Genetinis osciliatorius fiksuoja žarnyno mikrobiomų augimo modelių pokyčius

Visą dėmesį, kurį per pastaruosius kelerius metus sulaukė žmogaus mikrobiomas, vienas tokių tyrimų aspektas retai patenka į antraštes:sunku stebėti, kaip laikui bėgant jis kinta reaguojant į įvairius stimulus. Dažniausias analizės metodas yra bakterijų išskyrimas iš išmatų mėginių ir jų genomų sekos nustatymas, bet šis požiūris, nors ir minimaliai invazinis, praranda svarbią informaciją apie tai, kur ir kada žarnyne atsiranda bakterijų pakitimų, suteikdamas mokslininkams neišsamų mikrobiomos dinamikos vaizdą.

Dabar, naujas įrankis, sukurtas Harvardo universiteto Wyss biologinio įkvėpimo inžinerijos instituto ir Harvardo medicinos mokyklos (HMS) mokslininkų, pateikia šios problemos sprendimą, sukurdamas bakterijų genų rinkinį, sukurtą aptikti ir užregistruoti skirtingų bakterijų populiacijų augimas laikui bėgant gyvų pelių žarnyne vienaląsčių tikslumu, ir gali būti platforma sudėtingiems, sintetine biologija pagrįsta diagnostika ir terapija įvairioms žarnyno reikmėms. Tyrimas paskelbtas Gamtos komunikacijos .

Laiko laikymas

Sistema naudoja svyruojančią genų grandinę, vadinamas represoriumi, kaip tam tikras genetinis laikrodis bakterijų augimui matuoti. Represiliatorių sudaro trys bakteriniai genai, koduojantys tris baltymus (tetR, cl, ir lacI), kurių kiekvienas blokuoja vieno iš kitų baltymų ekspresiją. Genai yra susieti su neigiamo grįžtamojo ryšio ciklu, kad kai vieno iš represorių baltymų koncentracija nukris žemiau tam tikro lygio, išreiškiamas baltymas, kurį jis slopino, kuris blokuoja trečiojo baltymo ekspresiją, ir procesas kartojasi cikliškai.

Kai visi trys genai įterpiami į plazmidę ir įvedami į bakterijas, įvykdytų neigiamų grįžtamojo ryšio ciklų skaičius gali būti įrašas, kiek bakterijų dalijosi ląstelių. Kiekvieną kartą, kai bakterijos dalijasi, visi jų citoplazmoje esantys represiniai baltymai yra atskiesti, todėl jų koncentracija palaipsniui mažėja ir sukelia kito baltymo ekspresiją represorių cikle. Svarbiausia, represinis ciklas kartojasi po 15,5 bakterijų kartos, neatsižvelgiant į tai, kaip greitai ar lėtai bakterijos auga. Tai leidžia veikti kaip objektyvus laiko matavimas, panašiai kaip laikrodis ar laikrodis.

„Įsivaizduokite, jei du žmonės nešioja du skirtingus laikrodžius, o vieno žmogaus laikrodžio ranka judėjo dvigubai greičiau nei kito žmogaus, “, - paaiškino pirmasis autorius Davidas Riglaras. Daktaras, buvęs Wyss instituto ir HMS postdoktorantas, dabar vadovauja tyrėjų grupei kaip seras Henry Dale'o bendradarbis Londono imperatoriškame koledže. „Jei po valandos sustabdytumėte abu laikrodžius, jie nesutarė, koks buvo laikas, nes jų laiko matavimas kinta priklausomai nuo sekundės judėjimo greičio. Priešingai, mūsų represorius yra kaip laikrodis, kuris visada juda tuo pačiu greičiu, Taigi nesvarbu, kiek skirtingų žmonių dėvi vieną, visi jie nuosekliai matuos laiką. Ši kokybė leidžia tiksliau ištirti bakterijų elgesį žarnyne “.

