Ahora, investigadores del Instituto Wyss de Ingeniería de Inspiración Biológica de la Universidad de Harvard, el Instituto de Tecnología de Massachusetts (MIT), y varios hospitales del área de Boston han creado un Prueba de diagnóstico basada en CRISPR que permite a los usuarios probarse ellos mismos para el SARS-CoV-2 y múltiples variantes del virus usando una muestra de su saliva en casa. sin necesidad de instrumentación adicional.
El dispositivo de diagnóstico, llamado SHERLOCK mínimamente instrumentado (miSHERLOCK), es fácil de usar y proporciona resultados que se pueden leer y verificar mediante una aplicación de teléfono inteligente adjunta en el plazo de una hora. Distinguió con éxito entre tres variantes diferentes de SARS-CoV-2 en experimentos, y se puede reconfigurar rápidamente para detectar variantes adicionales como Delta. El dispositivo se puede ensamblar usando una impresora 3D y componentes comúnmente disponibles por alrededor de $ 15, y reutilizar el hardware reduce el costo de los ensayos individuales a $ 6 cada uno.
miSHERLOCK elimina la necesidad de transportar muestras de pacientes a una ubicación de prueba centralizada y simplifica enormemente los pasos de preparación de muestras, dando a los pacientes y a los médicos un más rápido, una imagen más precisa de la salud individual y comunitaria, que es fundamental durante una pandemia en evolución ".
Elena de Puig, Doctor., Co-primer autor, Becario postdoctoral, Instituto Wyss y MIT
El dispositivo de diagnóstico se describe en un artículo publicado hoy en Avances de la ciencia .
Como instructor de pediatría en el Boston Children's Hospital con especialización en enfermedades infecciosas, la co-primera autora Rose Lee, M.D. ha estado trabajando en la primera línea de la pandemia de COVID-19 durante más de un año. Sus experiencias en la clínica le sirvieron de inspiración para el proyecto que finalmente se convertiría en miSHERLOCK.
"Cosas simples que solían ser omnipresentes en el hospital, como hisopos nasofaríngeos, fueron de repente difíciles de conseguir, por lo que se interrumpieron los procedimientos de procesamiento de muestras de rutina, que es un gran problema en un entorno pandémico, "dijo Lee, quien también es miembro visitante en el Instituto Wyss. "La motivación de nuestro equipo para este proyecto fue eliminar estos cuellos de botella y proporcionar diagnósticos precisos para COVID-19 con menos dependencia de las cadenas de suministro globales, y también podría detectar con precisión las variantes que estaban comenzando a surgir ".
Para la parte de detección de SARS-CoV-2 de su diagnóstico, el grupo recurrió a una tecnología basada en CRISPR creada en el laboratorio del miembro de Wyss Core Faculty y autor principal del artículo Jim Collins, Doctor. llamado "desbloqueo específico de reportero enzimático de alta sensibilidad" (SHERLOCK). SHERLOCK utiliza las "tijeras moleculares" de CRISPR para cortar ADN o ARN en ubicaciones específicas, con una ventaja adicional:este tipo específico de tijeras también corta otras piezas de ADN en el área circundante, permitiendo que sea diseñado con moléculas de sonda de ácido nucleico para producir una señal que indique que la diana se ha cortado con éxito.
Los investigadores crearon una reacción SHERLOCK diseñada para cortar el ARN del SARS-CoV-2 en una región específica de un gen llamado nucleoproteína que se conserva en múltiples variantes del virus. Cuando las tijeras moleculares, una enzima llamada Cas12a, se une y corta con éxito el gen de la nucleoproteína, también se cortan sondas de ADN monocatenario, produciendo una señal fluorescente. También crearon ensayos SHERLOCK adicionales diseñados para apuntar a un panel de mutaciones virales en secuencias de proteínas Spike que representan tres variantes genéticas del SARS-CoV-2:Alfa, Beta, y Gamma.
Armados con ensayos que podrían detectar de manera confiable ARN viral dentro del rango de concentración aceptado para las pruebas de diagnóstico autorizadas por la FDA, A continuación, el equipo centró sus esfuerzos en resolver lo que podría decirse que es el desafío más difícil en el diagnóstico:la preparación de muestras.
"Cuando analizas una muestra en busca de ácidos nucleicos [como ADN o ARN], Hay muchos pasos que debe seguir para preparar la muestra, de modo que pueda extraer y amplificar esos ácidos nucleicos. Debe proteger la muestra mientras está en tránsito hacia las instalaciones de prueba, y también asegúrese de que no sea infeccioso si está lidiando con una enfermedad transmisible. Para hacer de esta una prueba de diagnóstico realmente fácil de usar, era importante para nosotros simplificar eso tanto como fuera posible, "dijo el co-primer autor Xiao Tan, MARYLAND., Doctor., miembro clínico del Instituto Wyss e instructor de medicina en gastroenterología en el Hospital General de Massachusetts.
