Nutsvoorzieningen, onderzoekers van het Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering aan de Harvard University, het Massachusetts Institute of Technology (MIT), en verschillende ziekenhuizen in de omgeving van Boston hebben een goedkoop, CRISPR-gebaseerde diagnostische test waarmee gebruikers zichzelf kunnen testen op SARS-CoV-2 en meerdere varianten van het virus met behulp van een monster van hun speeksel thuis, zonder dat er extra instrumentatie nodig is.
Het diagnoseapparaat, genaamd minimaal geïnstrumenteerde SHERLOCK (miSHERLOCK), is eenvoudig in gebruik en geeft resultaten die binnen een uur kunnen worden uitgelezen en geverifieerd door een bijbehorende smartphone-app. Het maakte met succes onderscheid tussen drie verschillende varianten van SARS-CoV-2 in experimenten, en kan snel opnieuw worden geconfigureerd om extra varianten zoals Delta te detecteren. Het apparaat kan worden geassembleerd met behulp van een 3D-printer en algemeen beschikbare componenten voor ongeveer $ 15, en door de hardware opnieuw te gebruiken, worden de kosten van afzonderlijke tests verlaagd tot $ 6 per stuk.
miSHERLOCK elimineert de noodzaak om patiëntmonsters naar een gecentraliseerde testlocatie te transporteren en vereenvoudigt de monstervoorbereidingsstappen aanzienlijk, patiënten en artsen een snellere, nauwkeuriger beeld van de gezondheid van individuen en gemeenschappen, wat van cruciaal belang is tijdens een zich ontwikkelende pandemie."
Helena de Puig, doctoraat, Mede-eerste auteur, postdoctoraal onderzoeker, Wyss Institute en MIT
Het diagnostische apparaat wordt beschreven in een artikel dat vandaag is gepubliceerd in wetenschappelijke vooruitgang .
Als instructeur kindergeneeskunde in het Boston Children's Hospital met een specialisatie in infectieziekten, co-eerste auteur Rose Lee, M.D. werkt al meer dan een jaar aan de frontlinie van de COVID-19-pandemie. Haar ervaringen in de kliniek vormden inspiratie voor het project dat uiteindelijk miSHERLOCK zou worden.
"Eenvoudige dingen die vroeger alomtegenwoordig waren in het ziekenhuis, zoals nasofaryngeale uitstrijkjes, waren plotseling moeilijk te krijgen, zodat routinematige monsterverwerkingsprocedures werden verstoord, wat een groot probleem is in een pandemische omgeving, " zei Leen, die ook een Visiting Fellow is bij het Wyss Institute. "De motivatie van ons team voor dit project was om deze knelpunten weg te werken en nauwkeurige diagnostiek voor COVID-19 te bieden met minder afhankelijkheid van wereldwijde toeleveringsketens, en kon ook nauwkeurig de varianten detecteren die begonnen te ontstaan."
Voor het SARS-CoV-2-detectiedeel van hun diagnose, de groep wendde zich tot een op CRISPR gebaseerde technologie die is gemaakt in het lab van Wyss Core Faculty-lid en senior paper-auteur Jim Collins, doctoraat genaamd "specifieke enzymatische reporter-ontgrendeling met hoge gevoeligheid" (SHERLOCK). SHERLOCK maakt gebruik van CRISPR's "moleculaire schaar" om DNA of RNA op specifieke locaties te knippen, met een extra bonus:dit specifieke type schaar knipt ook andere stukjes DNA in de omgeving, waardoor het kan worden geconstrueerd met nucleïnezuurprobe-moleculen om een signaal te produceren dat aangeeft dat het doelwit met succes is geknipt.
De onderzoekers creëerden een SHERLOCK-reactie die is ontworpen om SARS-CoV-2-RNA te knippen in een specifiek gebied van een gen genaamd Nucleoproteïne dat geconserveerd is in meerdere varianten van het virus. Wanneer de moleculaire schaar - een enzym genaamd Cas12a - zich met succes bindt aan en het nucleoproteïne-gen knipt, enkelstrengs DNA-probes worden ook gesneden, het produceren van een fluorescerend signaal. Ze creëerden ook extra SHERLOCK-assays die zijn ontworpen om een panel van virale mutaties in Spike-eiwitsequenties aan te pakken die drie SARS-CoV-2-genetische varianten vertegenwoordigen:alfa, bèta, en Gamma.
