Nytt CRISPR-baserat diagnostiskt test upptäcker COVID-19-varianter från salivprover

Med Delta-varianten som härjar på ovaccinerade populationer och covid-19-fall som sprider sig runt om i världen, pandemin är långt ifrån över. Trots den imponerande snabba utvecklingen av SARS-CoV-2 diagnostiska test under det senaste ett och ett halvt året, de allra flesta patientproven måste fortfarande skickas till ett laboratorium för behandling, vilket saktar ner hastigheten på spårning av covid-19-fall. Om ett prov ska testas för en specifik variant av viruset, det måste genetiskt sekvenseras, vilket tar ännu mer tid och resurser.

Nu, forskare vid Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering vid Harvard University, Massachusetts Institute of Technology (MIT), och flera sjukhus i Boston-området har skapat en billig, CRISPR-baserat diagnostiskt test som tillåter användare att testa sig själva för SARS-CoV-2 och flera varianter av viruset med hjälp av ett prov av deras saliv hemma, utan extra instrumentering.

Diagnosanordningen, kallad Minimally Instrumented SHERLOCK (miSHERLOCK), är lätt att använda och ger resultat som kan läsas och verifieras av en medföljande smartphone -app inom en timme. Det skilde framgångsrikt mellan tre olika varianter av SARS-CoV-2 i experiment, och kan snabbt omkonfigureras för att upptäcka ytterligare varianter som Delta. Enheten kan monteras med en 3D -skrivare och vanligt tillgängliga komponenter för cirka $ 15, och återanvändning av hårdvaran minskar kostnaden för individuella analyser till $ 6 vardera.

miSHERLOCK eliminerar behovet av att transportera patientprover till en centraliserad testplats och förenklar provberedningsstegen avsevärt, ger patienter och läkare en snabbare, mer exakt bild av individens och samhällets hälsa, vilket är kritiskt under en pandemi som utvecklas. "

Helena de Puig, Ph.D., Förste författare, Postdoktor, Wyss Institute och MIT

Diagnosanordningen beskrivs i en artikel publicerad idag Vetenskapliga framsteg .

Från leveranskedjan till SHERLOCK

Som instruktör i pediatrik vid Boston Children's Hospital med specialisering i infektionssjukdomar, medförfattare Rose Lee, M.D. har arbetat med frontlinjen för COVID-19-pandemin i över ett år. Hennes erfarenheter på kliniken gav inspiration till projektet som i slutändan skulle bli miSHERLOCK.

"Enkla saker som tidigare var allestädes närvarande på sjukhuset, som nasofarynxpinnar, plötsligt var det svårt att få så rutinmässiga provbehandlingsprocedurer stördes, vilket är ett stort problem i en pandemisk miljö, "sa Lee, som också är Visiting Fellow vid Wyss Institute. "Vårt teams motivation för detta projekt var att eliminera dessa flaskhalsar och tillhandahålla korrekt diagnostik för COVID-19 med mindre beroende av globala leveranskedjor, och kunde också exakt upptäcka de varianter som började dyka upp. "

För detektionen SARS-CoV-2 i deras diagnos, gruppen vände sig till en CRISPR-baserad teknik skapad i labbet av Wyss Core Faculty-medlem och senior pappersförfattare Jim Collins, Ph.D. kallas "specifik högkänslig enzymatisk reporterupplåsning" (SHERLOCK). SHERLOCK använder CRISPR:s "molekylsax" för att klippa DNA eller RNA på specifika platser, med en extra bonus:denna specifika typ av sax skär också andra bitar av DNA i det omgivande området, så att den kan konstrueras med nukleinsyrasondmolekyler för att producera en signal som indikerar att målet har skurits framgångsrikt.

Forskarna skapade en SHERLOCK-reaktion avsedd att skära SARS-CoV-2 RNA vid en specifik region av en gen som kallas nukleoprotein som är bevarad över flera varianter av viruset. När molekylsaxen - ett enzym som heter Cas12a - framgångsrikt binder till och skär av nukleoproteingenen, enkelsträngade DNA-sonder sonderas också, producerar en fluorescerande signal. De skapade också ytterligare SHERLOCK-analyser utformade för att rikta in sig på en panel av virala mutationer i Spike-proteinsekvenser som representerar tre genetiska SARS-CoV-2-varianter:Alpha, Beta, och Gamma.

Beväpnad med analyser som på ett tillförlitligt sätt kan detektera viralt RNA inom det accepterade koncentrationsområdet för FDA-godkända diagnostiska tester, laget fokuserade sedan sina ansträngningar på att lösa det som utan tvekan är den svåraste utmaningen inom diagnostik:provberedning.

Spotta, vänta, skanna

"När du testar ett prov för nukleinsyror [som DNA eller RNA], det finns många steg du behöver göra för att förbereda provet så att du faktiskt kan extrahera och förstärka dessa nukleinsyror. Du måste skydda provet medan det transiteras till testanläggningen, och se också till att det inte är smittsamt om du har att göra med en smittsam sjukdom. För att göra detta till ett riktigt lättanvänt diagnostiskt test, det var viktigt för oss att förenkla det så mycket som möjligt, "sa den första författaren Xiao Tan, M.D., Ph.D., en klinisk stipendiat vid Wyss Institute och Instructor of Medicine in Gastroenterology på Massachusetts General Hospital.

