Uusi CRISPR-pohjainen diagnostinen testi havaitsee COVID-19-variantit syljenäytteistä

miSHERLOCK eliminoi tarpeen kuljettaa potilasnäytteet keskitettyyn testauspaikkaan ja yksinkertaistaa huomattavasti näytteen valmistusvaiheita, nopeuttaa potilaita ja lääkäreitä, tarkempi kuva yksilön ja yhteisön terveydestä, mikä on kriittistä muuttuvan pandemian aikana. "

Helena de Puig, Ph.D., Ensimmäinen kirjoittaja, Tutkijatohtori, Wyss Institute ja MIT

Diagnostiikkalaite on kuvattu artikkelissa, joka julkaistiin tänään Tiede etenee .

Toimitusketjusta SHERLOCKiin

Lastentautien ohjaajana Bostonin lastensairaalassa, joka on erikoistunut tartuntatauteihin, toinen kirjailija Rose Lee, M.D. on työskennellyt COVID-19-pandemian etulinjoilla yli vuoden. Hänen kokemuksensa klinikalla antoivat inspiraatiota hankkeelle, josta tulee lopulta miSHERLOCK.

"Yksinkertaisia ​​asioita, jotka olivat ennen kaikkialla sairaalassa, kuten nenänielun vanupuikot, oli yhtäkkiä vaikea saada, niin rutiininomaiset näytteenkäsittelymenettelyt keskeytyivät, mikä on suuri ongelma pandemiaympäristössä, "sanoi Lee, joka on myös vieraileva jäsen Wyss -instituutissa. "Tiimimme motiivi tässä hankkeessa oli poistaa nämä pullonkaulat ja tarjota tarkka diagnoosi COVID-19:lle riippumatta vähemmän globaaleista toimitusketjuista, ja pystyi myös havaitsemaan tarkasti alkavat muodot. "

Niiden diagnostiikan SARS-CoV-2-tunnistuskappaleen osalta, ryhmä kääntyi CRISPR-pohjaisen tekniikan puoleen, joka luotiin Wyss Core Faculty -jäsenen ja vanhemman paperikirjailijan Jim Collinsin laboratoriossa, Ph.D. nimeltään "erityinen herkkä entsymaattinen reportterin lukituksen avaus" (SHERLOCK). SHERLOCK käyttää CRISPR:n "molekyylisaksia" katkaistakseen DNA:ta tai RNA:ta tietyissä paikoissa, lisäbonuksella:tämä erityinen sakset leikkaa myös muita DNA -paloja ympäröivällä alueella, jonka avulla se voidaan suunnitella nukleiinihappokoettimolekyyleillä tuottamaan signaali, joka osoittaa, että kohde on leikattu onnistuneesti.

Tutkijat loivat SHERLOCK-reaktion, joka oli suunniteltu leikkaamaan SARS-CoV-2-RNA:ta tietyllä geenin nimeltä Nucleoprotein, joka on säilynyt useissa viruksen muunnelmissa. Kun molekyylisakset - Cas12a -niminen entsyymi - sitoutuvat ja leikkaa onnistuneesti nukleoproteiinigeenin, myös yksijuosteiset DNA-koettimet leikataan, tuottaa fluoresoivaa signaalia. He loivat myös muita SHERLOCK-määrityksiä, joiden tarkoituksena on kohdistaa virusmutaatioiden paneeli Spike-proteiinisekvensseissä, jotka edustavat kolmea SARS-CoV-2-geneettistä varianttia:alfa, Beeta, ja gamma.

Varustettu määrityksillä, jotka voisivat luotettavasti havaita viruksen RNA:n FDA:n hyväksymien diagnostisten testien hyväksytyillä pitoisuusalueilla, Seuraavaksi tiimi keskittyi ratkaisuun, joka on epäilemättä vaikein diagnostiikan haaste:näytteen valmistelu.

Sylkeä, odota, skannata

"Kun testat näytettä nukleiinihappojen [kuten DNA:n tai RNA:n] suhteen, näytteen valmistelu edellyttää monia vaiheita, jotta voit itse erottaa ja monistaa nämä nukleiinihapot. Sinun on suojattava näyte, kun se kuljetetaan testauslaitokseen, ja myös varmista, että se ei ole tarttuva, jos sinulla on tarttuva tauti. Jotta tämä olisi todella helppokäyttöinen diagnostiikkatesti, meidän oli tärkeää yksinkertaistaa sitä mahdollisimman paljon, "sanoi ensimmäinen kirjoittaja Xiao Tan, M.D., Ph.D., kliininen tutkija Wyss -instituutissa ja lääketieteen opettaja gastroenterologiassa Massachusetts General Hospitalissa.

Tiimi päätti käyttää keräysmenetelmänä sylkeä kuin nenänielun vanupuikkonäytteitä, koska käyttäjien on helpompi kerätä sylkeä ja tutkimukset ovat osoittaneet, että SARS-CoV-2 on havaittavissa sylkeä useamman päivän ajan tartunnan jälkeen. Käsittelemätön sylki tuo kuitenkin omat haasteensa:se sisältää entsyymejä, jotka hajottavat erilaisia ​​molekyylejä, tuottaa paljon vääriä positiivisia.

Tutkijat ovat kehittäneet uuden tekniikan ongelman ratkaisemiseksi. Ensimmäinen, he lisäsivät kaksi kemikaalia nimeltä DTT ja EGTA sylkeen ja kuumennettiin näyte 95 ° C:seen 3 minuutin ajan, joka eliminoi väärän positiivisen signaalin käsittelemättömästä syljestä ja viipaloi kaikki viruspartikkelit. Sitten ne sisälsivät huokoisen kalvon, joka on suunniteltu vangitsemaan RNA sen pinnalle, joka lopulta voitaisiin lisätä suoraan SHERLOCK -reaktioon tuloksen aikaansaamiseksi.

