Il nuovo test diagnostico basato su CRISPR rileva le varianti di COVID-19 dai campioni di saliva

Con la variante Delta che sta seminando il panico tra le popolazioni non vaccinate e i casi di COVID-19 in aumento in tutto il mondo, la pandemia è tutt'altro che finita. Nonostante lo sviluppo straordinariamente rapido dei test diagnostici SARS-CoV-2 nell'ultimo anno e mezzo, la stragrande maggioranza dei campioni dei pazienti deve ancora essere inviata a un laboratorio per l'elaborazione, che rallenta il ritmo del monitoraggio dei casi di COVID-19. Se un campione deve essere testato per una specifica variante del virus, deve essere sequenziato geneticamente, che richiede ancora più tempo e risorse.

Ora, ricercatori del Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering dell'Università di Harvard, il Massachusetts Institute of Technology (MIT), e diversi ospedali della zona di Boston hanno creato un economico, Test diagnostico basato su CRISPR che consente agli utenti di testarsi per SARS-CoV-2 e più varianti del virus utilizzando un campione della loro saliva a casa, senza bisogno di strumentazione aggiuntiva.

Il dispositivo diagnostico, chiamato SHERLOCK minimamente strumentato (miSHERLOCK), è facile da usare e fornisce risultati che possono essere letti e verificati da un'app per smartphone in dotazione entro un'ora. Ha distinto con successo tre diverse varianti di SARS-CoV-2 negli esperimenti, e può essere rapidamente riconfigurato per rilevare varianti aggiuntive come Delta. Il dispositivo può essere assemblato utilizzando una stampante 3D e componenti comunemente disponibili per circa $ 15, e il riutilizzo dell'hardware riduce il costo dei singoli test a $ 6 ciascuno.

miSHERLOCK elimina la necessità di trasportare i campioni dei pazienti in una postazione di analisi centralizzata e semplifica notevolmente le fasi di preparazione del campione, dando a pazienti e medici un più veloce, quadro più accurato della salute individuale e comunitaria, che è fondamentale durante una pandemia in evoluzione".

Helena de Puig, dottorato di ricerca, Co-primo autore, Borsista postdottorato, Wyss Institute e MIT

Il dispositivo diagnostico è descritto in un articolo pubblicato oggi in Progressi scientifici .

Dalla filiera a SHERLOCK

In qualità di istruttore di pediatria presso il Boston Children's Hospital con specializzazione in malattie infettive, co-prima autrice Rose Lee, Da oltre un anno M.D. lavora in prima linea contro la pandemia di COVID-19. Le sue esperienze nella clinica hanno fornito l'ispirazione per il progetto che alla fine sarebbe diventato miSHERLOCK.

"Cose semplici che erano onnipresenti in ospedale, come tamponi nasofaringei, erano improvvisamente difficili da ottenere, così le procedure di routine di elaborazione dei campioni sono state interrotte, che è un grosso problema in un contesto di pandemia, " ha detto Lee, che è anche Visiting Fellow presso il Wyss Institute. "La motivazione del nostro team per questo progetto era eliminare questi colli di bottiglia e fornire una diagnostica accurata per COVID-19 con meno dipendenza dalle catene di approvvigionamento globali, e poteva anche rilevare con precisione le varianti che stavano iniziando ad emergere".

Per il pezzo di rilevamento SARS-CoV-2 della loro diagnostica, il gruppo si è rivolto a una tecnologia basata su CRISPR creata nel laboratorio del membro della Wyss Core Faculty e autore senior di articoli Jim Collins, dottorato di ricerca chiamato "sblocco del reporter enzimatico specifico ad alta sensibilità" (SHERLOCK). SHERLOCK utilizza le "forbici molecolari" di CRISPR per tagliare DNA o RNA in punti specifici, con un ulteriore vantaggio:questo specifico tipo di forbici taglia anche altri pezzi di DNA nell'area circostante, permettendogli di essere ingegnerizzato con molecole di sonda di acido nucleico per produrre un segnale che indica che il bersaglio è stato tagliato con successo.

I ricercatori hanno creato una reazione SHERLOCK progettata per tagliare l'RNA SARS-CoV-2 in una regione specifica di un gene chiamato nucleoproteina che è conservata in più varianti del virus. Quando le forbici molecolari - un enzima chiamato Cas12a - si lega e taglia con successo il gene della nucleoproteina, vengono tagliate anche le sonde di DNA a singolo filamento, producendo un segnale fluorescente. Hanno anche creato ulteriori test SHERLOCK progettati per colpire un pannello di mutazioni virali nelle sequenze proteiche Spike che rappresentano tre varianti genetiche SARS-CoV-2:Alpha, Beta, e Gamma.

Armati di test in grado di rilevare in modo affidabile l'RNA virale entro l'intervallo di concentrazione accettato per i test diagnostici autorizzati dalla FDA, il team ha poi concentrato i propri sforzi sulla risoluzione di quella che è probabilmente la sfida più difficile nella diagnostica:la preparazione del campione.

Sputo, aspettare, scansione

"Quando stai testando un campione per gli acidi nucleici [come DNA o RNA], ci sono molti passaggi che devi fare per preparare il campione in modo da poter effettivamente estrarre e amplificare quegli acidi nucleici. Devi proteggere il campione mentre è in transito verso la struttura di analisi, e assicurati anche che non sia infettivo se hai a che fare con una malattia trasmissibile. Per rendere questo test diagnostico veramente facile da usare, era importante per noi semplificare il più possibile, " ha detto il co-primo autore Xiao Tan, M.D., dottorato di ricerca, un Clinical Fellow presso il Wyss Institute e Istruttore di Medicina in Gastroenterologia presso il Massachusetts General Hospital.

