abstraktné
Four-plietol G-kvartet DNA sekundárne štruktúry boli v nedávnej dobe vizualizovať v jadrách ľudských kultivovaných buniek. Tu ukazujeme, že BG4, protilátka G-kvartet špecifická, môže byť použitá na farbenie DNA G-kvadruplexy v tkanivách pacientov odvodené pomocou imunohistochémia. Pozorujeme významne zvýšené množstvo G-kvartet-pozitívnych jadier v ľudskej rakoviny pečene a žalúdka v porovnaní s pozadím nenádorových tkanív. Naše výsledky naznačujú, že tvorba G-kvartet môže byť detekovaný a meraný v materiáli pacienta odvodené, a že zvýšená G-kvartet formácie môže byť charakteristická niektorých druhov rakoviny
Citácia :. Biffy G, Tannahill D, J Miller, Howat WJ, Balasubramanian S (2014) Zvýšené hladiny G-kvartet formácie v ľudskom žalúdku a pečene rakovinové tkanive. PLoS ONE 9 (7): e102711. doi: 10,1371 /journal.pone.0102711
Editor: Mark Isalan, Imperial College London, Veľká Británia
prijatá: May 28, 2014; Prijaté: 23. júna 2014; Uverejnené: 17.července 2014
Copyright: © 2014 Biffy et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané
Dostupné dát: Text. autori potvrdzujú, že všetky údaje súvisiace závery sú plne k dispozícii bez obmedzenia. Všetky relevantné údaje sú v papiera a jeho podporné informácie súbory
Financovanie :. Autori ďakujú Cancer Research UK o grant programu (C9681 /A11961) a jadra inštitucionálneho financovania na Balasubramanian laboratória, a PhD štipendium pre GB (http://www.cancerresearchuk.org). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu
Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú
Úvod
Non-kánonický G-kvartet DNA sekundárne štruktúry môžu byť vytvorené z guanínu bohatých sekvencií DNA typu G 3 + N L1 G 3 + N L2 G 3 + N L3 G 3+ (N = akákoľvek báza a L = slučka) a také sekvenčné motívy sú prevláda v ľudskom genóme [1], [2]. G-kvadruplexy sú štyri dvojvláknové štruktúry, ktoré obsahujú stohy tetrads vytvorených prostredníctvom Hoogsteenovo vodíkovou väzbou štyroch guanín koordinovaných centrálnom jednomocné katión [3]. Oligonukleotidy skladané do štruktúry G-kvartet in vitro
majú vysokú termodynamickú stabilitu za podmienok blízkych fyziologických podmienok v súlade s ich vzniku v bunkách [4]. Predpokladaná poloha G-kvartet sekvenčných motívov v regulačných oblastí genómu, ako sú napríklad promótory a teloméry, naznačuje, že G-kvadruplexy môžu mať dôležitú úlohu vo funkcii genómu [5] - [7]. Rad helikáz, že G ak kvadruplexů boli identifikované a sú vyslovená hypotéza, prispievať k normálnej genómu funkcií, ako je replikácie, transkripcie a udržiavanie stability genómu [8]. Vizualizácia DNA G-kvadruplexy v ľudských bunkách podporuje existenciu G-kvadruplexů v genóme [9]. V týchto experimentoch, je vysoko selektívny G-kvartet-špecifická protilátka (BG4) bol vytvorený fágového displeja a použité pre vizualizáciu diskrétne ložiská G-kvadruplexy v jadrách ľudských tkanív kultúre bunkových línií. Táto protilátka poskytla príležitosť k sonde bunkovú úlohe G-kvadruplexů a tiež ich možnému zapojenie do choroby.
G-kvadruplexy boli navrhnuté byť spájaný s bunkovými funkciami ako replikáciu a transkripciu. Napríklad stabilizácia G-kvartet malú molekulou môžu potláčať transkripciu niektorých onkogénov a /alebo vyvolanie poškodenia DNA v telomér a onkogény vedúce k replikáciu vady a smrť buniek [10] - [17]. G-kvadruplexy môže byť tiež spojená s genómu nestabilitu a G-kvartet sekvenčné motívy boli nájdené proximálnej k DNA zlomových bodov a miest somatických počet kópií sa mení nájsť v niektorých druhov rakoviny [18], [19]. Helikáz že vyrieši G-kvadruplexů sa nachádzajú tiež lokalizované v miestach genómu nestability [20] - [22], a ochorenia, ako je Bloom je aj Wernerova syndrómov, ktoré vykazujú vyššiu úroveň genómu nestability a predispozíciou k rakovine, ktoré prispievajú mutácie G -quadruplex-riešenie helikázy [23].