Jotta syljenäytteen valmistelu ja SHERLOCK -reaktio voidaan yhdistää yhteen diagnostiikkaan, tiimi suunnitteli yksinkertaisen akkukäyttöisen laitteen, jossa on kaksi kammiota:lämmitetty näytteen valmistuskammio, ja lämmittämätön reaktiokammio. Käyttäjä sylkee näytteen valmistuskammioon, kytkee lämmön päälle, ja odottaa kolmesta kuuteen minuuttiin, että sylki imeytyy suodattimeen. Käyttäjä poistaa suodattimen ja siirtää sen reaktiokammion pylvääseen, painaa sitten mäntää, joka suodattaa suodattimen kammioon ja lävistää vesisäiliön aktivoidakseen SHERLOCK -reaktion. 55 minuuttia myöhemmin, käyttäjä katsoo sävytetyn läpikuultavan ikkunan läpi reaktiokammioon ja vahvistaa fluoresoivan signaalin läsnäolon. He voivat myös käyttää mukana tulevaa älypuhelinsovellusta, joka analysoi älypuhelimen kameran rekisteröimät pikselit saadakseen selvän positiivisen tai negatiivisen diagnoosin.

Tutkijat testasivat diagnostista laitettaan käyttäen kliinisiä syljenäytteitä 27 COVID-19-potilaalta ja 21 terveeltä potilaalta, ja havaitsi, että miSHERLOCK tunnisti COVID-19-positiiviset potilaat oikein 96% ajasta ja potilaat, joilla ei ollut tautia, 95% ajasta. He testasivat sen suorituskykyä myös alfaa vastaan, Beeta, ja Gamma SARS-CoV-2 -variantit lisäämällä terveen ihmisen sylkeä täyspitkällä synteettisellä viruksen RNA:lla, joka sisältää mutaatioita, ja havaitsi, että laite oli tehokas useilla virus -RNA -pitoisuuksilla.

"Yksi miSHERLOCKin hienoista puolista on, että se on täysin modulaarinen. Laite itse on erillinen määrityksistä, joten voit liittää eri määrityksiä tiettyyn RNA- tai DNA -sekvenssiin, jonka yrität havaita, "sanoi ensimmäinen kirjoittaja Devora Najjar, tutkimusassistentti MIT Media Labissa ja Collins Labissa. "Laite maksaa noin 15 dollaria, mutta massatuotanto alentaisi asunnon noin 3 dollariin. Uusien kohteiden määritykset voidaan luoda noin kahdessa viikossa, mahdollistavat testien nopean kehittämisen COVID-19:n ja muiden sairauksien uusille muunnelmille. "

Valmis todelliseen maailmaan

MiSHERLOCK-tiimi loi laitteensa vähäresursseiset asetukset mielessä, koska pandemia on tuonut esiin valtavan eriarvoisuuden terveydenhuollon saatavuudessa, joka vallitsee eri puolilla maailmaa. Laitteen laitteiston voivat rakentaa kaikki, joilla on pääsy 3D -tulostimeen, ja tiedostot ja piirimallit ovat kaikki julkisesti saatavilla verkossa. Älypuhelinsovelluksen lisääminen tähtää myös resurssien rajallisiin asetuksiin, Matkapuhelinpalvelu on saatavilla lähes kaikkialla maailmassa, jopa alueilla, joihin on vaikea päästä kävellen. Tiimi on innokas työskentelemään valmistajien kanssa, jotka ovat kiinnostuneita miSHERLOCKin tuottamisesta maailmanlaajuisesti.

"Kun miSHERLOCK -projekti alkoi, SARS-CoV-2-varianttien seurantaa ei juuri tapahtunut. Tiesimme, että varianttiseurannasta tulee uskomattoman tärkeää arvioitaessa COVID-19:n pitkän aikavälin vaikutuksia paikallisiin ja maailmanlaajuisiin yhteisöihin, joten halusimme luoda todella hajautetun, joustava, käyttäjäystävällinen diagnostiikka-alusta, "sanoi Collins, joka on myös Termeerin lääketieteen tekniikan ja tieteen professori MIT:ssä. "Ratkaisemalla näytteen valmistusongelman, olemme varmistaneet, että tämä laite on käytännössä valmis kuluttajien käyttöön sellaisenaan, ja olemme innoissamme voidessamme tehdä yhteistyötä teollisten kumppaneiden kanssa saadaksemme sen kaupallisesti saataville. "

"Yhdistämällä edistyksellisen biotekniikan edullisiin materiaaleihin, Tämä tiimi on luonut tehokkaan diagnostiikkalaitteen, jonka voivat valmistaa ja käyttää paikallistasolla ihmiset, joilla ei ole pitkää lääketieteellistä tutkintoa. Se on täydellinen esimerkki Wyss-instituutin tehtävästä:antaa elämää muuttavat innovaatiot niitä tarvitsevien ihmisten käsiin, "sanoi Wyssin perustajajohtaja Don Ingber, M.D., Ph.D., joka on myös Juuda Folkman Verisuonibiologian professori Harvardin lääketieteellisessä koulussa ja Bostonin lastensairaalassa, ja biotekniikan professori Harvardin John A.Paulsonin teknillisen ja ammattikorkeakoulun koulussa.

• Uusi pöytälaite tunnistaa nopeasti SARS-CoV-2:n syljenäytteistä
• Mobiili interventiohoitoryhmä matkustaa potilaiden luo nopeamman kirurgisen hoidon saamiseksi