Nový diagnostický test na báze CRISPR detekuje varianty COVID-19 zo vzoriek slín

Vďaka variantu Delta spôsobuje zmätok neočkované populácie a prípady COVID-19, ktoré sa šíria po celom svete, pandémia sa ešte zďaleka neskončila. Napriek pôsobivo rýchlemu vývoju diagnostických testov SARS-CoV-2 za posledný rok a pol, drvivá väčšina vzoriek pacientov musí byť stále odoslaná do laboratória na spracovanie, čo spomaľuje tempo sledovania prípadov COVID-19. Ak sa má vzorka testovať na konkrétny variant vírusu, musí byť geneticky sekvenovaný, čo si vyžaduje ešte viac času a zdrojov.

Teraz, vedci z Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering na Harvardskej univerzite, Massachusettský technologický inštitút (MIT), a niekoľko nemocníc v Bostone vytvorilo lacné, Diagnostický test založený na CRISPR, ktorý umožňuje užívateľom testovať sa na SARS-CoV-2 a viacerých variantoch vírusu pomocou vzorky slín doma, bez potreby ďalšieho prístrojového vybavenia.

Diagnostické zariadenie, s názvom Minimal Instrumented SHERLOCK (miSHERLOCK), je ľahko použiteľný a poskytuje výsledky, ktoré je možné prečítať a overiť pomocou sprievodnej aplikácie pre smartfóny do jednej hodiny. V experimentoch úspešne rozlíšil tri rôzne varianty SARS-CoV-2, a dá sa rýchlo prekonfigurovať, aby zistil ďalšie varianty ako Delta. Zariadenie je možné zostaviť pomocou 3D tlačiarne a bežne dostupných komponentov za približne 15 dolárov, a opätovné použitie hardvéru znižuje náklady na jednotlivé testy až na 6 dolárov za kus.

miSHERLOCK eliminuje potrebu transportu vzoriek pacientov na centralizované testovacie miesto a výrazne zjednodušuje kroky na prípravu vzoriek, poskytnutie pacientov a lekárov rýchlejšie, presnejší obraz o zdraví jednotlivcov a komunity, čo je kritické počas vyvíjajúcej sa pandémie. “

Helena de Puig, Ph.D., Spoluautor prvého diela, Postdoktorand, Wyss Institute a MIT

Diagnostické zariadenie je popísané v článku, ktorý bol dnes uverejnený v Pokroky vo vede .

Od dodávateľského reťazca po SHERLOCK

Ako inštruktor pediatrie v detskej nemocnici v Bostone so špecializáciou na infekčné choroby spoluautorka prvej knihy Rose Lee, M.D. pracuje na prvých líniách pandémie COVID-19 viac ako rok. Jej skúsenosti na klinike poskytli inšpiráciu pre projekt, z ktorého sa nakoniec stane miSHERLOCK.

„Jednoduché veci, ktoré bývali v nemocnici všadeprítomné, ako tampóny z nosohltanu, zrazu bolo ťažké ich získať, takže rutinné postupy spracovania vzoriek boli narušené, čo je v pandemickom prostredí veľký problém, “povedal Lee, ktorý je tiež hosťujúcim členom Wyss Institute. „Motiváciou nášho tímu pre tento projekt bolo odstrániť tieto úzke miesta a poskytnúť presnú diagnostiku ochorenia COVID-19 s menšou závislosťou od globálnych dodávateľských reťazcov, a mohol tiež presne zistiť varianty, ktoré sa začali objavovať. “

Pokiaľ ide o diagnostický kus SARS-CoV-2, skupina sa obrátila na technológiu založenú na CRISPR vytvorenú v laboratóriu člena Wyss Core Faculty a hlavného autora príspevku Jima Collinsa, Ph.D. nazývané „odblokovanie špecifického enzymatického reportéra s vysokou citlivosťou“ (SHERLOCK). SHERLOCK používa „molekulárne nožnice“ spoločnosti CRISPR na strihanie DNA alebo RNA na konkrétnych miestach, s ďalším bonusom:tento špecifický typ nožníc strihá aj ďalšie kúsky DNA v okolí, čo umožňuje jeho inžinierstvo s molekulami sondy nukleovej kyseliny na produkciu signálu naznačujúceho, že cieľ bol úspešne prerezaný.