Teamet valde att använda saliv snarare än nasofaryngealt provtagningsprov som sin insamlingsmetod, eftersom det är lättare för användare att samla saliv och studier har visat att SARS-CoV-2 kan detekteras i saliv ett större antal dagar efter infektion. Men obearbetad saliv utgör sina egna utmaningar:den innehåller enzymer som bryter ned olika molekyler, producerar en hög andel falska positiva.

Forskarna utvecklade en ny teknik för att lösa det problemet. Först, de tillsatte två kemikalier som kallas DTT och EGTA till saliv och värmde provet till 95 ° C i 3 minuter, vilket eliminerade den falskt positiva signalen från den obehandlade saliven och skivade upp eventuella viruspartiklar. De införlivade sedan ett poröst membran som konstruerades för att fånga RNA på dess yta, som slutligen kunde läggas direkt till SHERLOCK -reaktionen för att generera ett resultat.

För att integrera salivprovförberedelsen och SHERLOCK -reaktionen i en diagnos, laget utformade en enkel batteridriven enhet med två kammare:en uppvärmd provkammare, och en ouppvärmd reaktionskammare. En användare spottar i provförberedelsekammaren, slår på värmen, och väntar tre till sex minuter på att saliven ska vara ond i filtret. Användaren tar bort filtret och överför det till reaktionskammarkolonnen, skjuter sedan en kolv som avsätter filtret i kammaren och punkterar en vattenbehållare för att aktivera SHERLOCK -reaktionen. 55 minuter senare, användaren tittar genom det tonade transilluminatorfönstret in i reaktionskammaren och bekräftar närvaron av en fluorescerande signal. De kan också använda en medföljande smartphone -app som analyserar pixlarna som registreras av smarttelefonens kamera för att ge en tydlig positiv eller negativ diagnos.

Forskarna testade sin diagnostiska enhet med hjälp av kliniska salivprover från 27 COVID-19-patienter och 21 friska patienter, och fann att miSHERLOCK korrekt identifierade COVID-19-positiva patienter 96% av tiden och patienter utan sjukdomen 95% av tiden. De testade också dess prestanda mot Alpha, Beta, och Gamma SARS-CoV-2-varianter genom att öka frisk människosaliv med syntetiskt viralt RNA i full längd som innehåller mutationer som representerar varje variant, och fann att anordningen var effektiv över en rad virala RNA -koncentrationer.

"En av de stora sakerna med miSHERLOCK är att den är helt modulär. Själva enheten är separat från analyserna, så att du kan koppla in olika analyser för den specifika sekvensen av RNA eller DNA som du försöker upptäcka, "sa den första författaren Devora Najjar, forskningsassistent vid MIT Media Lab och i Collins Lab. "Enheten kostar cirka $ 15, men massproduktion skulle minska bostäderna till cirka 3 dollar. Analyser för nya mål kan skapas på ungefär två veckor, möjliggör en snabb utveckling av tester för nya varianter av COVID-19 och andra sjukdomar. "

Redo för den verkliga världen

MiSHERLOCK-teamet skapade sin enhet med låga resursinställningar i åtanke, eftersom pandemin har avslöjat de stora ojämlikheterna inom tillgång till sjukvård som finns mellan olika delar av världen. Enhetens hårdvara kan byggas av alla som har tillgång till en 3D -skrivare, och filerna och kretsdesignerna är alla offentligt tillgängliga online. Tillägget av en smartphone-app var också inriktat på resursbegränsade inställningar, eftersom mobiltelefontjänsten är tillgänglig nästan var som helst i världen, även i områden som är svåra att nå till fots. Teamet är ivrigt att arbeta med tillverkare som är intresserade av att producera miSHERLOCK i stor skala för global distribution.

"När miSHERLOCK -projektet startade, det hände nästan ingen SARS-CoV-2-variantövervakning. Vi visste att variantspårning kommer att bli otroligt viktigt när vi utvärderar de långsiktiga effekterna av COVID-19 på lokala och globala samhällen, så vi pressade oss själva för att skapa en verkligt decentraliserad, flexibel, användarvänlig diagnostisk plattform, "sa Collins, som också är termeerprofessor i medicinsk teknik och vetenskap vid MIT. "Genom att lösa provförberedelseproblemet, vi har säkerställt att denna enhet är praktiskt taget redo för konsumenter att använda som den är, och vi är glada över att arbeta med industriella partner för att göra det kommersiellt tillgängligt. "

"Genom att kombinera banbrytande bioteknik med billiga material, detta team har skapat en kraftfull diagnostisk enhet som kan tillverkas och användas på lokal nivå av personer utan avancerade medicinska examina. Det är ett perfekt exempel på Wyss-institutets uppdrag:att lägga livsförändrande innovationer i händerna på människor som behöver dem, "sade Wyss grundande direktör Don Ingber, M.D., Ph.D., som också är Judah Folkman professor i kärlbiologi vid Harvard Medical School och Boston Children's Hospital, och professor i bioingenjör vid Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences.

• Ny bordsskiva kan snabbt upptäcka SARS-CoV-2 från salivprover
• Mobilt interventionellt stroke -team reser till patienter för att ge snabbare tillgång till kirurgisk behandling