Jetzt, Forscher des Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering der Harvard University, das Massachusetts Institute of Technology (MIT), und mehrere Krankenhäuser in der Umgebung von Boston haben ein kostengünstiges, CRISPR-basierter Diagnosetest, der es Benutzern ermöglicht, sich selbst mit einer Speichelprobe zu Hause auf SARS-CoV-2 und mehrere Varianten des Virus zu testen, ohne zusätzliche Instrumentierung erforderlich.
Das Diagnosegerät, genannt minimal instrumentierter SHERLOCK (miSHERLOCK), ist einfach zu bedienen und liefert innerhalb einer Stunde Ergebnisse, die von einer begleitenden Smartphone-App gelesen und verifiziert werden können. Es unterschied in Experimenten erfolgreich drei verschiedene Varianten von SARS-CoV-2, und kann schnell umkonfiguriert werden, um zusätzliche Varianten wie Delta zu erkennen. Das Gerät kann mit einem 3D-Drucker und handelsüblichen Komponenten für etwa 15 US-Dollar zusammengebaut werden. und die Wiederverwendung der Hardware senkt die Kosten für einzelne Assays auf jeweils 6 US-Dollar.
miSHERLOCK macht den Transport von Patientenproben zu einem zentralen Testort überflüssig und vereinfacht die Probenvorbereitungsschritte erheblich. Patienten und Ärzten eine schnellere, genaueres Bild der individuellen und gemeinschaftlichen Gesundheit, was während einer sich entwickelnden Pandemie von entscheidender Bedeutung ist."
Helena de Puig, Ph.D., Co-Erstautor, Postdoktorand, Wyss Institute und MIT
Das Diagnosegerät wird in einem heute veröffentlichten Papier beschrieben in Wissenschaftliche Fortschritte .
Als Dozent für Pädiatrie am Boston Children's Hospital mit Spezialisierung auf Infektionskrankheiten, Co-Erstautorin Rose Lee, M.D. arbeitet seit über einem Jahr an vorderster Front der COVID-19-Pandemie. Ihre Erfahrungen in der Klinik waren Inspiration für das Projekt, aus dem schließlich miSHERLOCK werden sollte.
„Einfache Dinge, die früher im Krankenhaus allgegenwärtig waren, wie Nasen-Rachen-Abstriche, waren plötzlich schwer zu bekommen, so dass routinemäßige Probenverarbeitungsverfahren gestört wurden, was in einem pandemischen Umfeld ein großes Problem ist, " sagte Lee, der auch Visiting Fellow am Wyss Institute ist. „Die Motivation unseres Teams für dieses Projekt bestand darin, diese Engpässe zu beseitigen und eine genaue Diagnose für COVID-19 mit weniger Abhängigkeit von globalen Lieferketten bereitzustellen. und konnte auch die sich abzeichnenden Varianten genau erkennen."
Für den SARS-CoV-2-Nachweisteil ihrer Diagnose, die Gruppe wandte sich einer CRISPR-basierten Technologie zu, die im Labor von Wyss Core Faculty Member und Senior Paper Author Jim Collins entwickelt wurde. Ph.D. als "spezifisches hochempfindliches enzymatisches Reporter-Unlocking" (SHERLOCK) bezeichnet. SHERLOCK verwendet die "molekulare Schere" von CRISPR, um DNA oder RNA an bestimmten Stellen zu zerschneiden, mit zusätzlichem Bonus:diese spezielle Schere schneidet auch andere DNA-Stücke in der Umgebung, Ermöglichen, dass es mit Nukleinsäure-Sondenmolekülen konstruiert wird, um ein Signal zu erzeugen, das anzeigt, dass das Ziel erfolgreich geschnitten wurde.