s ohľadom na potenciálne vzťah medzi G-kvartet štruktúr a ľudských ochorení, je dôležitým cieľom riešiť, či G-kvadruplexy môžu byť detekované v ľudských tkanivách. Preto sme skúmali detekciu DNA G-kvadruplexů v pacientom odvodené tkanív a či existujú rozdiely v úrovni G-kvartet medzi non-neoplastických a nádorového tkaniva. Použitím protilátky G-kvartet špecifické, BG4, v imunohistochémia formalínom fixovaných parafínových (FFPE) mikroskopické sústavy tkanív sekcií, sme zistili rozsiahle DNA tvorbu G-kvartet v jadrách ľudských tkanív. Kvantifikácia BG4-pozitívnych bunkových jadier odhalila rozsiahlejšie tvorbu G-kvadruplexy v žalúdku a pečene nádorov v porovnaní s odpovedajúcou pozadí nenádorových tkanív. Tieto výsledky naznačujú, že spracovanie G-kvartet štruktúr je zle regulovaný v niektorých ľudských nádorov.
Rozhodli sme sa, aby sa preukázala prítomnosť G-kvadruplexů v jadrách človeka tkaniva a skúmať, či prípadné rozdiely sú zrejmé v rakovinových tkanivách pacienta pôvodu. Náš prístup bol založený na detekciu nukleárnych G-kvadruplexů imunohistochemicky (IHC) s G-quadruplex-špecifické protilátky, BG4, na non-neoplastických a rakovinových microarrays tkanív (TMA). Špecifickosť a selektivitu BG4 pre G-kvadruplexy a aplikácie BG4 v imunofluorescencie (IF) mikroskopie na ľudských bunkách už boli popísané [9]. Ak chcete zistiť vhodnosť BG4 pre IHC, sme prvýkrát testovali túto protilátku v modelovom systéme pomocou úsekov od FFPE bunkových peliet z MDA-MB-231 buniek rakoviny prsníka, ktoré boli predtým pozorovali zobraziť jadrovú G-kvartet ohniská IF mikroskopie [9] , Ako epitopové vyhľadávanie, a to buď tepelne-sprostredkované (v citrátovom založené na pH 6,0 alebo Tris /EDTA založené na pH 9,0 pufre) alebo enzymatickou (s proteináza K), je často nutné vystaviť antigénne miesta pred viazanie protilátky, porovnali sme tieto tri štandardné epitop prieskumovej pre-ošetrenie. Po inkubácii BG4, farbenie bolo vykonané inkubáciou so sekundárnou protilátkou proti FLAG, ktorá rozpoznáva epitop FLAG tag prítomné v BG4 protilátky, nasledované chrenovej peroxidáze detekcie na báze polyméru Leica za použitia farbenia platformu Bond IHC. V nadväznosti na tento protokol, intenzívne nukleárna farbenie bol pozorovaný u BG4 až po epitopové vyhľadávania (obrázok 1B a S1). Žiadne farbenie bol pozorovaný v neprítomnosti predbežného ošetrení (obrázok 1A) a kontrol vykonaných v neprítomnosti BG4 ukázala, že epitop načítanie pufrom citrát báze sa získa menšie pozadie, ako je s Tris /EDTA (obrázok 1C a S1), zatiaľ čo pre -treatment sa proteináza k viedla k nešpecifickej nukleárnej farbenie aj v neprítomnosti BG4 (obr S1). Okrem toho, po epitopu vyhľadávanie s citrátom alebo Tris /EDTA nárazníky, liečba DNase Aj pred BG4 farbenie viedlo k silnému zníženiu BG4 jadrovej intenzity signálu (obrázok 1D a S1), ďalej potvrdzuje detekciu DNA G-kvadruplexů. Nukleárna BG4 signál je vidieť na IHC je v súlade s predchádzajúcim detekciu BG4 ohnísk v jadrách buniek tkanivovej kultúry [9].