Gewapend met testen die op betrouwbare wijze viraal RNA kunnen detecteren binnen het geaccepteerde concentratiebereik voor door de FDA geautoriseerde diagnostische tests, het team richtte vervolgens hun inspanningen op het oplossen van wat misschien wel de moeilijkste uitdaging in diagnostiek is:monstervoorbereiding.
"Als je een monster test op nucleïnezuren [zoals DNA of RNA], er zijn veel stappen die u moet doen om het monster voor te bereiden, zodat u die nucleïnezuren daadwerkelijk kunt extraheren en amplificeren. Je moet het monster beschermen terwijl het onderweg is naar de testfaciliteit, en zorg er ook voor dat het niet besmettelijk is als u te maken heeft met een overdraagbare ziekte. Om dit een echt gebruiksvriendelijke diagnostische test te maken, het was belangrijk voor ons om dat zo veel mogelijk te vereenvoudigen, " zei co-eerste auteur Xiao Tan, MD, doctoraat, een Clinical Fellow aan het Wyss Institute en Instructor of Medicine in Gastro-enterology in het Massachusetts General Hospital.
Het team koos ervoor om speekselmonsters te gebruiken in plaats van nasofaryngeale uitstrijkjes als verzamelmethode, omdat het voor gebruikers gemakkelijker is om speeksel op te vangen en onderzoeken hebben aangetoond dat SARS-CoV-2 gedurende een groter aantal dagen na infectie in speeksel detecteerbaar is. Maar onbewerkt speeksel biedt zijn eigen uitdagingen:het bevat enzymen die verschillende moleculen afbreken, met een hoog percentage valse positieven.
De onderzoekers ontwikkelden een nieuwe techniek om dat probleem op te lossen. Eerst, ze voegden twee chemicaliën, DTT en EGTA genaamd, aan speeksel toe en verwarmden het monster gedurende 3 minuten tot 95 °C, die het vals-positieve signaal uit het onbehandelde speeksel elimineerde en alle virale deeltjes opensneed. Vervolgens hebben ze een poreus membraan ingebouwd dat is ontworpen om RNA op het oppervlak te vangen, die uiteindelijk rechtstreeks aan de SHERLOCK-reactie kon worden toegevoegd om een resultaat te genereren.
Om de voorbereiding van het speekselmonster en de SHERLOCK-reactie in één diagnose te integreren, het team ontwierp een eenvoudig batterijgevoed apparaat met twee kamers:een verwarmde monstervoorbereidingskamer, en een onverwarmde reactiekamer. Een gebruiker spuugt in de monstervoorbereidingskamer, zet de verwarming aan, en wacht drie tot zes minuten totdat het speeksel in het filter is opgenomen. De gebruiker verwijdert het filter en brengt het over naar de reactiekamerkolom, duwt vervolgens een plunjer die het filter in de kamer plaatst en doorboort een waterreservoir om de SHERLOCK-reactie te activeren. 55 minuten later, de gebruiker kijkt door het getinte transilluminatorvenster in de reactiekamer en bevestigt de aanwezigheid van een fluorescerend signaal. Ze kunnen ook een bijbehorende smartphone-app gebruiken die de pixels analyseert die door de camera van de smartphone worden geregistreerd om een duidelijke positieve of negatieve diagnose te stellen.
De onderzoekers testten hun diagnostisch apparaat met behulp van klinische speekselmonsters van 27 COVID-19-patiënten en 21 gezonde patiënten, en ontdekte dat miSHERLOCK COVID-19-positieve patiënten 96% van de tijd correct identificeerde en patiënten zonder de ziekte 95% van de tijd. Ze testten ook de prestaties tegen de Alpha, bèta, en Gamma SARS-CoV-2-varianten door gezond menselijk speeksel te verrijken met synthetisch viraal RNA van volledige lengte dat mutaties bevat die elke variant vertegenwoordigen, en ontdekte dat het apparaat effectief was in een reeks virale RNA-concentraties.