Die Forscher entwickelten eine SHERLOCK-Reaktion, um SARS-CoV-2-RNA in einer bestimmten Region eines Gens namens Nukleoprotein zu schneiden, das über mehrere Varianten des Virus hinweg konserviert ist. Wenn die molekulare Schere – ein Enzym namens Cas12a – erfolgreich an das Nukleoprotein-Gen bindet und dieses schneidet, auch einzelsträngige DNA-Sonden werden geschnitten, ein Fluoreszenzsignal erzeugen. Sie haben auch zusätzliche SHERLOCK-Assays entwickelt, die auf eine Reihe viraler Mutationen in Spike-Proteinsequenzen abzielen, die drei genetische Varianten von SARS-CoV-2 darstellen:Alpha, Beta, und Gamma.
Ausgestattet mit Assays, die virale RNA innerhalb des akzeptierten Konzentrationsbereichs für von der FDA zugelassene diagnostische Tests zuverlässig nachweisen können, Als nächstes konzentrierte sich das Team auf die Lösung der wohl schwierigsten Herausforderung in der Diagnostik:die Probenvorbereitung.
"Wenn Sie eine Probe auf Nukleinsäuren [wie DNA oder RNA] testen, Es sind viele Schritte erforderlich, um die Probe vorzubereiten, damit Sie diese Nukleinsäuren tatsächlich extrahieren und amplifizieren können. Sie müssen die Probe während des Transports zur Testeinrichtung schützen. und stellen Sie auch sicher, dass es nicht ansteckend ist, wenn Sie es mit einer übertragbaren Krankheit zu tun haben. Um dies zu einem wirklich einfach zu handhabenden Diagnosetest zu machen, Es war uns wichtig, das so weit wie möglich zu vereinfachen, “ sagte Co-Erstautor Xiao Tan, M. D., Ph.D., Clinical Fellow am Wyss Institute und Instructor of Medicine in Gastroenterology am Massachusetts General Hospital.
Das Team entschied sich, Speichel anstelle von Nasen-Rachen-Abstrichproben als Entnahmemethode zu verwenden. weil es für Benutzer einfacher ist, Speichel zu sammeln und Studien gezeigt haben, dass SARS-CoV-2 nach der Infektion für eine größere Anzahl von Tagen im Speichel nachweisbar ist. Aber unverarbeiteter Speichel stellt seine eigenen Herausforderungen:Er enthält Enzyme, die verschiedene Moleküle abbauen, eine hohe Rate an falsch-positiven Ergebnissen zu erzeugen.
Die Forscher entwickelten eine neuartige Technik, um dieses Problem zu lösen. Zuerst, Sie fügten dem Speichel zwei Chemikalien namens DTT und EGTA hinzu und erhitzten die Probe 3 Minuten lang auf 95 °C. die das falsch positive Signal aus dem unbehandelten Speichel eliminiert und alle Viruspartikel aufgeschnitten. Anschließend fügten sie eine poröse Membran ein, die so konstruiert wurde, dass sie RNA auf ihrer Oberfläche einfängt. die schließlich direkt der SHERLOCK-Reaktion hinzugefügt werden konnte, um ein Ergebnis zu erzeugen.
Um die Speichelprobenvorbereitung und die SHERLOCK-Reaktion in eine Diagnostik zu integrieren, Das Team entwarf ein einfaches batteriebetriebenes Gerät mit zwei Kammern:einer beheizten Probenvorbereitungskammer, und eine unbeheizte Reaktionskammer. Ein Benutzer spuckt in die Probenvorbereitungskammer, macht die Hitze an, und wartet drei bis sechs Minuten, bis der Speichel in den Filter gelangt ist. Der Benutzer entfernt den Filter und überführt ihn in die Reaktionskammersäule, schiebt dann einen Kolben, der den Filter in die Kammer absetzt und ein Wasserreservoir durchsticht, um die SHERLOCK-Reaktion zu aktivieren. 55 Minuten später, der Benutzer schaut durch das getönte Transilluminatorfenster in die Reaktionskammer und bestätigt das Vorhandensein eines Fluoreszenzsignals. Sie können auch eine begleitende Smartphone-App verwenden, die die von der Kamera des Smartphones registrierten Pixel analysiert, um eine eindeutige positive oder negative Diagnose zu stellen.
