Novi dijagnostički test temeljen na CRISPR-u otkriva varijante COVID-19 iz uzoraka sline

miSHERLOCK eliminira potrebu transporta uzoraka pacijenata na centralizirano mjesto testiranja i uvelike pojednostavljuje korake pripreme uzoraka, brže davanje pacijenata i liječnika, točniju sliku zdravlja pojedinca i zajednice, što je kritično tijekom evoluirajuće pandemije. "

Helena de Puig, Dr. Sc., Jedan od prvih autora, Postdoktorand, Wyss instituta i MIT -a

Dijagnostički uređaj opisan je u radu objavljenom danas u Znanstveni napredak .

Od lanca opskrbe do SHERLOCK -a

Kao instruktor pedijatrije u dječjoj bolnici u Bostonu sa specijalizacijom iz zaraznih bolesti, jedna od prvih autorica Rose Lee, M.D. radi na prvim linijama pandemije COVID-19 više od godinu dana. Njezino iskustvo u klinici dalo je inspiraciju za projekt koji će na kraju postati miSHERLOCK.

"Jednostavne stvari koje su bile sveprisutne u bolnici, poput briseva iz nazofarinksa, odjednom ih je bilo teško dobiti, pa su poremećeni rutinski postupci obrade uzoraka, što je veliki problem u okruženju pandemije, "rekao je Lee, koji je također gostujući suradnik na Wyss Institutu. "Motivacija našeg tima za ovaj projekt bila je ukloniti ta uska grla i pružiti točnu dijagnostiku za COVID-19 uz manje oslanjanje na globalne opskrbne lance, a također je mogao točno otkriti varijante koje su se počele pojavljivati. "

Za dio otkrivanja SARS-CoV-2 njihove dijagnostike, grupa se okrenula tehnologiji temeljenoj na CRISPR-u nastaloj u laboratoriju člana Wyss Core fakulteta i višeg autora radova Jima Collinsa, Dr. Sc. nazvano "specifično enzimatsko reportersko otključavanje visoke osjetljivosti" (SHERLOCK). SHERLOCK koristi CRISPR -ove "molekularne škare" za izrezivanje DNA ili RNA na određenim mjestima, s dodatnim bonusom:ova specifična vrsta škara reže i druge dijelove DNK u okolici, omogućujući joj da se konstruira pomoću molekula sonde nukleinske kiseline kako bi proizveo signal koji pokazuje da je meta uspješno izrezana.

Znanstvenici su stvorili SHERLOCK-ovu reakciju dizajniranu za rezanje SARS-CoV-2 RNA na određenom području gena zvanog Nukleoprotein koji je očuvan u više varijanti virusa. Kad se molekularne škare - enzim zvan Cas12a - uspješno vežu i razrežu gen nukleoproteina, režu se i jednolančane DNK sonde, proizvodi fluorescentni signal. Također su stvorili dodatne SHERLOCK testove osmišljene da ciljaju na skupinu virusnih mutacija u proteinskim sekvencama Spike koje predstavljaju tri genetske varijante SARS-CoV-2:Alfa, Beta, i gama.

Naoružani testovima koji bi mogli pouzdano detektirati virusnu RNA unutar prihvatljivog raspona koncentracija za dijagnostičke testove odobrene od FDA, tim je zatim usmjerio svoje napore na rješavanje vjerojatno najtežeg izazova u dijagnostici:pripremu uzorka.

Pljunuti, čekati, skenirati

"Kada testirate uzorak na nukleinske kiseline [poput DNK ili RNK], postoji mnogo koraka koje morate učiniti da biste pripremili uzorak kako biste zapravo mogli izdvojiti i pojačati te nukleinske kiseline. Morate zaštititi uzorak dok je u prijevozu do ispitnog objekta, i pobrinite se da nije zarazna ako se bavite prijenosnom bolešću. Kako bi ovaj dijagnostički test bio zaista jednostavan za korištenje, bilo nam je važno pojednostaviti to što je više moguće, "rekao je jedan od prvih autora Xiao Tan, DOKTOR MEDICINE., Dr. Sc., klinički suradnik na Institutu Wyss i instruktor medicine u gastroenterologiji u Općoj bolnici Massachusetts.

Tim je kao metodu prikupljanja odabrao korištenje pljuvačke umjesto uzorka brisa iz nazofarinksa jer je korisnicima lakše prikupljati sline, a studije su pokazale da se SARS-CoV-2 može otkriti u slini veći broj dana nakon infekcije. No, neobrađena slina predstavlja vlastite izazove:sadrži enzime koji razgrađuju različite molekule, proizvodi visoku stopu lažno pozitivnih rezultata.

Istraživači su razvili novu tehniku ​​za rješavanje tog problema. Prvi, u pljuvačku su dodali dvije kemikalije zvane DTT i EGTA i zagrijavali uzorak na 95 ° C 3 minute, koji je eliminirao lažno pozitivan signal iz neliječene sline i razrezao sve virusne čestice. Zatim su ugradili poroznu membranu koja je projektirana za hvatanje RNA na njezinoj površini, koji bi se konačno mogao izravno dodati SHERLOCK -ovoj reakciji za generiranje rezultata.

