Agora, pesquisadores do Instituto Wyss de Engenharia Inspirada na Biologia da Universidade de Harvard, o Instituto de Tecnologia de Massachusetts (MIT), e vários hospitais da área de Boston criaram um local barato, Teste de diagnóstico baseado em CRISPR que permite que os usuários testem a si mesmos para SARS-CoV-2 e múltiplas variantes do vírus usando uma amostra de sua saliva em casa, sem necessidade de instrumentação extra.
O dispositivo de diagnóstico, chamado SHERLOCK minimamente instrumentado (miSHERLOCK), é fácil de usar e fornece resultados que podem ser lidos e verificados por um aplicativo de smartphone em uma hora. Ele distinguiu com sucesso entre três variantes diferentes de SARS-CoV-2 em experimentos, e pode ser rapidamente reconfigurado para detectar variantes adicionais como Delta. O dispositivo pode ser montado usando uma impressora 3D e componentes comumente disponíveis por cerca de US $ 15, e a reutilização do hardware reduz o custo dos ensaios individuais para US $ 6 cada.
miSHERLOCK elimina a necessidade de transportar amostras de pacientes para um local de teste centralizado e simplifica muito as etapas de preparação de amostras, dando aos pacientes e médicos um acesso mais rápido, imagem mais precisa da saúde individual e comunitária, o que é crítico durante uma pandemia em evolução. "
Helena de Puig, Ph.D., Co-primeiro autor, Bolsista de Pós-Doutorado, Wyss Institute e MIT
O dispositivo de diagnóstico é descrito em um artigo publicado hoje em Avanços da Ciência .
Como instrutor de Pediatria no Boston Children's Hospital, com especialização em doenças infecciosas, co-primeira autora Rose Lee, M.D. tem trabalhado na linha de frente da pandemia COVID-19 por mais de um ano. Suas experiências na clínica forneceram inspiração para o projeto que viria a se tornar miSHERLOCK.
"Coisas simples que costumavam ser onipresentes no hospital, como cotonetes nasofaríngeos, de repente eram difíceis de conseguir, então os procedimentos de processamento de amostra de rotina foram interrompidos, que é um grande problema em um cenário de pandemia, "disse Lee, que também é pesquisador visitante no Wyss Institute. "A motivação de nossa equipe para este projeto foi eliminar esses gargalos e fornecer diagnósticos precisos para COVID-19 com menos dependência das cadeias de abastecimento globais, e também poderia detectar com precisão as variantes que estavam começando a surgir. "
Para a peça de detecção SARS-CoV-2 de seu diagnóstico, o grupo voltou-se para uma tecnologia baseada em CRISPR criada no laboratório de Wyss Core Faculty membro e autor sênior de artigos Jim Collins, Ph.D. denominado "desbloqueio específico de repórter enzimático de alta sensibilidade" (SHERLOCK). SHERLOCK faz uso da "tesoura molecular" do CRISPR para cortar DNA ou RNA em locais específicos, com um bônus adicional:este tipo específico de tesoura também corta outros pedaços de DNA na área circundante, permitindo que ele seja projetado com moléculas de sonda de ácido nucleico para produzir um sinal indicando que o alvo foi cortado com sucesso.
Os pesquisadores criaram uma reação SHERLOCK projetada para cortar o RNA do SARS-CoV-2 em uma região específica de um gene chamado Nucleoproteína, que é conservado em múltiplas variantes do vírus. Quando a tesoura molecular - uma enzima chamada Cas12a - se liga e corta com sucesso o gene da Nucleoproteína, sondas de DNA de fita simples também são cortadas, produzindo um sinal fluorescente. Eles também criaram ensaios SHERLOCK adicionais projetados para direcionar um painel de mutações virais nas sequências da proteína Spike que representam três variantes genéticas do SARS-CoV-2:Alfa, Beta, e Gama.
Armado com ensaios que podem detectar de forma confiável RNA viral dentro da faixa de concentração aceita para testes de diagnóstico autorizados pela FDA, em seguida, a equipe concentrou seus esforços em resolver o que é indiscutivelmente o desafio mais difícil em diagnósticos:a preparação da amostra.
"Quando você está testando uma amostra de ácidos nucléicos [como DNA ou RNA], há uma série de etapas que você precisa seguir para preparar a amostra para que possa realmente extrair e amplificar esses ácidos nucléicos. Você tem que proteger a amostra enquanto ela está em trânsito para a instalação de teste, e também certifique-se de que não seja infeccioso se você estiver lidando com uma doença transmissível. A fim de tornar este um teste de diagnóstico realmente fácil de usar, era importante para nós simplificar isso tanto quanto possível, "disse o co-primeiro autor Xiao Tan, M.D., Ph.D., um Pesquisador Clínico no Instituto Wyss e Instrutor de Medicina em Gastroenterologia no Hospital Geral de Massachusetts.
