Geneettinen oskillaattori tallentaa muutokset suoliston mikrobiomien kasvumalleihin

Kaikesta huomiosta, jonka ihmisen mikrobiomi on saanut viime vuosina, yksi tällaisen tutkimuksen osa tulee harvoin otsikoihin:vaikeus seurata, miten se muuttuu ajan myötä eri ärsykkeiden vaikutuksesta. Yleisin analyysimenetelmä on bakteerien ottaminen ulosteenäytteistä ja niiden genomien sekvensointi, mutta tämä lähestymistapa, samalla kun se on minimaalisesti invasiivinen, menettää tärkeitä tietoja siitä, missä ja milloin bakteerimuutoksia tapahtuu suolistossa, antaa tutkijoille epätäydellisen kuvan mikrobiomin dynamiikasta.

Nyt, uusi työkalu, jonka ovat luoneet Harvardin yliopiston Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering -instituutti ja Harvard Medical School (HMS), tarjoaa ratkaisun tähän ongelmaan bakteerigeenien muodossa, jotka on suunniteltu havaitsemaan ja tallentamaan eri bakteeripopulaatioiden kasvu ajan mittaan elävien hiirten suolistossa yksisoluisella tarkkuudella, ja voi toimia alustana monimutkaisille, synteettiseen biologiaan perustuvaa diagnostiikkaa ja hoitoa erilaisiin suolistosovelluksiin. Tutkimus on julkaistu vuonna Luonnonviestintä .

Ajan pitäminen

Järjestelmä käyttää värähtelevää geenipiiriä, kutsutaan repressoijaksi, eräänlaisena geneettisenä kellona, ​​joka mittaa bakteerien kasvua. Repressilaattori koostuu kolmesta bakteerigeenistä, jotka koodaavat kolmea proteiinia (tetR, cl, ja lacI), joista jokainen estää jonkin muun proteiinin ilmentymisen. Geenit on liitetty negatiiviseen palautesilmukkaan, niin että kun yhden repressoriproteiinin pitoisuus laskee tietyn tason alapuolelle, proteiini, jota se oli tukahduttanut, ilmaistaan, joka estää kolmannen proteiinin ilmentymisen, ja prosessi toistuu syklisesti.

Kun kaikki kolme geeniä insertoidaan plasmidiin ja viedään bakteereihin, suoritettujen negatiivisen palautesilmukan jaksojen määrä voi toimia ennätyksenä siitä, kuinka monta solujakautumista bakteerit ovat tehneet. Aina kun bakteerit jakautuvat, kaikki niiden sytoplasmassa olevat repressoriproteiinit laimennetaan, joten niiden pitoisuus laskee vähitellen ja laukaisee seuraavan proteiinin ilmentymisen repressilaattorisyklissä. Olennaista on, Repressilaattorisykli toistuu 15,5 bakteeripolven jälkeen riippumatta siitä, kuinka nopeasti tai hitaasti bakteerit kasvavat. Sen avulla se voi toimia objektiivisena ajan mittauksena, kuin kello tai kello.

"Kuvittele, jos sinulla olisi kaksi ihmistä, joilla olisi kaksi eri kelloa, ja toisen käden toinen käsi liikkui kaksi kertaa nopeammin kuin toisen henkilö, "selitti ensimmäinen kirjoittaja David Riglar, Ph.D., entinen tohtori Wyss -instituutissa ja HMS:ssä, joka nyt johtaa tutkimusryhmää Sir Henry Dale -apulaisena Lontoon Imperial Collegessa. "Jos lopetit molemmat kellot tunnin kuluttua, he eivät olleet samaa mieltä siitä, mikä aika oli, koska niiden ajan mittaus vaihtelee toisen käden liikkeen nopeuden mukaan. Verrattuna, Repressilaattorimme on kuin kello, joka liikkuu aina samalla nopeudella, niin riippumatta siitä, kuinka monella eri ihmisellä on yllään yksi, ne kaikki mittaavat ajan johdonmukaisesti. Tämän laadun avulla voimme tutkia tarkemmin bakteerien käyttäytymistä suolistossa. "

Tutkijat yhdensivät kukin kolmesta repressoriproteiinista eriväriseen fluoresoivaan molekyyliin, ja kehitti kuvantamisen työnkulun nimeltä RINGS (Repressilator-based Inference of Growth at Single-cell level), jotta voidaan seurata, mikä proteiini ilmentyy eri ajankohtina bakteerien kasvun aikana. "Kun bakteeripesäke kasvaa ulospäin, repressilaattoripiiri luo nämä erilaiset loisteputket, puunrenkaan kaltaiset allekirjoitukset, joiden perusteella repressoriproteiini oli aktiivinen yksittäisessä bakteerissa, joka aloitti pesäkkeen, "sanoi Riglar." Fluoresoivien renkaiden kuvio tallentaa kuinka monta repressilaattorisykliä on tapahtunut kasvun alkamisen jälkeen, ja voimme analysoida tätä mallia tutkiaksemme, kuinka kasvunopeudet vaihtelevat eri bakteerien välillä ja eri ympäristöissä. "