Potom, čo bol vytvorený protokol pre IHC BG4, najprv potvrdil, že biopsia non-neoplastických humánnych vzorky tkaniva by mohla byť zafarbené za použitia BG4. Všeobecne platí, že sme pozorovali rôzne BG4 farbenie vzory v mnohých tkanivách, čo naznačuje, rozdiely v tvorbe G-kvadruplexů medzi tkanivami, a tiež medzi bunkami v rámci jednej tkaniva (obr S2). Tieto výsledky ukazujú, že celková tvorba DNA G-kvadruplexů v zložitých ľudských tkanivách môže byť hodnotená za použitia BG4 v IHC, čím sa predlžuje vizualizáciu G-kvadruplexy než IF mikroskopie v bunkách tkanivovej kultúry. V predbežnom prieskume BG4 farbenie na rakovinových tkanivách v porovnaní s pozadím non-neoplastické tkanive, rozdiely v intenzite alebo distribúcie BG4 farbenie sa objavili predovšetkým nepresvedčivé (dáta nie sú uvedené), a v mnohých prípadoch starostlivý kvantifikácia nebolo možné kvôli značným rozdielom v morfológiu a prítomnosť rôznych typov buniek na malígne proti non-neoplastické tkaniva. Naproti tomu u pečene a žalúdka, naše predbežné skúšky naznačujú, že tieto tkanivá boli ľahko merateľné v dôsledku jednotnejší vzhľad v rámci i medzi non-neoplastických a nádorového tkaniva. Preto sme použili Aperio Imagescope Nuclear (V9) pre analýzu obrazu softvér pre kvantifikáciu percenta BG4-pozitívnych jadier prítomných v TMA. Samostatná analýza obrazu triedič vyvinul pre každý typ tkaniva presne identifikovať a samostatné dojemné objektov, s malígny a nenádorových vzorky zaznamenal za použitia rovnakých parametrov pre presné porovnanie. Pozoruhodné je, že v deviatich prípadoch, pre ktoré sme mali duplicitné rakovina pečene TMA jadra s zodpovedajúce uzavreté pozadí non-neoplastické tkanivá odobraté z rovnakého pacienta, sme pozorovali oveľa väčší počet BG4-pozitívnych jadier v rakovine (priemer 60,3 ± 5,4%) v porovnaní nenádorových (priemer 18,3 ± 2,12%), tkanivové vzorky (obrázok 2). Keď boli skúmané jednotlivé rakovinové fenotypy, sme zistili, že obaja hepatocelulárny karcinóm (HCC) a intrahepatálna cholangiokarcinom (ICC) ukázala významne väčšie nukleárnej farbenie BG4 v porovnaní s non-neoplastické tkaniva (obrázok 2A-D a G). Aj keď HCC a ICC majú rôzne bunkové pôvodu, ktorý vychádza hepatocytov alebo žlčových ciest cholangiocytes v tomto poradí, a to ako ukázala väčší počet a intenzitu BG4-pozitívnych jadier v porovnaní s non-neoplastické tkaniva pečene. Okrem toho, v metastáz (izolované z veľkých buniek nediferencovaných pľúcneho karcinómu miest) zvýšenie BG4-pozitívne farbenie sa tiež poznamenať, (obr 2E-G). Pozorovali sme jasné rozdiely medzi non-neoplastických a nádorové tkanivá pre rad rôznych prípadov pacientov. V skutočnosti, širší záberom analýza nádorových a nenádorových pozadia TMA jadier vrátane otvorených prípadov opäť ukázali zvýšenie BG4-pozitívnych jadier cez HCC, ICC a metastatickým karcinómom (obrázok 3A). Keď boli všetky prípady posudzované spoločne, zvýšenie ~ 2.4-krát v počte BG4-pozitívnych jadier bola pozorovaná u rakoviny pečene v porovnaní s non-neoplastické tkaniva. (P 0,001, Obrázok 3B)
, ktorá je podobná zvýšenie incidencie G-quadruplex v rakoviny pečene tkanive, je väčšia ako 3-násobné zvýšenie počtu BG4-pozitívnych jadier bola pozorovaná v žalúdku adenokarcinómu a karcinómu pečatný krúžok buniek v porovnaní s pozadím nenádorových tkanív odobratých z rovnakého jedinca (obr 4). Širší rozmedzí-analýza na rakovinu žalúdka a nenádorových tkanív, vrátane otvorených prípadov potvrdila zvýšenie počtu BG4-pozitívnych jadier pozorovaných u karcinómu žalúdka v porovnaní s non-neoplastické tkaniva (obrázok 5). Naozaj, v individuálnom rakovinu žalúdka podtypy, adenokarcinóm (vznikania od žľazového epitelu), karcinómy pečatný prsteň buniek (adenokarcinómy charakterizované mucín depozície) a zažívacom strómovými tumorom (GIST, KIT expresiou sarkómy mezenchymálnych pôvodu), všetci prejavili väčší počet BG4-pozitívnych jadier v porovnaní s non-neoplastické tkaniva žalúdka (obrázok 5A). Keď boli všetky prípady považované spoločne, ~ 3.1-krát viac BG4-pozitívnych jadier boli nájdené v karcinómu v porovnaní s non-neoplastických tkanív (Obrázok 5B, p 0,001). Je pozoruhodné, že niekoľko žalúdočné nádorové podtypy, ktoré majú rôzne etiológie a progresie, sú charakterizované nárastom BG4 farbenie. Tieto výsledky sú preto veľmi podnetný, ktoré majú všeobecnú súvislosť medzi zvýšenou prítomnosťou G-kvartet štruktúr a vzniku rakoviny žalúdka.
