Naujasis CRISPR pagrįstas diagnostinis testas nustato seilių mėginių COVID-19 variantus

„miSHERLOCK“ pašalina poreikį gabenti paciento mėginius į centralizuotą bandymų vietą ir labai supaprastina mėginio paruošimo veiksmus, greičiau suteikti pacientams ir gydytojams, tikslesnis asmens ir bendruomenės sveikatos vaizdas, kuris yra labai svarbus besivystančios pandemijos metu “.

Helena de Puig, Daktaras, Pirmasis autorius, Podoktorantė, Wyss institutas ir MIT

Diagnostikos prietaisas aprašytas šiandien paskelbtame dokumente Mokslo pažanga .

Nuo tiekimo grandinės iki SHERLOCK

Būdamas Bostono vaikų ligoninės pediatrijos instruktorius, kurio specializacija - infekcinės ligos, bendraautorė Rose Lee, M.D. daugiau nei metus dirba prie COVID-19 pandemijos fronto linijų. Jos patirtis klinikoje įkvėpė projektą, kuris galiausiai taps miSHERLOCK.

„Paprasti dalykai, kurie anksčiau buvo visur ligoninėje, kaip nosiaryklės tamponai, staiga buvo sunku gauti, todėl įprastos mėginių apdorojimo procedūros buvo sutrikdytos, kuri yra didelė problema pandemijos sąlygomis, “ - sakė Lee, kuris taip pat yra vizituojantis bendradarbis Wyss institute. „Mūsų komandos motyvas šiam projektui buvo pašalinti šias kliūtis ir pateikti tikslią COVID-19 diagnostiką, mažiau priklausant nuo pasaulinių tiekimo grandinių, ir taip pat galėtų tiksliai aptikti pradėtus atsirasti variantus “.

Dėl jų diagnostikos SARS-CoV-2 aptikimo dalies, grupė kreipėsi į CRISPR pagrįstą technologiją, sukurtą Wyss pagrindinio fakulteto nario ir vyresniojo popieriaus autoriaus Jimo Collinso laboratorijoje, Ph.D. vadinamas „specifiniu didelio jautrumo fermentiniu reporterio atrakinimu“ (SHERLOCK). „SHERLOCK“ naudoja CRISPR „molekulines žirkles“, kad nukirptų DNR ar RNR tam tikrose vietose, su papildoma premija:šio tipo žirklės taip pat pjauna kitus DNR gabalus aplinkinėje aplinkoje, leidžianti jį sukonstruoti naudojant nukleorūgščių zondo molekules, kad būtų sukurtas signalas, rodantis, kad taikinys buvo sėkmingai supjaustytas.

Mokslininkai sukūrė SHERLOCK reakciją, skirtą SARS-CoV-2 RNR pjaustymui konkrečiame geno, vadinamo nukleoproteinu, regione, kuris yra išsaugotas daugelyje viruso variantų. Kai molekulinės žirklės - fermentas, vadinamas Cas12a - sėkmingai prisijungia ir nukerpia nukleoproteinų geną, taip pat supjaustomi vienos grandinės DNR zondai, skleidžia fluorescencinį signalą. Jie taip pat sukūrė papildomus „SHERLOCK“ tyrimus, skirtus „Spike“ baltymų sekų virusinių mutacijų grupei, atstovaujančiai trims SARS-CoV-2 genetiniams variantams:alfa, Beta, ir gama.

Apsiginklavę tyrimais, galinčiais patikimai aptikti viruso RNR priimtinose FDA patvirtintų diagnostinių tyrimų koncentracijos ribose, toliau komanda sutelkė savo pastangas į tai, kas, be abejo, yra sunkiausias diagnostikos uždavinys:mėginio paruošimas.

Nerija, laukti, nuskaityti

„Kai bandote mėginį dėl nukleorūgščių [pvz., DNR ar RNR], norint paruošti mėginį, reikia atlikti daugybę veiksmų, kad galėtumėte iš tikrųjų išgauti ir sustiprinti tas nukleorūgštis. Turite apsaugoti mėginį, kol jis vežamas į bandymų centrą, taip pat įsitikinkite, kad jis nėra užkrečiamas, jei susiduriate su užkrečiama liga. Kad tai būtų tikrai lengvai naudojamas diagnostinis testas, mums buvo svarbu tai kiek įmanoma supaprastinti, “-sakė pirmasis autorius Xiao Tanas, M. D., Daktaras, Wyss instituto klinikinis bendradarbis ir Masačusetso bendrosios ligoninės gastroenterologijos medicinos instruktorius.

Komanda rinkimo metodu pasirinko seilių, o ne nosiaryklės tepinėlių mėginius, nes vartotojams lengviau surinkti seiles, o tyrimai parodė, kad SARS-CoV-2 galima aptikti seilėse daugiau dienų po infekcijos. Tačiau neapdorotos seilės kelia savo iššūkių:jose yra fermentų, kurie skaido įvairias molekules, sukuria daug klaidingų teigiamų rezultatų.

Mokslininkai sukūrė naują šios problemos sprendimo būdą. Pirmas, jie į seiles pridėjo dvi chemines medžiagas, vadinamas DTT ir EGTA, ir mėginį 3 minutes kaitino iki 95 ° C, kuris pašalino klaidingą teigiamą signalą iš neapdorotų seilių ir supjaustė visas viruso daleles. Tada jie įdėjo akytą membraną, kuri buvo sukurta taip, kad sulaikytų RNR ant jo paviršiaus, kuris pagaliau galėtų būti tiesiogiai pridėtas prie SHERLOCK reakcijos, kad būtų sukurtas rezultatas.

