Новый диагностический тест на основе CRISPR обнаруживает варианты COVID-19 в образцах слюны

Поскольку вариант Дельта наносит серьезный ущерб невакцинированному населению, а число случаев COVID-19 растет по всему миру, пандемия еще далека от завершения. Несмотря на впечатляюще быстрое развитие диагностических тестов SARS-CoV-2 за последние полтора года, подавляющее большинство образцов пациентов по-прежнему необходимо отправлять в лабораторию для обработки, что замедляет темпы отслеживания случаев COVID-19. Если образец должен быть протестирован на конкретный вариант вируса, он должен быть генетически секвенирован, что требует еще больше времени и ресурсов.

Теперь, исследователи из Института биологической инженерии Висса Гарвардского университета, Массачусетский технологический институт (MIT), и несколько больниц в районе Бостона создали недорогие, Диагностический тест на основе CRISPR, который позволяет пользователям тестировать себя на SARS-CoV-2 и несколько вариантов вируса, используя образец своей слюны в домашних условиях, без дополнительных инструментов.

Диагностический прибор, называется SHERLOCK с минимальным оснащением (miSHERLOCK), прост в использовании и предоставляет результаты, которые можно прочитать и проверить с помощью прилагаемого приложения для смартфона в течение одного часа. Он успешно различил три различных варианта SARS-CoV-2 в экспериментах, и его можно быстро перенастроить для обнаружения дополнительных вариантов, таких как Delta. Устройство можно собрать с помощью 3D-принтера и общедоступных компонентов примерно за 15 долларов, а повторное использование оборудования снижает стоимость отдельных анализов до 6 долларов каждый.

<цитата>

miSHERLOCK устраняет необходимость транспортировки образцов пациентов в централизованное место тестирования и значительно упрощает этапы подготовки образцов, ускоряя работу пациентов и врачей, более точная картина здоровья человека и общества, что имеет решающее значение во время развивающейся пандемии ".

Хелена де Пуч, Кандидат наук., Соавтор, Сотрудник докторантуры, Институт Висса и Массачусетский технологический институт

Диагностическое устройство описано в статье, опубликованной сегодня в Достижения науки .

От цепочки поставок до SHERLOCK

Как инструктор по педиатрии в Бостонской детской больнице со специализацией по инфекционным заболеваниям, соавтор Роза Ли, Доктор медицины работает на передовой пандемии COVID-19 более года. Ее опыт в клинике послужил вдохновением для проекта, который в конечном итоге стал miSHERLOCK.

"Простые вещи, которые раньше были повсюду в больнице, как мазки из носоглотки, внезапно стало трудно достать, поэтому рутинные процедуры обработки образцов были нарушены, что является большой проблемой в условиях пандемии, "сказал Ли, который также является приглашенным научным сотрудником в Институте Висс. «Мотивация нашей команды для этого проекта заключалась в том, чтобы устранить эти узкие места и обеспечить точную диагностику COVID-19 с меньшей зависимостью от глобальных цепочек поставок, а также мог точно обнаруживать варианты, которые начинали появляться ».

Для детектора SARS-CoV-2 их диагностики, группа обратилась к технологии на основе CRISPR, созданной в лаборатории члена факультета Wyss Core и старшего автора статьи Джима Коллинза, Кандидат наук. называется «специфическая высокочувствительная разблокировка ферментативного репортера» (SHERLOCK). SHERLOCK использует «молекулярные ножницы» CRISPR, чтобы вырезать ДНК или РНК в определенных местах, с дополнительным бонусом:этот особый тип ножниц также разрезает другие фрагменты ДНК в окружающей области, позволяя сконструировать его с молекулами зондов нуклеиновых кислот для получения сигнала, указывающего на то, что цель была успешно разрезана.

Исследователи создали реакцию SHERLOCK, предназначенную для разрезания РНК SARS-CoV-2 в определенной области гена, называемого нуклеопротеином, который сохраняется во многих вариантах вируса. Когда молекулярные ножницы - фермент под названием Cas12a - успешно связывается и разрезает ген нуклеопротеина, одноцепочечные ДНК-зонды также разрезаются, производит флуоресцентный сигнал. Они также создали дополнительные тесты SHERLOCK, предназначенные для нацеливания на панель вирусных мутаций в последовательностях белка Spike, которые представляют три генетических варианта SARS-CoV-2:Alpha, Бета, и гамма.

Вооруженные тестами, которые могут надежно обнаруживать вирусную РНК в пределах допустимого диапазона концентраций для диагностических тестов, разрешенных FDA, Затем команда сосредоточила свои усилия на решении, пожалуй, самой сложной задачи в диагностике:подготовки проб.

Плевать, ждать, сканировать

"Когда вы проверяете образец на нуклеиновые кислоты [например, ДНК или РНК], необходимо выполнить множество шагов, чтобы подготовить образец, чтобы можно было извлечь и амплифицировать эти нуклеиновые кислоты. Вы должны защитить образец во время его транспортировки в испытательный центр. а также убедитесь, что он не заразен, если вы имеете дело с трансмиссивным заболеванием. Чтобы сделать этот диагностический тест действительно простым в использовании, для нас было важно максимально упростить это, "сказал соавтор Сяо Тан, Доктор медицины, Кандидат наук., клинический научный сотрудник Института Висса и инструктор по гастроэнтерологии в больнице общего профиля Массачусетса.