Tyrėjai sujungė kiekvieną iš trijų represorių baltymų į skirtingos spalvos fluorescencinę molekulę, ir sukūrė vaizdo gavimo darbo eigą, vadinamą RINGS (Repressilator-based Inference of Growth at Single-cell level), kad būtų galima stebėti, kuris baltymas yra išreikštas skirtingais bakterijų augimo laiko momentais. „Kai bakterijų kolonija auga į išorę, represoriaus grandinė sukuria šias skirtingas fluorescencines, medžio žiedo pavidalo parašai, pagal kuriuos represinis baltymas buvo aktyvus vienoje koloniją pradėjusioje bakterijoje, "sakė Riglaras." Fluorescencinių žiedų modelis užfiksuoja, kiek represijų ciklų įvyko nuo augimo pradžios, ir mes galime išanalizuoti šį modelį, kad ištirtume, kaip augimo greitis skiriasi tarp skirtingų bakterijų ir skirtingose ​​aplinkose. "

Naudojant RINGS, komanda sugebėjo sėkmingai sekti ląstelių dalijimąsi keliose skirtingose ​​bakterijų rūšyse, auginamose in vitro, ir pastebėjo, kad bakterijų represorių ciklo trukmė išliko pastovi, kai jos buvo auginamos ant ekstrahuotų pelių žarnyno mėginių (imituojant sudėtingą mikroaplinką) arba veikiant antibiotikui (siekiant imituoti streso sąlygas ir nenuoseklius augimo modelius).

Pokyčių stebėjimas

Norėdami įvertinti represoriaus veikimą in vivo, komanda pelėms per burną skyrė E. coli, turinčią represoriaus grandinę, tada išanalizavo bakterijas, išgautas iš išmatų mėginių. Represiliatorius išliko aktyvus iki 16 dienų po įvedimo, rodo, kad gyvų žinduolių žarnyno bakterijose gali būti išlaikyta ilgalaikė svyruojanti genų ekspresija. RINGS analizė sėkmingai nustatė bakterijų augimo modelių pokyčius, ir bakterijos, kurių represorių grandinės buvo skirtingose ​​stadijose, galėjo būti „sinchronizuotos“, duodant pelėms geriamajame vandenyje junginį, kuris tam tikrame etape sustabdė represorių ciklą.

Pagaliau, tyrėjai išbandė represoriaus gebėjimą aptikti bakterijų augimo greičio skirtumus, pastebėtus dėl žarnyno uždegimo. Pelės gavo uždegimą sukeliantį junginį, po to bakterijos, pakrautos represoriais. Po 15 valandų, RINGS analizė parodė, kad pelių, sergančių uždegimu, bakterijos turėjo represorius įvairiose fazėse, palyginti su kontrolinių pelių bakterijomis, rodo, kad uždegimas sukuria aplinką, kuri skatina bakterijų augimo nenuoseklumą, gali sukelti žarnyno mikrobiomo disbalansą.

Šis represorius leidžia mums ištirti bakterijų elgesio gyvojoje žarnoje subtilybes, ne tik sveikų, bet ir sergančių, bet ir erdviniu bei laiko atžvilgiu. Tai, kad mes galime iš naujo sinchronizuoti represorių, kai jis jau yra žarnyne, taip pat išlaikyti jį be būtinybės skirti selektyvių antibiotikų, taip pat reiškia, kad galime tirti mikrobiomą natūralesnėje būsenoje su minimaliais sutrikimais “.

Pamela Silver, Daktaras, Autorius susirašinėjimui, Wyss instituto pagrindinis fakulteto narys, Elliot T. ir Onie H. Adams HMS biochemijos ir sistemų biologijos profesorius

Be to, kad suprastumėte mikrobiomo dinamiką, represorius atveria komplekso potencialą, sintetine biologija pagrįsta žmogaus žarnyno diagnostika ir terapija. Galimos programos apima sistemos, užprogramuotos inicijuoti genų transkripcijos kaskadą tam tikrame cirkadinio ritmo taške, sukūrimą, arba diagnostika, kuri fiksuoja, kiek laiko praėjo po tam tikro biomarkerio aptikimo.

"Šis tyrimas ne tik išsprendžia konkrečią problemą, susijusią su dinamiškų mikrobiomų fiziologijos pokyčių stebėjimu gyvoje žarnoje, ji suteikia platformą, kuri galėtų paskatinti visiškai naujas diagnostikos rūšis ir net nuo laiko priklausomą terapiją “,-sakė„ Wyss “įkūrėjas Donaldas Ingberis, M. D., Daktaras, kuris taip pat yra Judah Folkman kraujagyslių biologijos profesorius HMS ir kraujagyslių biologijos programoje Bostono vaikų ligoninėje, taip pat Harvardo John A. Paulson inžinerijos ir taikomųjų mokslų mokyklos bioinžinerijos profesorius.

• Smegenų baltymai vaidina svarbų vaidmenį palaikant lėtinį skausmą
• Nauji įrankiai įrašo ir seka mikrobiomų augimą