V pečene a žalúdka TMA, niektoré rakovina tkaniva jadier vykazovali malé alebo žiadne merateľné BG4 farbenie, možno odráža problém v stability epitopu v priebehu chirurgického odberu biopsia alebo alternatívne smerujúce k skutočnému variability tvorby G-quadruplex v týchto konkrétnych tkanivách. Treba však poznamenať, že v žiadnom prípade nejaká nenádorových pečene a žalúdka tkanivo značne BG4-pozitívne. Tento druhý pozorovanie ďalej potvrdzuje, že zvýšenie počtu BG4-pozitívnych buniek, ktoré znázorňujú jadra rakovina TMA odráža skutočný rozdiel v G-quadruplex prítomnosti medzi non-neoplastických a malígnych stavov. Analýza G-quadruplex farbenie v iných zhubných nádorov môže teda byť možné a naša Predbežná analýza pankreasu tkaniva naznačuje, že, zatiaľ čo BG4 farbenie v non-neoplastických pankreasu je rozšírená, je ~ 1.6-násobné zvýšenie BG4 nukleárnej farbenie v adenokarcinómu tkanivách ( P <. 0,01, obr S3)
Celkovo naše výsledky preukazujúce, že G-kvadruplexy možno vizualizovať pomocou IHC v non-neoplastických a rakovinou ľudských tkanív rozšíriť našej skoršie zistenia, ktorá preukázala prítomnosť G-kvadruplexy v jadra kultúra bunkových línií [9]. Je pozoruhodné, že sme pozorovali zvýšenie počtu G-kvartet-pozitívnych buniek u niektorých rakovinových tkanivách v porovnaní s non-neoplastických prípadoch. Údaje, ktoré predstavujeme, samy o sebe vysvetliť, prečo stále viac G-kvadruplexy sú zjavné v prípadoch žalúdku a pečene rakoviny. Avšak, existuje niekoľko línií dôkazov v literatúre, ktoré naznačujú potenciálne združenie či kauzálnu spojenie medzi G-kvadruplexů a mechanizmy, ktoré prispievajú k rozvoju rakoviny alebo progresie. Napríklad G-kvadruplexy, pokiaľ nie je vyriešený počas replikácie DNA, môže predstavovať krehké stránky, ktoré podporujú genómu nestabilitu, čo je dobre známy znakom rakoviny [24]. V skutočnosti, G-kvartet sekvenčné motívy sú k dispozícii na DNA, Hraničné hodnoty, ktoré vedú k presuny v rámci génu BCL2 v lymfómy a v rámci génu HOX11 v T-bunkovej leukémie [25], [26]. Výpočtové analýzy tiež navrhli prípadné združenia G-kvadruplexů a zarážky regióny rôznych druhov rakoviny [19].
Predpokladáme, že nárast genómových G-kvadruplexů u karcinómu môže vzniknúť mutácií enzýmov, ktoré spracúvajú G-kvadruplexů a /alebo genomické nestability na G-kvartet miest. Napríklad, Fanconiho anémia, Bloom a Wernerovho syndrómy, všetci displej genóm nestabilita s predispozíciou k rakovine [27] - [29] a výsledkom mutácií v DNA helikáza enzýmy, ktoré majú G-kvartet vymiznú aktivitu [30] - [32] , Nedávne štúdie celého genómu tiež zdôraznili uznanie G-kvartet sekvencií ďalšími riešiacich helikáz ako je ATRX, PIF1 a XPB /D [20] - [22]. Okrem toho, PIF1 bolo navrhnuté na potlačenie genómovej nestabilite na G-kvadruplexů [22], zatiaľ čo strata ATRX je spojená s chromozomálne nestability v pankreatických neuroendokrinných nádorov [33], a XPD mutácie narušiť nukleotidové vyrezanie reparácia DNA, ktorá vedie k nádorových ochorení náchylné takých ako Xeroderma pigmentosum [34].
