju istaknutu ulogu u održavanju kronične boli
• Novi alat bilježi i prati rast mikrobioma