Norėdami integruoti seilių mėginio paruošimą ir SHERLOCK reakciją į vieną diagnostiką, komanda sukūrė paprastą baterijomis maitinamą įrenginį su dviem kameromis:šildoma mėginio paruošimo kamera, ir nešildoma reakcijos kamera. Vartotojas spjauna į mėginio paruošimo kamerą, įjungia šilumą, ir laukia nuo trijų iki šešių minučių, kol seilės patenka į filtrą. Vartotojas išima filtrą ir perkelia jį į reakcijos kameros koloną, tada stumia stūmoklį, kuris nusėda filtrą į kamerą ir pradurta vandens rezervuarą, kad suaktyvintų SHERLOCK reakciją. Po 55 minučių, vartotojas žiūri pro tamsintą peršviečiančio lango langą į reakcijos kamerą ir patvirtina, kad yra fluorescencinis signalas. Jie taip pat gali naudoti pridedamą išmaniojo telefono programą, kuri analizuoja išmaniojo telefono kameros užregistruotus pikselius, kad būtų galima aiškiai nustatyti teigiamą ar neigiamą diagnozę.

Mokslininkai išbandė savo diagnostikos prietaisą, naudodami klinikinius seilių mėginius iš 27 COVID-19 pacientų ir 21 sveiko paciento, ir nustatė, kad miSHERLOCK teisingai nustatė COVID-19 teigiamus pacientus 96 proc. Jie taip pat išbandė savo veikimą prieš alfa, Beta, ir gama SARS-CoV-2 variantai, pripildę sveikų žmogaus seilių viso ilgio sintetine virusine RNR, turinčia mutacijų, atspindinčių kiekvieną variantą, ir nustatė, kad prietaisas buvo veiksmingas įvairiose virusų RNR koncentracijose.

"Vienas iš puikių" miSHERLOCK "dalykų yra tai, kad jis yra visiškai modulinis. Pats prietaisas yra atskiras nuo tyrimų, kad galėtumėte prijungti skirtingus konkrečios RNR ar DNR sekos tyrimus, kuriuos bandote aptikti, “-sakė bendraautorė Devora Najjar, mokslinių tyrimų asistentas MIT Media Lab ir Collins Lab. „Įrenginys kainuoja apie 15 USD, tačiau masinė gamyba sumažintų būstą iki maždaug 3 USD. Naujų tikslų tyrimai gali būti sukurti maždaug per dvi savaites, leidžianti greitai sukurti naujų COVID-19 ir kitų ligų variantų testus “.

Pasiruošę realiam pasauliui

„MiSHERLOCK“ komanda sukūrė savo įrenginį, atsižvelgdama į mažai išteklių turinčius nustatymus, kadangi pandemija išryškino didžiulę sveikatos priežiūros prieigos nelygybę tarp skirtingų pasaulio vietų. Įrenginio aparatinę įrangą gali sukurti kiekvienas, turintis prieigą prie 3D spausdintuvo, failai ir schemų schemos yra viešai prieinamos internete. Pridėjus išmaniojo telefono programą taip pat buvo siekiama ribotų išteklių nustatymų, mobiliųjų telefonų paslauga yra prieinama beveik bet kurioje pasaulio vietoje, net tose vietose, kurias sunku pasiekti pėsčiomis. Komanda nori dirbti su gamintojais, kurie nori gaminti „miSHERLOCK“ plačiu mastu pasauliniam platinimui.

„Kai prasidėjo„ miSHERLOCK “projektas, beveik nebuvo stebimas SARS-CoV-2 variantas. Žinojome, kad variantų stebėjimas bus neįtikėtinai svarbus vertinant ilgalaikį COVID-19 poveikį vietos ir pasaulio bendruomenėms, todėl mes stengėmės sukurti tikrai decentralizuotą, lankstus, patogi diagnostikos platforma, “, - sakė Collinsas. kuris taip pat yra Termeer medicinos inžinerijos ir mokslo profesorius MIT. "Išspręsdami mėginio paruošimo problemą, įsitikinome, kad šis įrenginys yra beveik paruoštas, kad vartotojai galėtų jį naudoti, ir džiaugiamės galėdami bendradarbiauti su pramonės partneriais, kad jie būtų komerciškai prieinami “.

„Derinant pažangiausias biotechnologijas su nebrangiomis medžiagomis, ši komanda sukūrė galingą diagnostikos prietaisą, kurį vietiniu lygiu gali gaminti ir naudoti žmonės, neturintys pažangių medicinos laipsnių. Tai puikus Wyss instituto misijos pavyzdys:perduoti gyvenimą keičiančias naujoves žmonėms, kuriems jų reikia, “, - sakė„ Wyss “įkūrėjas Donas Ingberis. M. D., Daktaras, kas taip pat yra Judah Folkman kraujagyslių biologijos profesorius Harvardo medicinos mokykloje ir Bostono vaikų ligoninėje, ir Harvardo Johno A. Paulsono inžinerijos ir taikomųjų mokslų mokyklos bioinžinerijos profesorius.

• Naujas stalinis prietaisas gali greitai aptikti SARS-CoV-2 iš seilių mėginių
• Mobilioji intervencinė insulto komanda keliauja pas pacientus, kad greičiau pasiektų chirurginį gydymą