Za integraciju pripreme uzorka sline i SHERLOCK -ove reakcije u jednu dijagnostiku, tim je dizajnirao jednostavan uređaj na baterije s dvije komore:grijanom komorom za pripremu uzoraka, i nezagrijanu reakcijsku komoru. Korisnik pljune u komoru za pripremu uzorka, uključuje toplinu, i čeka tri do šest minuta da slina iscuri u filter. Korisnik uklanja filter i prenosi ga u stupac reakcijske komore, zatim gura klip koji odlaže filter u komoru i buši spremnik vode kako bi aktivirao SHERLOCK -ovu reakciju. 55 minuta kasnije, korisnik gleda kroz zatamnjeni prozor transiluminatora u reakcijsku komoru i potvrđuje prisutnost fluorescentnog signala. Također mogu koristiti popratnu aplikaciju za pametni telefon koja analizira piksele koje registrira kamera pametnog telefona kako bi dala jasnu pozitivnu ili negativnu dijagnozu.

Istraživači su testirali svoj dijagnostički uređaj pomoću kliničkih uzoraka sline 27 pacijenata s COVID-19 i 21 zdravog pacijenta, i otkrili da je miSHERLOCK ispravno identificirao bolesnike pozitivne na COVID-19 u 96% slučajeva i pacijente bez bolesti 95% vremena. Također su testirali njegove performanse u odnosu na Alfu, Beta, i varijante gama SARS-CoV-2 dodavanjem zdrave ljudske sline s mutacijama sintetičke virusne RNA pune duljine koje predstavljaju svaku varijantu, i otkrili da je uređaj učinkovit u čitavom rasponu koncentracija virusne RNK.

"Jedna od sjajnih stvari o miSHERLOCK -u je to što je potpuno modularna. Sam uređaj je odvojen od testova, tako da možete uključiti različite testove za specifičan slijed RNA ili DNA koji pokušavate otkriti, "rekla je jedna od prvih autorica Devora Najjar, znanstveni asistent na MIT Media Lab -u i u Collins Lab -u. "Uređaj košta oko 15 USD, ali bi masovna proizvodnja stanove srušila na oko 3 USD. Testovi za nove ciljeve mogu se napraviti za oko dva tjedna, omogućujući brzi razvoj testova za nove varijante COVID-19 i drugih bolesti. "

Spremni za stvarni svijet

Tim miSHERLOCK stvorio je svoj uređaj imajući u vidu postavke s malim resursima, dok je pandemija iznijela na vidjelo ogromne nejednakosti u pristupu zdravstvenoj zaštiti koje postoje između različitih dijelova svijeta. Hardver uređaja može izgraditi svatko tko ima pristup 3D pisaču, a datoteke i nacrti sklopova javno su dostupni na internetu. Dodavanje aplikacije za pametni telefon također je imalo za cilj postavke ograničene resursima, budući da je usluga mobilnog telefona dostupna gotovo bilo gdje u svijetu, čak i u područjima do kojih je teško doći pješice. Tim želi raditi s proizvođačima koji su zainteresirani za proizvodnju miSHERLOCK -a u velikoj mjeri za globalnu distribuciju.

"Kad je započeo projekt miSHERLOCK, gotovo se nije dogodilo praćenje varijante SARS-CoV-2. Znali smo da će praćenje varijanti biti nevjerojatno važno pri procjeni dugoročnih učinaka COVID-19 na lokalnu i globalnu zajednicu, pa smo se natjerali da stvorimo uistinu decentraliziranu, fleksibilno, dijagnostička platforma prilagođena korisniku, "rekao je Collins, koji je također Termeer profesor medicinskog inženjeringa i znanosti na MIT -u. "Rješavanjem problema pripreme uzorka, osigurali smo da je ovaj uređaj praktički spreman za upotrebu korisnicima onakvi kakvi jesu, i uzbuđeni smo što radimo s industrijskim partnerima kako bismo ga učinili komercijalno dostupnim. "

"Kombinirajući najnoviju biotehnologiju s jeftinim materijalima, ovaj tim je stvorio moćan dijagnostički uređaj koji mogu proizvesti i koristiti na lokalnoj razini ljudi bez naprednih medicinskih diploma. To je savršen primjer misije Wyss Instituta na djelu:staviti inovacije koje mijenjaju život u ruke ljudima kojima su potrebne, "rekao je osnivački direktor Wyssa Don Ingber, DOKTOR MEDICINE., Dr. Sc., koji je također Judah Folkman, profesor vaskularne biologije na Medicinskom fakultetu Harvard i dječjoj bolnici u Bostonu, i profesor bioinženjeringa na Harvardskoj školi inženjerskih i primijenjenih znanosti John A. Paulson.

• Novi stolni uređaj može brzo otkriti SARS-CoV-2 iz uzoraka sline
• Mobilni interventni tim za moždani udar putuje pacijentima radi bržeg pristupa kirurškom liječenju