Ny CRISPR-basert diagnostisk test oppdager COVID-19-varianter fra spyttprøver

Med Delta-varianten som ødelegger uvaksinerte populasjoner og COVID-19-tilfeller som spiser rundt i verden, pandemien er langt fra over. Til tross for den imponerende raske utviklingen av SARS-CoV-2 diagnostiske tester i løpet av det siste halvannet året, de aller fleste pasientprøver må fortsatt sendes til et laboratorium for behandling, noe som reduserer tempoet i sporing av tilfeller av COVID-19. Hvis en prøve skal testes for en bestemt variant av viruset, det må være genetisk sekvensert, som tar enda mer tid og ressurser.

Nå, forskere ved Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering ved Harvard University, Massachusetts Institute of Technology (MIT), og flere sykehus i Boston-området har skapt en billig, CRISPR-basert diagnostisk test som lar brukerne teste seg selv for SARS-CoV-2 og flere varianter av viruset ved hjelp av en prøve av spyttet hjemme, uten ekstra instrumentering nødvendig.

Diagnoseenheten, kalt Minimally Instrumented SHERLOCK (miSHERLOCK), er enkel å bruke og gir resultater som kan leses og bekreftes av en medfølgende smarttelefon -app innen en time. Den skilte vellykket mellom tre forskjellige varianter av SARS-CoV-2 i eksperimenter, og kan raskt omkonfigureres for å oppdage flere varianter som Delta. Enheten kan monteres ved hjelp av en 3D -skriver og allment tilgjengelige komponenter for omtrent $ 15, og gjenbruk av maskinvaren bringer kostnaden for individuelle analyser ned til $ 6 hver.

miSHERLOCK eliminerer behovet for å transportere pasientprøver til et sentralisert teststed og forenkler trinnene i prøveforberedelsen sterkt, gi pasienter og leger en raskere, et mer nøyaktig bilde av individets og samfunnets helse, som er kritisk under en pandemi som utvikler seg. "

Helena de Puig, Ph.D., Medforfatter, Postdoktor, Wyss Institute og MIT

Diagnoseenheten er beskrevet i et papir publisert i dag i Vitenskapelige fremskritt .

Fra forsyningskjeden til SHERLOCK

Som instruktør i pediatri ved Boston Children's Hospital med spesialisering i smittsomme sykdommer, medforfatter forfatter Rose Lee, MD har jobbet med frontlinjene for COVID-19-pandemien i over et år. Hennes erfaringer i klinikken ga inspirasjon til prosjektet som til slutt skulle bli miSHERLOCK.

"Enkle ting som pleide å være allestedsnærværende på sykehuset, som nasopharyngeal vattpinner, plutselig var det vanskelig å få tak i, så rutinemessige prøvebehandlingsprosedyrer ble forstyrret, som er et stort problem i en pandemisk setting, "sa Lee, som også er besøkende stipendiat ved Wyss Institute. "Teamets motivasjon for dette prosjektet var å eliminere disse flaskehalsene og gi nøyaktig diagnostikk for COVID-19 med mindre avhengighet av globale forsyningskjeder, og kunne også nøyaktig oppdage variantene som begynte å dukke opp. "

For deteksjonen SARS-CoV-2 av diagnosen, gruppen vendte seg til en CRISPR-basert teknologi laget i laboratoriet til Wyss Core Faculty-medlem og senior papirforfatter Jim Collins, Ph.D. kalt "spesifikk høysensitiv enzymatisk reporteropplåsing" (SHERLOCK). SHERLOCK bruker CRISPRs "molekylære saks" for å klippe DNA eller RNA på bestemte steder, med en ekstra bonus:denne spesifikke typen saks kutter også andre biter av DNA i området rundt, slik at den kan konstrueres med nukleinsyresondemolekyler for å produsere et signal som indikerer at målet har blitt kuttet.

Forskerne opprettet en SHERLOCK-reaksjon designet for å kutte SARS-CoV-2 RNA ved en bestemt region av et gen som kalles Nucleoprotein som er konservert på tvers av flere varianter av viruset. Når molekylsaksene - et enzym som heter Cas12a - binder seg til og kutter nukleoprotein -genet, enkeltstrengede DNA-sonder blir også kuttet, produserer et fluorescerende signal. De opprettet også flere SHERLOCK-analyser designet for å målrette mot et panel av virale mutasjoner i Spike-proteinsekvenser som representerer tre genetiske SARS-CoV-2-varianter:Alpha, Beta, og Gamma.

Bevæpnet med analyser som pålitelig kan påvise viralt RNA innenfor det aksepterte konsentrasjonsområdet for FDA-autoriserte diagnostiske tester, Teamet fokuserte deretter på å løse det som uten tvil er den vanskeligste utfordringen innen diagnostikk:prøveforberedelse.

Spytte, vente, skanne

"Når du tester en prøve for nukleinsyrer [som DNA eller RNA], det er mange trinn du må gjøre for å forberede prøven, slik at du faktisk kan trekke ut og forsterke disse nukleinsyrene. Du må beskytte prøven mens den er på vei til testanlegget, og sørg også for at det ikke er smittsomt hvis du har å gjøre med en smittsom sykdom. For å gjøre dette til en virkelig brukervennlig diagnostisk test, det var viktig for oss å forenkle det så mye som mulig, "sa medforsteforfatter Xiao Tan, M.D., Ph.D., en klinisk stipendiat ved Wyss Institute og Instructor of Medicine in Gastroenterology ved Massachusetts General Hospital.