Die Forscher testeten ihr Diagnosegerät mit klinischen Speichelproben von 27 COVID-19-Patienten und 21 gesunden Patienten. und stellte fest, dass miSHERLOCK in 96 % der Fälle COVID-19-positive Patienten und in 95 % der Fälle Patienten ohne die Krankheit korrekt identifizierte. Sie testeten auch seine Leistung gegen den Alpha, Beta, und Gamma SARS-CoV-2-Varianten, indem gesunden menschlichen Speichel mit synthetischer viraler RNA voller Länge gespickt wird, die Mutationen enthält, die jede Variante darstellen, und fanden heraus, dass das Gerät bei einer Reihe von viralen RNA-Konzentrationen wirksam war.
„Eine der großartigen Eigenschaften von miSHERLOCK ist, dass es vollständig modular aufgebaut ist. Das Gerät selbst ist von den Assays getrennt, So können Sie verschiedene Assays für die spezifische RNA- oder DNA-Sequenz anschließen, die Sie nachweisen möchten. “ sagte Co-Erstautorin Devora Najjar, wissenschaftlicher Mitarbeiter am MIT Media Lab und im Collins Lab. "Das Gerät kostet etwa 15 Dollar, aber die Massenproduktion würde das Gehäuse auf etwa 3 US-Dollar senken. Assays für neue Targets können in etwa zwei Wochen erstellt werden, ermöglicht die schnelle Entwicklung von Tests für neue Varianten von COVID-19 und anderen Krankheiten."
Das miSHERLOCK-Team hat sein Gerät mit Blick auf ressourcenarme Einstellungen entwickelt, da die Pandemie die enormen Ungleichheiten beim Zugang zur Gesundheitsversorgung ans Licht gebracht hat, die zwischen verschiedenen Teilen der Welt bestehen. Die Hardware des Geräts kann von jedem gebaut werden, der Zugang zu einem 3D-Drucker hat. und die Dateien und Schaltungsdesigns sind alle online öffentlich verfügbar. Das Hinzufügen einer Smartphone-App zielte auch auf ressourcenbegrenzte Einstellungen ab, da der Mobilfunkdienst praktisch überall auf der Welt verfügbar ist, auch in Bereichen, die zu Fuß schwer zu erreichen sind. Das Team ist bestrebt, mit Herstellern zusammenzuarbeiten, die daran interessiert sind, miSHERLOCK in großem Maßstab für den weltweiten Vertrieb zu produzieren.
"Als das miSHERLOCK-Projekt begann, Es gab fast keine Überwachung der SARS-CoV-2-Varianten. Wir wussten, dass die Variantenverfolgung bei der Bewertung der langfristigen Auswirkungen von COVID-19 auf lokale und globale Gemeinschaften unglaublich wichtig sein würde. Also haben wir uns dazu gedrängt, eine wirklich dezentralisierte, flexibel, benutzerfreundliche Diagnoseplattform, “ sagte Collins, der auch Termeer Professor of Medical Engineering &Science am MIT ist. "Durch die Lösung des Probenvorbereitungsproblems Wir haben sichergestellt, dass dieses Gerät für die Verbraucher praktisch einsatzbereit ist, wie es ist, und wir freuen uns, mit Industriepartnern zusammenzuarbeiten, um es kommerziell verfügbar zu machen."
"Durch die Kombination modernster Biotechnologie mit kostengünstigen Materialien, Dieses Team hat ein leistungsstarkes Diagnosegerät entwickelt, das auf lokaler Ebene von Menschen ohne fortgeschrittenen medizinischen Abschluss hergestellt und verwendet werden kann. Es ist ein perfektes Beispiel für die gelebte Mission des Wyss Institute:lebensverändernde Innovationen in die Hände von Menschen zu legen, die sie brauchen, " sagte Wyss-Gründungsdirektor Don Ingber, M. D., Ph.D., wer ist auch der Judah Folkman Professor für Gefäßbiologie an der Harvard Medical School und dem Boston Children's Hospital, und Professor für Bioingenieurwesen an der Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences.
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