Sormuksia käyttämällä, tiimi pystyi seuraamaan onnistuneesti solujakautumista useissa eri in vitro kasvatetuissa bakteerilajeissa, ja havaitsi, että bakteerien repressilaattorisyklin pituus pysyi vakiona, kun niitä kasvatettiin hiiren suolen uutetuista näytteistä (monimutkaisen mikroympäristön simuloimiseksi) tai altistettiin antibiootille (stressiolosuhteiden ja epäjohdonmukaisten kasvumallien simuloimiseksi).

Muutoksen seuranta

Repressilaattorin suorituskyvyn arvioimiseksi in vivo ryhmä antoi hiirille oraalisesti E. colia, joka sisälsi repressilaattoripiirin, sitten analysoitiin ulosteenäytteistä uutetut bakteerit. Repressilaattori pysyi aktiivisena jopa 16 päivää käyttöönoton jälkeen, osoittaa, että pitkäaikainen värähtelevä geeniekspressio voitaisiin säilyttää suoliston bakteereissa elävissä nisäkkäissä. RINGS -analyysi havaitsi onnistuneesti muutokset bakteerien kasvumalleissa, ja bakteerit, joiden repressilaattoripiirit olivat eri vaiheissa, voitaisiin "synkronoida" antamalla hiirille juomavedessään yhdiste, joka pysäytti repressilaattorisyklin tietyssä vaiheessa.

Lopuksi, tutkijat testasivat repressilaattorin kykyä havaita bakteerien kasvunopeuksien erot, joita on havaittu suoliston tulehduksen seurauksena. Hiirille annettiin tulehdusta aiheuttava yhdiste, jota seuraa repressilaattorilla ladatut bakteerit. 15 tunnin kuluttua RINGS -analyysi osoitti, että tulehdusta saaneiden hiirten bakteereilla oli repressilaattoreita laajemmalla faasialueella verrattuna kontrollihiirien bakteereihin, viittaa siihen, että tulehdus luo ympäristön, joka johtaa epäjohdonmukaisuuksiin bakteerien kasvussa, voi johtaa epätasapainoon suoliston mikrobiomissa.

Tämän repressilaattorin avulla voimme todella tutkia elävän suolen bakteerikäyttäytymisen monimutkaisuutta, ei vain terveissä ja sairaissa tiloissa, mutta myös alueellisesti ja ajallisesti. Se, että voimme synkronoida repressilaattorin uudelleen, kun se on jo suolistossa, sekä ylläpitää sitä ilman tarvetta antaa valikoivia antibiootteja, tarkoittaa myös sitä, että voimme tutkia mikrobiomia luonnollisemmassa tilassa minimaalisilla häiriöillä. "

Pamela Silver, Ph.D., vastaava kirjoittaja, Wyss -instituutin ydin tiedekunnan jäsen, Elliot T. ja Onie H. Adams, biokemian ja systeemibiologian professori, HMS

Mikrobiomin dynamiikan ymmärtämisen lisäksi repressilaattori avaa mahdollisuuden monimutkaisiin, synteettiseen biologiaan perustuva diagnoosi ja hoito ihmisen suolistolle. Mahdollisia sovelluksia ovat järjestelmän luominen, joka on ohjelmoitu käynnistämään geenin transkription kaskadi tietyssä vuorokausirytmin kohdassa, tai diagnostiikka, joka tallentaa, kuinka kauan tietyn biomarkkerin havaitsemisesta on kulunut.

"Tämä tutkimus ei ainoastaan ​​ratkaise erityistä ongelmaa, joka liittyy mikrobiomifysiologian dynaamisten muutosten seurantaan elävässä suolessa, se tarjoaa alustan, joka voi johtaa täysin uusiin diagnostiikkatyyppeihin ja jopa ajasta riippuvaisiin hoitoihin ", Wyssin perustajajohtaja Donald Ingber sanoi. M.D., Ph.D., joka on myös juutalainen kansanmies, vaskulaaribiologian professori HMS:ssä ja vaskulaaribiologian ohjelma Bostonin lastensairaalassa, sekä biotekniikan professori Harvardin John A.Paulsonin teknillisessä ja ammattikorkeakoulussa.

• Aivoproteiinilla on merkittävä rooli kroonisen kivun ylläpitämisessä
• Uusi työkalu tallentaa ja seuraa mikrobiomien kasvua