A equipe optou por usar saliva em vez de amostras de esfregaço nasofaríngeo como método de coleta, porque é mais fácil para os usuários coletar saliva e os estudos mostraram que o SARS-CoV-2 é detectável na saliva por um número maior de dias após a infecção. Mas a saliva não processada apresenta desafios próprios:ela contém enzimas que degradam várias moléculas, produzindo uma alta taxa de falsos positivos.
Os pesquisadores desenvolveram uma nova técnica para resolver esse problema. Primeiro, eles adicionaram dois produtos químicos chamados DTT e EGTA à saliva e aqueceram a amostra a 95 ° C por 3 minutos, que eliminou o sinal falso positivo da saliva não tratada e cortou todas as partículas virais. Eles então incorporaram uma membrana porosa que foi projetada para prender o RNA em sua superfície, que poderia finalmente ser adicionado diretamente à reação SHERLOCK para gerar um resultado.
Para integrar a preparação da amostra de saliva e a reação SHERLOCK em um diagnóstico, a equipe projetou um dispositivo simples alimentado por bateria com duas câmaras:uma câmara de preparação de amostra aquecida, e uma câmara de reação não aquecida. Um usuário cospe na câmara de preparação de amostra, liga o calor, e espera de três a seis minutos para que a saliva penetre no filtro. O usuário remove o filtro e o transfere para a coluna da câmara de reação, em seguida, empurra um êmbolo que deposita o filtro na câmara e perfura um reservatório de água para ativar a reação SHERLOCK. 55 minutos depois, o usuário olha através da janela do transiluminador colorido para a câmara de reação e confirma a presença de um sinal fluorescente. Eles também podem usar um aplicativo de smartphone que analisa os pixels sendo registrados pela câmera do smartphone para fornecer um diagnóstico claro positivo ou negativo.
Os pesquisadores testaram seu dispositivo de diagnóstico usando amostras clínicas de saliva de 27 pacientes COVID-19 e 21 pacientes saudáveis, e descobriram que miSHERLOCK identificou corretamente pacientes COVID-19 positivos 96% das vezes e pacientes sem a doença em 95% das vezes. Eles também testaram seu desempenho em relação ao Alpha, Beta, e variantes de Gamma SARS-CoV-2 por adição de saliva humana saudável com RNA viral sintético de comprimento total contendo mutações que representam cada variante, e descobriram que o dispositivo foi eficaz em uma gama de concentrações de RNA viral.
"Uma das melhores coisas sobre miSHERLOCK é que ele é totalmente modular. O dispositivo em si é separado dos ensaios, para que você possa conectar diferentes ensaios para a sequência específica de RNA ou DNA que está tentando detectar, "disse a co-primeira autora Devora Najjar, um assistente de pesquisa no MIT Media Lab e no Collins Lab. "O dispositivo custa cerca de US $ 15, mas a produção em massa reduziria a habitação para cerca de $ 3. Os ensaios para novos alvos podem ser criados em cerca de duas semanas, permitindo o rápido desenvolvimento de testes para novas variantes de COVID-19 e outras doenças. "
A equipe miSHERLOCK criou seu dispositivo com configurações de poucos recursos em mente, como a pandemia trouxe à luz as vastas desigualdades no acesso à saúde que existem entre as diferentes partes do mundo. O hardware do dispositivo pode ser construído por qualquer pessoa com acesso a uma impressora 3D, e os arquivos e projetos de circuitos estão todos disponíveis online ao público. A adição de um aplicativo para smartphone também visava configurações com recursos limitados, como o serviço de telefonia móvel está disponível virtualmente em qualquer lugar do mundo, mesmo em áreas de difícil acesso a pé. A equipe está ansiosa para trabalhar com fabricantes interessados em produzir miSHERLOCK em escala para distribuição global.
"Quando o projeto miSHERLOCK começou, quase não houve monitoramento da variante SARS-CoV-2 acontecendo. Sabíamos que o rastreamento de variantes seria extremamente importante ao avaliar os efeitos de longo prazo do COVID-19 nas comunidades locais e globais, então nos esforçamos para criar um ambiente verdadeiramente descentralizado, flexível, plataforma de diagnóstico amigável, "disse Collins, que também é o professor Termeer de Engenharia Médica e Ciências do MIT. "Ao resolver o problema de preparação da amostra, garantimos que este dispositivo esteja virtualmente pronto para os consumidores usarem como está, e estamos entusiasmados em trabalhar com parceiros industriais para disponibilizá-lo comercialmente. "
"Combinando biotecnologia de ponta com materiais de baixo custo, essa equipe criou um poderoso dispositivo de diagnóstico que pode ser fabricado e usado localmente por pessoas sem formação médica avançada. É um exemplo perfeito da missão do Wyss Institute em ação:colocar inovações transformadoras nas mãos de pessoas que precisam delas, "disse o Diretor Fundador da Wyss, Don Ingber, M.D., Ph.D., quem também é o Judah Folkman Professor de Biologia Vascular na Harvard Medical School e no Boston Children's Hospital, e Professor de Bioengenharia na Escola de Engenharia e Ciências Aplicadas de Harvard John A. Paulson.
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