Vedci vytvorili reakciu SHERLOCK navrhnutú na rezanie SARS-CoV-2 RNA v špecifickej oblasti génu nazývaného nukleoproteín, ktorý je konzervovaný vo viacerých variantoch vírusu. Keď sa molekulárne nožnice - enzým nazývaný Cas12a - úspešne naviaže na nukleoproteínový gén a prestrihne ho, rezajú sa aj jednoreťazcové sondy DNA, vytvára fluorescenčný signál. Tiež vytvorili ďalšie testy SHERLOCK navrhnuté tak, aby sa zamerali na panel vírusových mutácií v proteínových sekvenciách Spike, ktoré predstavujú tri genetické varianty SARS-CoV-2:Alpha, Beta, a Gamma.

Vyzbrojení testami, ktoré by mohli spoľahlivo detegovať vírusovú RNA v prijateľnom rozsahu koncentrácie pre diagnostické testy schválené FDA, tím ďalej zameral svoje úsilie na vyriešenie pravdepodobne najťažšej úlohy v diagnostike:príprava vzorky.

Pľuvať, počkaj, skenovanie

„Keď testujete vzorku nukleových kyselín [ako DNA alebo RNA], existuje mnoho krokov, ktoré musíte urobiť na prípravu vzorky, aby ste mohli tieto nukleové kyseliny skutočne extrahovať a amplifikovať. Vzorku musíte chrániť počas prepravy do testovacieho zariadenia, a tiež sa uistite, že nie je infekčný, ak máte do činenia s prenosnou chorobou. Aby bol tento diagnostický test skutočne ľahko použiteľným, bolo pre nás dôležité, aby sme to čo najviac zjednodušili, “povedal spoluautor prvého diela Xiao Tan, M.D., Ph.D., klinický pracovník Wyss Institute a inštruktor medicíny v gastroenterológii vo všeobecnej nemocnici Massachusetts.

Tím sa rozhodol použiť ako spôsob zberu vzorky slín než vzorky z nosohltanového tampónu, pretože je pre používateľov jednoduchšie zbierať sliny a štúdie ukázali, že SARS-CoV-2 je v slinách detegovateľný väčší počet dní po infekcii. Nespracované sliny však predstavujú svoje vlastné výzvy:obsahujú enzýmy, ktoré degradujú rôzne molekuly, produkuje vysoký podiel falošných poplachov.

Vedci vyvinuli novú techniku ​​na vyriešenie tohto problému. Najprv, do slín pridali dve chemikálie nazývané DTT a EGTA a vzorku zahrievali 3 minúty na 95 ° C, ktorý eliminoval falošne pozitívny signál z neošetrených slín a rozrezal všetky vírusové častice. Potom začlenili poréznu membránu, ktorá bola navrhnutá tak, aby zachytávala RNA na svojom povrchu, ktoré by nakoniec mohli byť pridané priamo k reakcii SHERLOCK na generovanie výsledku.

Ak chcete integrovať prípravu vzorky slín a reakciu SHERLOCK do jednej diagnostiky, tím navrhol jednoduché zariadenie napájané batériami s dvoma komorami:vyhrievaná komora na prípravu vzoriek, a nevykurovanú reakčnú komoru. Používateľ vyplivne do komory na prípravu vzoriek, zapne teplo, a čaká tri až šesť minút, kým sa sliny nasýtia do filtra. Užívateľ odstráni filter a prenesie ho do stĺpca reakčnej komory, potom zatlačí piest, ktorý uloží filter do komory a prepichne zásobník vody, aby sa aktivovala reakcia SHERLOCK. O 55 minút neskôr, užívateľ sa pozrie cez zafarbené okienko transiluminátora do reakčnej komory a potvrdí prítomnosť fluorescenčného signálu. Môžu tiež použiť sprievodnú aplikáciu pre smartfóny, ktorá analyzuje pixely zaznamenávané fotoaparátom smartfónu, aby poskytli jasnú pozitívnu alebo negatívnu diagnózu.