"Een van de geweldige dingen van miSHERLOCK is dat het volledig modulair is. Het apparaat zelf staat los van de testen, zodat u verschillende testen kunt aansluiten voor de specifieke sequentie van RNA of DNA die u probeert te detecteren, " zei co-eerste auteur Devora Najjar, een onderzoeksassistent bij het MIT Media Lab en in het Collins Lab. "Het apparaat kost ongeveer $ 15, maar massaproductie zou de behuizing terugbrengen tot ongeveer $ 3. Assays voor nieuwe doelen kunnen in ongeveer twee weken worden gemaakt, waardoor de snelle ontwikkeling van tests voor nieuwe varianten van COVID-19 en andere ziekten mogelijk wordt."
Het miSHERLOCK-team heeft hun apparaat gemaakt met instellingen voor weinig middelen in gedachten, aangezien de pandemie de enorme ongelijkheden in de toegang tot gezondheidszorg tussen verschillende delen van de wereld aan het licht heeft gebracht. De hardware van het apparaat kan worden gebouwd door iedereen met toegang tot een 3D-printer, en de bestanden en circuitontwerpen zijn allemaal openbaar online beschikbaar. De toevoeging van een smartphone-app was ook gericht op instellingen met beperkte middelen, aangezien mobiele telefonie vrijwel overal ter wereld beschikbaar is, zelfs in gebieden die moeilijk te voet bereikbaar zijn. Het team werkt graag samen met fabrikanten die geïnteresseerd zijn in het op grote schaal produceren van miSHERLOCK voor wereldwijde distributie.
"Toen het miSHERLOCK-project begon, er was bijna geen monitoring van SARS-CoV-2-varianten. We wisten dat het volgen van varianten ongelooflijk belangrijk zou zijn bij het evalueren van de langetermijneffecten van COVID-19 op lokale en wereldwijde gemeenschappen, dus hebben we onszelf ertoe aangezet om een echt gedecentraliseerd, flexibel, gebruiksvriendelijk diagnostisch platform, " zei Collins, die ook de Termeer Professor of Medical Engineering &Science aan het MIT is. "Door het monstervoorbereidingsprobleem op te lossen, we hebben ervoor gezorgd dat dit apparaat vrijwel klaar is voor gebruik door consumenten zoals het is, en we zijn verheugd om samen te werken met industriële partners om het commercieel beschikbaar te maken."
"Door geavanceerde biotechnologie te combineren met goedkope materialen, dit team heeft een krachtig diagnostisch apparaat gemaakt dat op lokaal niveau kan worden vervaardigd en gebruikt door mensen zonder geavanceerde medische diploma's. Het is een perfect voorbeeld van de missie van het Wyss Institute in actie:levensveranderende innovaties in handen geven van mensen die ze nodig hebben, " zei Wyss Founding Director Don Ingber, MD, doctoraat, wie is ook de Judah Folkman Hoogleraar Vasculaire Biologie aan de Harvard Medical School en het Boston Children's Hospital, en hoogleraar bio-engineering aan de Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences.
Koffie helpt bij het ontwikkelen van gezonde darmmicroben en bevordert de stoelgang
Darmmicrobiota kan de ernst van COVID-19 voorspellen
Rotavirusvaccinatie niet gekoppeld aan risico op diabetes mellitus type 1
Omgaan met coeliakie
Bovenste endoscopie
RNA-sequencing biedt nieuwe inzichten in het microbioom
Witte bloedcellen en hun rol in de hersenen
In een baanbrekend onderzoek een groep internationale onderzoekers heeft ontdekt dat de hersenen specifieke interne immuuncellen hebben die helpen bij de normale ontwikkeling van de hersenen en een ro
Visslijm kan een potentiële bron van antibiotica zijn, blijkt uit onderzoek
Met de komst van multiresistente bacteriën en het gebrek aan nieuwe antibiotica, onderzoekers zijn op zoek geweest naar nieuwe moleculen die deze ziekteverwekkers kunnen bestrijden. Een team van onder
Wetenschappers veranderen bloed van type A in universeel type O,
mogelijk verdubbeling van de bloedtransfusievoorraden Onderzoekers van de University of British Columbia hebben een mogelijke manier gevonden om type A-bloed om te zetten in universeel type O-bloed.