Команда предпочла использовать слюну, а не образцы носоглоточного мазка в качестве метода сбора, потому что пользователям легче собирать слюну, и исследования показали, что SARS-CoV-2 обнаруживается в слюне в течение большего количества дней после заражения. Но необработанная слюна сама по себе создает проблемы:она содержит ферменты, расщепляющие различные молекулы, производят высокий уровень ложных срабатываний.

Исследователи разработали новую технику для решения этой проблемы. Первый, они добавили в слюну два химиката, называемые DTT и EGTA, и нагрели образец до 95 ° C в течение 3 минут, который устранил ложноположительный сигнал от необработанной слюны и вскрыл любые вирусные частицы. Затем они включили пористую мембрану, которая была сконструирована так, чтобы удерживать РНК на своей поверхности. который, наконец, можно было бы добавить непосредственно к реакции SHERLOCK для получения результата.

Чтобы объединить подготовку образца слюны и реакцию ШЕРЛОКА в одну диагностику, команда разработала простое устройство с батарейным питанием с двумя камерами:камера для подготовки образцов с подогревом, и неотапливаемая реакционная камера. Пользователь плюется в камеру для пробоподготовки, включает тепло, и ждет от трех до шести минут, пока слюна не попадет в фильтр. Пользователь снимает фильтр и переносит его в колонку реакционной камеры, затем толкает поршень, который помещает фильтр в камеру и прокалывает резервуар для воды, чтобы активировать реакцию SHERLOCK. 55 минут спустя, Пользователь смотрит через тонированное окно трансиллюминатора в реакционную камеру и подтверждает наличие флуоресцентного сигнала. Они также могут использовать сопутствующее приложение для смартфонов, которое анализирует пиксели, регистрируемые камерой смартфона, чтобы поставить четкий положительный или отрицательный диагноз.

Исследователи протестировали свое диагностическое устройство с использованием клинических образцов слюны 27 пациентов с COVID-19 и 21 здорового пациента. и обнаружили, что miSHERLOCK правильно идентифицировал COVID-19-позитивных пациентов в 96% случаев и пациентов без заболевания в 95% случаев. Они также проверили его производительность по сравнению с Alpha, Бета, и варианты Gamma SARS-CoV-2 путем добавления в здоровую человеческую слюну полноразмерной синтетической вирусной РНК, содержащей мутации, представляющие каждый вариант, и обнаружили, что устройство было эффективным в широком диапазоне концентраций вирусной РНК.

"Одна из замечательных особенностей miSHERLOCK заключается в том, что он полностью модульный. Само устройство отделено от анализов, так что вы можете подключать различные анализы для конкретной последовательности РНК или ДНК, которую вы пытаетесь обнаружить, "сказал соавтор Девора Наджар, Ассистент-исследователь в MIT Media Lab и Collins Lab. «Устройство стоит около 15 долларов, но массовое производство обойдется примерно в 3 доллара. Анализы для новых целей можно создать примерно за две недели, возможность быстрой разработки тестов на новые варианты COVID-19 и других заболеваний ».

Готовы к реальному миру

Команда miSHERLOCK создавала свое устройство с учетом настроек с низким уровнем ресурсов, поскольку пандемия выявила огромное неравенство в доступе к здравоохранению, которое существует между различными частями мира. Аппаратное обеспечение устройства может быть создано любым, у кого есть доступ к 3D-принтеру, а файлы и схемы общедоступны в Интернете. Добавление приложения для смартфона также было направлено на настройки с ограниченными ресурсами, поскольку услуга мобильной связи доступна практически в любой точке мира, даже в труднодоступных местах. Команда готова работать с производителями, которые заинтересованы в масштабном производстве miSHERLOCK для глобального распространения.

"Когда проект miSHERLOCK стартовал, мониторинг варианта SARS-CoV-2 практически не проводился. Мы знали, что отслеживание вариантов будет невероятно важным при оценке долгосрочного воздействия COVID-19 на местные и глобальные сообщества. поэтому мы заставили себя создать действительно децентрализованную, гибкий, удобная диагностическая платформа, "сказал Коллинз, который также является профессором Термиера медицинской инженерии и науки в Массачусетском технологическом институте. "Решив проблему подготовки образца, мы позаботились о том, чтобы это устройство было практически готово к использованию потребителями "как есть", и мы рады работать с промышленными партнерами, чтобы сделать его коммерчески доступным ».

"Объединив передовые биотехнологии с недорогими материалами, эта команда создала мощное диагностическое устройство, которое может изготавливаться и использоваться на местном уровне людьми без ученых степеней. Это прекрасный пример реализации миссии Wyss Institute:предоставить изменяющие жизнь инновации в руки людей, которые в них нуждаются, "сказал директор-основатель Wyss Дон Ингбер, Доктор медицины, Кандидат наук., кто также Джуда Фолкман Профессор сосудистой биологии в Гарвардской медицинской школе и Бостонской детской больнице, и профессор биоинженерии Гарвардской школы инженерии и прикладных наук Джона А. Полсона.

• Новое настольное устройство может быстро обнаружить SARS-CoV-2 в образцах слюны
• Мобильная интервенционная бригада выезжает к пациентам, чтобы обеспечить более быстрый доступ к хирургическ…