Teamet valgte å bruke spytt i stedet for nasopharyngeal vattpinneprøver som innsamlingsmetode, fordi det er lettere for brukere å samle spytt og studier har vist at SARS-CoV-2 er påviselig i spytt i et større antall dager etter infeksjon. Men ubehandlet spytt byr på egne utfordringer:den inneholder enzymer som bryter ned forskjellige molekyler, produserer en høy grad av falske positiver.

Forskerne utviklet en ny teknikk for å løse dette problemet. Først, de la til to kjemikalier kalt DTT og EGTA til spytt og oppvarmet prøven til 95 ° C i 3 minutter, som eliminerte det falske positive signalet fra det ubehandlede spyttet og åpnet eventuelle virale partikler. De innlemmet deretter en porøs membran som ble konstruert for å fange RNA på overflaten, som endelig kunne legges direkte til SHERLOCK -reaksjonen for å generere et resultat.

For å integrere spyttprøvepreparatet og SHERLOCK -reaksjonen i en diagnostikk, teamet designet en enkel batteridrevet enhet med to kamre:et oppvarmet prøveforberedelseskammer, og et uoppvarmet reaksjonskammer. En bruker spytter inn i prøveforberedelseskammeret, slår på varmen, og venter tre til seks minutter på at spyttet blir ond i filteret. Brukeren fjerner filteret og overfører det til reaksjonskammerkolonnen, skyver deretter et stempel som avsetter filteret i kammeret og punkterer et vannreservoar for å aktivere SHERLOCK -reaksjonen. 55 minutter senere, brukeren ser gjennom det fargede transilluminatorvinduet inn i reaksjonskammeret og bekrefter tilstedeværelsen av et fluorescerende signal. De kan også bruke en medfølgende smarttelefonapp som analyserer pikslene som registreres av smarttelefonens kamera for å gi en klar positiv eller negativ diagnose.

Forskerne testet sin diagnostiske enhet ved hjelp av kliniske spyttprøver fra 27 COVID-19 pasienter og 21 friske pasienter, og fant ut at miSHERLOCK korrekt identifiserte COVID-19-positive pasienter 96% av tiden og pasienter uten sykdommen 95% av tiden. De testet også ytelsen mot Alpha, Beta, og Gamma SARS-CoV-2-varianter ved å øke sunt menneskelig spytt med syntetisk viralt RNA i full lengde som inneholder mutasjoner som representerer hver variant, og fant ut at enheten var effektiv på tvers av en rekke virale RNA -konsentrasjoner.

"En av de store tingene med miSHERLOCK er at den er helt modulær. Selve enheten er atskilt fra analysene, slik at du kan koble til forskjellige analyser for den spesifikke sekvensen til RNA eller DNA du prøver å oppdage, "sa medforsteforfatter Devora Najjar, forskningsassistent ved MIT Media Lab og i Collins Lab. "Enheten koster omtrent $ 15, men masseproduksjon ville bringe boligen ned til omtrent $ 3. Analyser for nye mål kan opprettes på omtrent to uker, muliggjør rask utvikling av tester for nye varianter av COVID-19 og andre sykdommer. "

Klar for den virkelige verden

MiSHERLOCK-teamet opprettet enheten med lav ressursinnstillinger i tankene, ettersom pandemien har avslørt de store ulikhetene i tilgang til helsetjenester som eksisterer mellom forskjellige deler av verden. Enhetens maskinvare kan bygges av alle som har tilgang til en 3D -skriver, og filene og kretsdesignene er alle offentlig tilgjengelige online. Tillegget til en smarttelefon-app var også rettet mot ressursbegrensede innstillinger, som mobiltelefontjeneste er tilgjengelig praktisk talt hvor som helst i verden, selv i områder som er vanskelig å nå til fots. Teamet er ivrig etter å jobbe med produsenter som er interessert i å produsere miSHERLOCK i stor skala for global distribusjon.

"Da miSHERLOCK -prosjektet startet, det var nesten ingen SARS-CoV-2 variantovervåking som skjedde. Vi visste at variantsporing kom til å bli utrolig viktig når vi vurderer de langsiktige effektene av COVID-19 på lokale og globale samfunn, så vi presset oss til å skape en virkelig desentralisert, fleksibel, brukervennlig diagnostisk plattform, "sa Collins, som også er Termeer -professor i medisinsk ingeniørfag og vitenskap ved MIT. "Ved å løse prøveforberedelsesproblemet, vi har sørget for at denne enheten er praktisk talt klar for forbrukere å bruke som den er, og vi er glade for å samarbeide med industrielle partnere for å gjøre det kommersielt tilgjengelig. "

"Ved å kombinere banebrytende bioteknologi med rimelige materialer, dette teamet har laget en kraftig diagnostisk enhet som kan produseres og brukes på lokalt nivå av mennesker uten avanserte medisinske grader. Det er et perfekt eksempel på Wyss-instituttets oppgave i aksjon:å legge livsendrende innovasjoner i hendene på mennesker som trenger dem, "sa Wyss Founding Director, Don Ingber, M.D., Ph.D., som også er Judah Folkman professor i vaskulærbiologi ved Harvard Medical School og Boston Children's Hospital, og professor i bioingeniør ved Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences.

• Ny bordplate kan raskt oppdage SARS-CoV-2 fra spyttprøver
• Mobilt intervensjonelt slaglag reiser til pasienter for å gi raskere tilgang til kirurgisk behandling