El equipo eligió usar saliva en lugar de muestras de hisopos nasofaríngeos como método de recolección. porque es más fácil para los usuarios recolectar saliva y los estudios han demostrado que el SARS-CoV-2 es detectable en la saliva durante un mayor número de días después de la infección. Pero la saliva sin procesar presenta desafíos propios:contiene enzimas que degradan varias moléculas, produciendo una alta tasa de falsos positivos.
Los investigadores desarrollaron una técnica novedosa para resolver ese problema. Primero, agregaron dos químicos llamados DTT y EGTA a la saliva y calentaron la muestra a 95 ° C durante 3 minutos, que eliminó la señal de falso positivo de la saliva no tratada y cortó cualquier partícula viral. Luego incorporaron una membrana porosa que fue diseñada para atrapar ARN en su superficie, que finalmente podría agregarse directamente a la reacción de SHERLOCK para generar un resultado.
Para integrar la preparación de la muestra de saliva y la reacción de SHERLOCK en un diagnóstico, el equipo diseñó un dispositivo simple que funciona con baterías con dos cámaras:una cámara de preparación de muestras calentada, y una cámara de reacción sin calentar. Un usuario escupe en la cámara de preparación de muestras, enciende la calefacción, y espera de tres a seis minutos a que la saliva penetre en el filtro. El usuario quita el filtro y lo transfiere a la columna de la cámara de reacción, luego empuja un émbolo que deposita el filtro en la cámara y perfora un depósito de agua para activar la reacción SHERLOCK. 55 minutos después, el usuario mira a través de la ventana del transiluminador tintado hacia la cámara de reacción y confirma la presencia de una señal fluorescente. También pueden usar una aplicación de teléfono inteligente que analiza los píxeles que registra la cámara del teléfono inteligente para proporcionar un diagnóstico claro positivo o negativo.
Los investigadores probaron su dispositivo de diagnóstico utilizando muestras clínicas de saliva de 27 pacientes con COVID-19 y 21 pacientes sanos. y encontró que miSHERLOCK identificó correctamente a los pacientes COVID-19 positivos el 96% de las veces y a los pacientes sin la enfermedad el 95% de las veces. También probaron su desempeño contra el Alpha, Beta, y variantes de Gamma SARS-CoV-2 mediante la adición de saliva humana sana con ARN viral sintético de longitud completa que contiene mutaciones que representan cada variante, y descubrió que el dispositivo era eficaz en una variedad de concentraciones de ARN viral.
"Una de las mejores cosas de miSHERLOCK es que es completamente modular. El dispositivo en sí está separado de los ensayos, para que pueda conectar diferentes ensayos para la secuencia específica de ARN o ADN que está tratando de detectar, "dijo el co-primer autor Devora Najjar, asistente de investigación en el MIT Media Lab y en el Collins Lab. "El dispositivo cuesta alrededor de $ 15, pero la producción en masa reduciría la vivienda a alrededor de $ 3. Los ensayos para nuevos objetivos se pueden crear en aproximadamente dos semanas, permitiendo el rápido desarrollo de pruebas para nuevas variantes de COVID-19 y otras enfermedades ".
El equipo de miSHERLOCK creó su dispositivo teniendo en cuenta la configuración de bajos recursos, ya que la pandemia ha sacado a la luz las enormes desigualdades en el acceso a la atención médica que existen entre diferentes partes del mundo. Cualquiera que tenga acceso a una impresora 3D puede construir el hardware del dispositivo, y los archivos y diseños de circuitos están todos disponibles públicamente en línea. La adición de una aplicación para teléfonos inteligentes también estaba dirigida a entornos con recursos limitados, ya que el servicio de telefonía móvil está disponible prácticamente en cualquier parte del mundo, incluso en zonas de difícil acceso a pie. El equipo está ansioso por trabajar con fabricantes interesados en producir miSHERLOCK a escala para la distribución global.
"Cuando comenzó el proyecto miSHERLOCK, Casi no hubo monitoreo de la variante del SARS-CoV-2. Sabíamos que el seguimiento de variantes iba a ser increíblemente importante al evaluar los efectos a largo plazo del COVID-19 en las comunidades locales y globales. así que nos esforzamos por crear un entorno verdaderamente descentralizado flexible, plataforma de diagnóstico fácil de usar, "dijo Collins, quien también es el Profesor Termeer de Ingeniería Médica y Ciencia en el MIT. "Al resolver el problema de preparación de muestras, nos hemos asegurado de que este dispositivo esté prácticamente listo para que los consumidores lo utilicen tal cual, y estamos entusiasmados de trabajar con socios industriales para que esté disponible comercialmente ".
"Combinando biotecnología de vanguardia con materiales de bajo costo, este equipo ha creado un poderoso dispositivo de diagnóstico que puede ser fabricado y utilizado a nivel local por personas sin títulos médicos avanzados. Es un ejemplo perfecto de la misión del Instituto Wyss en acción:poner innovaciones que cambian vidas en manos de las personas que las necesitan, "dijo el director fundador de Wyss, Don Ingber, MARYLAND., Doctor., quien es tambien el Judah Folkman Profesor de Biología Vascular en Harvard Medical School y Boston Children's Hospital, y profesor de bioingeniería en la Escuela de Ingeniería y Ciencias Aplicadas John A. Paulson de Harvard.
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