Vedci testovali svoje diagnostické zariadenie pomocou vzoriek klinických slín od 27 pacientov s COVID-19 a 21 zdravých pacientov, a zistil, že miSHERLOCK správne identifikoval pacientov pozitívnych na COVID-19 v 96% prípadov a pacientov bez ochorenia v 95% prípadov. Tiež testovali jeho výkon proti Alpha, Beta, a varianty Gamma SARS-CoV-2 navýšením zdravých ľudských slín syntetickými vírusovými RNA obsahujúcimi mutácie plnej dĺžky predstavujúce každý variant, a zistil, že zariadenie je účinné v celom rozsahu koncentrácií vírusovej RNA.

„Jednou z veľkých vecí na miSHERLOCK je, že je úplne modulárny. Samotné zariadenie je oddelené od testov, takže môžete zapojiť rôzne testy pre konkrétnu sekvenciu RNA alebo DNA, ktorú sa pokúšate zistiť, “uviedla spoluautorka prvej knihy Devora Najjarová, výskumný asistent v mediálnom laboratóriu MIT a v laboratóriu Collins. „Zariadenie stojí asi 15 dolárov, ale sériová výroba by znížila bývanie na približne 3 doláre. Testy na nové ciele je možné vytvoriť približne za dva týždne, čo umožňuje rýchly vývoj testov na nové varianty COVID-19 a ďalších chorôb. “

Pripravený na skutočný svet

Tím miSHERLOCK vytvoril svoje zariadenie s ohľadom na nastavenia nízkych zdrojov, keďže pandémia odhalila obrovské nerovnosti v prístupe k zdravotnej starostlivosti, ktoré existujú medzi rôznymi časťami sveta. Hardvér zariadenia môže postaviť ktokoľvek s prístupom k 3D tlačiarni, a návrhy súborov a obvodov sú verejne dostupné online. Pridanie aplikácie pre smartfóny bolo zamerané aj na nastavenia obmedzené na zdroje, keďže služba mobilných telefónov je k dispozícii prakticky kdekoľvek na svete, aj v oblastiach, kam sa pešo ťažko dostanete. Tím sa teší na spoluprácu s výrobcami, ktorí majú záujem vyrábať miSHERLOCK vo veľkom pre globálnu distribúciu.

„Keď sa projekt miSHERLOCK začal, takmer žiadne variantné monitorovanie SARS-CoV-2 sa nedialo. Vedeli sme, že sledovanie variantov bude pri hodnotení dlhodobých účinkov COVID-19 na miestne a globálne komunity veľmi dôležité. tak sme sa tlačili k vytvoreniu skutočne decentralizovaného, flexibilný, užívateľsky prívetivá diagnostická platforma, “povedal Collins, ktorý je tiež termeerským profesorom lekárskeho inžinierstva a vedy na MIT. "Vyriešením problému s prípravou vzorky zaistili sme, že toto zariadenie je prakticky pripravené na to, aby ho spotrebitelia mohli používať tak, ako sú, a sme nadšení, že môžeme spolupracovať s priemyselnými partnermi, aby bol komerčne dostupný. “

„Kombináciou špičkovej biotechnológie s lacnými materiálmi tento tím vytvoril výkonné diagnostické zariadenie, ktoré môžu vyrábať a používať na miestnej úrovni ľudia bez pokročilých lekárskych diplomov. Je to perfektný príklad misie Wyss Institute v praxi:vložiť inovácie, ktoré menia život, do rúk ľudí, ktorí ich potrebujú, “povedal zakladajúci riaditeľ Wyss Don Ingber, M.D., Ph.D., kto je tiež Judah Folkman profesor cievnej biológie na Harvardskej lekárskej škole a Bostonskej detskej nemocnici, a profesor bioinžinierstva na Harvardskej John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences.

• Nové stolové zariadenie dokáže rýchlo detekovať SARS-CoV-2 zo vzoriek slín
• Mobilný tím pre intervenčnú mŕtvicu cestuje k pacientom, aby poskytli rýchlejší prístup k chirurgickej liečbe