Генетический осциллятор фиксирует изменения в структуре роста микробиома кишечника

Несмотря на все внимание, которое уделялось человеческому микробиому за последние несколько лет, один аспект такого исследования редко попадает в заголовки газет:сложность наблюдения за тем, как он изменяется с течением времени в ответ на различные стимулы. Наиболее распространенный метод анализа - извлечение бактерий из образцов фекалий с последующим секвенированием их геномов. но этот подход, в то время как минимально инвазивный, теряет важную информацию о том, где и когда происходят бактериальные изменения в кишечнике, предоставление ученым неполной картины динамики микробиома.

Теперь, новый инструмент, созданный исследователями из Института биологической инженерии Висса при Гарвардском университете и Гарвардской медицинской школы (HMS), обеспечивает решение этой проблемы в виде набора бактериальных генов, которые были разработаны для обнаружения и регистрации изменений в рост различных популяций бактерий с течением времени в кишечнике живых мышей с точностью до одной клетки, и может служить платформой для сложных, Диагностика и терапия на основе синтетической биологии для различных применений в кишечнике. Исследование опубликовано в Nature Communications .

Удерживая время

В системе используется колебательный генный контур, называется репрессилятором, как своего рода генетические часы для измерения роста бактерий. Репрессилятор состоит из трех бактериальных генов, кодирующих три белка (tetR, cl, и lacI), каждый из которых блокирует экспрессию одного из других белков. Гены связаны в петлю отрицательной обратной связи, так что когда концентрация одного из репрессорных белков падает ниже определенного уровня, белок, который он подавлял, экспрессируется, который блокирует экспрессию третьего белка, и процесс повторяется циклически.

Когда все три гена вставлены в плазмиду и введены в бактерии, количество завершенных циклов отрицательной обратной связи может служить записью того, сколько клеточных делений претерпели бактерии. Каждый раз, когда бактерии делятся, любые репрессорные белки, присутствующие в их цитоплазме, разбавлены, поэтому их концентрация постепенно падает и запускает экспрессию следующего белка в цикле репрессилятора. Крайне важно, цикл репрессилятора повторяется после 15,5 поколений бактерий независимо от того, насколько быстро или медленно бактерии растут. Это позволяет ему действовать как объективное измерение времени, очень похоже на часы или часы.

"Представьте, что у вас есть два человека с двумя разными часами, и секундная стрелка на часах одного человека двигалась в два раза быстрее, чем у другого человека, "объяснил первый автор Дэвид Риглар, Кандидат наук., бывший постдок Института Висса и HMS, который в настоящее время возглавляет исследовательскую группу в качестве научного сотрудника сэра Генри Дейла в Имперском колледже Лондона. "Если вы остановили обе часы через час, они не договорились о том, который час, потому что их измерение времени зависит от скорости движения секундной стрелки. Наоборот, наш репрессилятор похож на часы, которые всегда движутся с одинаковой скоростью, поэтому независимо от того, сколько разных людей носят его, все они будут давать единообразное измерение времени. Это качество позволяет нам более точно изучать поведение бактерий в кишечнике ».

Исследователи соединили каждый из трех репрессорных белков с флуоресцентной молекулой разного цвета. и разработал рабочий процесс визуализации под названием RINGS (вывод о росте на уровне одной клетки на основе репрессилятора), чтобы отслеживать, какой белок экспрессируется в разные моменты времени во время роста бактерий. "По мере того, как бактериальная колония разрастается наружу, схема репрессилятора создает эти различные флуоресцентные, древовидные сигнатуры, основанные на том, какой белок-репрессор был активен в отдельной бактерии, которая начала колонию, - сказал Риглар. - Образец флуоресцентных колец показывает, сколько циклов репрессилятора произошло с момента начала роста, и мы можем проанализировать эту закономерность, чтобы изучить, как скорость роста различается между разными бактериями и в разных средах ».

Используя КОЛЬЦА, команде удалось успешно отследить деления клеток у нескольких различных видов бактерий, выращенных in vitro, и наблюдали, что продолжительность цикла репрессилятора бактерий оставалась постоянной, когда они выращивались на извлеченных образцах кишечника мыши (для моделирования сложной микросреды) или подвергались воздействию антибиотика (для моделирования стрессовых условий и несогласованных моделей роста).

Отслеживание изменений

Чтобы оценить эффективность репрессилятора in vivo, группа перорально вводила мышам E. coli, содержащую цепь репрессилятора, затем проанализировали бактерии, извлеченные из образцов фекалий. Репрессилятор оставался активным до 16 дней после введения. показывая, что долговременная осцилляторная экспрессия генов может поддерживаться в кишечных бактериях у живых млекопитающих. Анализ RINGS успешно обнаружил изменения в структуре роста бактерий, и бактерии, чьи цепи репрессилятора находились на разных стадиях, можно «синхронизировать», дав мышам соединение в их питьевой воде, которое останавливает цикл репрессилятора на данной стадии.

Наконец-то, исследователи проверили способность репрессилятора обнаруживать различия в скорости роста бактерий, которые наблюдались в результате воспаления кишечника. Мышам давали соединение, вызывающее воспаление, затем следуют бактерии, нагруженные репрессиляторами. Через 15 часов Анализ RINGS показал, что бактерии от мышей с воспалением обладали репрессиляторами в более широком диапазоне фаз по сравнению с бактериями от контрольных мышей. предполагая, что воспаление создает среду, которая вызывает несоответствие в росте бактерий, потенциально может привести к дисбалансу микробиома кишечника.

<цитата>

Этот репрессилятор позволяет нам действительно исследовать тонкости поведения бактерий в живом кишечнике, не только в здоровом и больном состоянии, но также пространственно и временно. Тот факт, что мы можем повторно синхронизировать репрессилятор, когда он уже находится в кишечнике, а также поддерживать его без необходимости назначения селективных антибиотиков, также означает, что мы можем изучать микробиом в более естественном состоянии с минимальными нарушениями ".

Памела Сильвер, Кандидат наук., автор-корреспондент, Член основного преподавателя Института Висс, Эллиот Т. и Они Х. Адамс, профессор биохимии и системной биологии в HMS

Помимо понимания динамики микробиома, репрессилятор раскрывает потенциал сложных, диагностика и лечение кишечника человека на основе синтетической биологии. Возможные применения включают создание системы, которая запрограммирована на запуск каскада транскрипции генов в определенный момент циркадного ритма, или диагностику, которая фиксирует, сколько времени прошло после обнаружения данного биомаркера.

«Это исследование не только решает конкретную проблему, связанную с мониторингом динамических изменений физиологии микробиома в живом кишечнике, он предоставляет платформу, которая может привести к совершенно новым типам диагностики и даже к терапевтическим методам, зависящим от времени », - сказал директор-основатель Wyss Дональд Ингбер, Доктор медицины, Кандидат наук., который также является профессором сосудистой биологии Джуды Фолкмана в HMS и программы сосудистой биологии в Бостонской детской больнице, а также профессором биоинженерии Гарвардской школы инженерии и прикладных наук Джона А. Полсона.

• Белок мозга играет важную роль в поддержании хронической боли.
• Новый инструмент регистрирует и отслеживает рост микробиома