Il team ha scelto di utilizzare la saliva anziché i campioni di tampone nasofaringeo come metodo di raccolta, perché è più facile per gli utenti raccogliere la saliva e gli studi hanno dimostrato che SARS-CoV-2 è rilevabile nella saliva per un numero maggiore di giorni dopo l'infezione. Ma la saliva non trattata presenta sfide a sé stante:contiene enzimi che degradano varie molecole, producendo un alto tasso di falsi positivi.

I ricercatori hanno sviluppato una nuova tecnica per risolvere questo problema. Primo, hanno aggiunto alla saliva due sostanze chimiche chiamate DTT ed EGTA e hanno riscaldato il campione a 95 ° C per 3 minuti, che ha eliminato il segnale di falso positivo dalla saliva non trattata e ha aperto a fette eventuali particelle virali. Hanno quindi incorporato una membrana porosa che è stata progettata per intrappolare l'RNA sulla sua superficie, che potrebbe infine essere aggiunto direttamente alla reazione SHERLOCK per generare un risultato.

Per integrare la preparazione del campione di saliva e la reazione SHERLOCK in un'unica diagnostica, il team ha progettato un semplice dispositivo alimentato a batteria con due camere:una camera di preparazione del campione riscaldata, e una camera di reazione non riscaldata. Un utente sputa nella camera di preparazione del campione, accende il calore, e aspetta dai tre ai sei minuti che la saliva penetri nel filtro. L'utente rimuove il filtro e lo trasferisce alla colonna della camera di reazione, quindi spinge uno stantuffo che deposita il filtro nella camera e fora un serbatoio d'acqua per attivare la reazione SHERLOCK. 55 minuti dopo, l'utente guarda attraverso la finestra colorata del transilluminatore nella camera di reazione e conferma la presenza di un segnale fluorescente. Possono anche utilizzare un'app per smartphone di accompagnamento che analizza i pixel registrati dalla fotocamera dello smartphone per fornire una diagnosi chiara positiva o negativa.

I ricercatori hanno testato il loro dispositivo diagnostico utilizzando campioni clinici di saliva di 27 pazienti COVID-19 e 21 pazienti sani, e ha scoperto che miSHERLOCK ha identificato correttamente i pazienti positivi al COVID-19 il 96% delle volte e i pazienti senza la malattia il 95% delle volte. Hanno anche testato le sue prestazioni contro l'Alpha, Beta, e le varianti Gamma SARS-CoV-2 aggiungendo alla saliva umana sana RNA virale sintetico a tutta lunghezza contenente mutazioni che rappresentano ciascuna variante, e ha scoperto che il dispositivo era efficace in una gamma di concentrazioni di RNA virale.

"Una delle grandi cose di miSHERLOCK è che è completamente modulare. Il dispositivo stesso è separato dai test, in modo da poter collegare diversi test per la sequenza specifica di RNA o DNA che stai cercando di rilevare, ", ha affermato la co-prima autrice Devora Najjar, un assistente di ricerca presso il MIT Media Lab e nel Collins Lab. "Il dispositivo costa circa $ 15, ma la produzione di massa ridurrebbe le abitazioni a circa 3 dollari. I test per nuovi target possono essere creati in circa due settimane, consentendo il rapido sviluppo di test per nuove varianti di COVID-19 e altre malattie".

Pronto per il mondo reale

Il team di miSHERLOCK ha creato il proprio dispositivo pensando alle impostazioni a bassa risorsa, poiché la pandemia ha portato alla luce le vaste disuguaglianze nell'accesso all'assistenza sanitaria che esistono tra le diverse parti del mondo. L'hardware del dispositivo può essere costruito da chiunque abbia accesso a una stampante 3D, e i file e i progetti dei circuiti sono tutti pubblicamente disponibili online. L'aggiunta di un'app per smartphone mirava anche a impostazioni con risorse limitate, poiché il servizio di telefonia mobile è disponibile praticamente ovunque nel mondo, anche in zone difficilmente raggiungibili a piedi. Il team è desideroso di lavorare con produttori interessati a produrre miSHERLOCK su larga scala per la distribuzione globale.

"Quando è iniziato il progetto miSHERLOCK, non si è verificato quasi alcun monitoraggio della variante SARS-CoV-2. Sapevamo che il monitoraggio delle varianti sarebbe stato incredibilmente importante nella valutazione degli effetti a lungo termine del COVID-19 sulle comunità locali e globali, quindi ci siamo spinti a creare un ambiente veramente decentralizzato, flessibile, piattaforma diagnostica di facile utilizzo, " disse Collins, che è anche il Termeer Professor of Medical Engineering &Science al MIT. "Risolvendo il problema della preparazione del campione, ci siamo assicurati che questo dispositivo fosse virtualmente pronto per l'uso da parte dei consumatori così com'è, e siamo entusiasti di lavorare con partner industriali per renderlo disponibile in commercio".

"Combinando biotecnologie all'avanguardia con materiali a basso costo, questo team ha creato un potente dispositivo diagnostico che può essere prodotto e utilizzato a livello locale da persone senza titoli di studio medico avanzati. È un perfetto esempio della missione del Wyss Institute in azione:mettere le innovazioni che cambiano la vita nelle mani delle persone che ne hanno bisogno, ", ha affermato il direttore fondatore di Wyss Don Ingber, M.D., dottorato di ricerca, chi è anche il Judah Folkman Professore di Biologia Vascolare alla Harvard Medical School e al Boston Children's Hospital, e Professore di Bioingegneria presso la Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences.

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