Zdá sa, že pečeň a karcinóm žalúdka sú veľmi heterogénne a nie sú charakterizované spoločným genetickým podpise alebo vysoko zastúpené hnacou mutácií, ktoré môžu jednoducho vysvetliť pozorovaný nárast G-kvadruplexy , Zatiaľ čo mnoho pečene rakoviny sú spojené s hepatitídou B alebo C, patologický informácie získané s TMA znamená, že neexistuje žiadna korelácia s BG4 farbenia. V rámci ďalšej práce, bude to mať hodnotu k analýze non-neoplastických a malígnych nádorových vzoriek pre prípady, keď bol použitý celý genóm sekvenovania pre objasnenie genetické pozadie nádorových /non-neoplastických pary, za účelom stanovenia vzťahu medzi genotypom a G-quadruplex tvorby rakoviny.
na záver, nám uvádza použitie protilátky G-quadruplex špecifické, BG4, v IHC farbenie experimentoch ľudských non-neoplastických a nádorového tkaniva. Táto štúdia nám umožnila identifikovať výrazne vyššiu prítomnosť DNA G-kvartet štruktúr v jadrách žalúdku a rakoviny pečene bunky v porovnaní so zodpovedajúcimi normálnom tkanive. Predpokladáme, že tieto rozdiely môžu byť závislé na zmenách bunkovej procesy, ktoré regulujú genómu stabilitu alebo zmeny v stave chromatínu na G-kvartet miest v nádorových tkanivách. Naše výsledky podporujú možnosť, že rakovinové bunky môžu poskytnúť okno selektívnosti, ktoré by vďaka ktorým sú citlivejšie ako non-nádorových buniek voči malá molekula G-kvartet cielenie stratégie.
Fixácia, vkladanie, krájanie a farbenie bunkovej pelety boli vykonané základné služby histopatológie v Cancer Research UK Cambridge Institute. Imunohistochémia (IHC) bola vykonaná s použitím štandardných metód na automatizovanom Leica Bond platformy s menšími variáciami. V stručnosti, tkanivá boli fixované po dobu 24 hodín pri izbovej teplote (RT) v 10% neutrálnom formalínu pufrovaného a spracované za použitia tkanivového procesora Leica ASP300 s de-hydratačné prostredníctvom triedeného radu etanolu, zúčtovanie v xyléne a infiltráciu roztaveným parafínom. Vloženie bola vykonaná na Vkladanie stanice Leica EG1160 a rezy boli narezané na 3 um mikrotómy, plávajúce na vodnej kúpeľov nastavenú na ~ 45-50 ° C do hladkej a ploché, pred odberom na mikroskopickom sklíčku a sušením pri 60 ° C, po dobu 1 hodiny. De-voskovanie a re-hydratačný boli vykonané za použitia automatizovaného Leica ST5020 Multistainer. MDA-MB-231 bunky adenokarcinómu ľudského prsníka boli získané z ATCC LGC štandardov. Pre bunkové pelety MDA-MB-231, vyhľadávanie epitopu bola vykonaná pri teplote 100 ° C počas 20 minút s vyhľadávacím Bond epitop roztoku 1 (citrát na báze pufri o pH 6,0) alebo Bond vyhľadávacím epitop roztoku 2 (Tris /EDTA na báze pufor pH 9,0) alebo pri teplote 37 ° C počas 10 minút sa súpravou Bond enzým predprípravy (100 ug /ml proteinázy k v Tris-pufrovanom fyziologickom roztoku, povrchovo aktívneho činidla a 0,35% ProClin 950) na nájdenie najlepšieho stavu. Komerčne dostupné Tkanivové ľudských so zodpovedajúcimi etického schválenie v krajine pôvodu boli zakúpené od firmy Insight Bio Veľkej Británii (pre americkú Biomax Inc. polí) a BioCat, Nemecku alebo Stretton Scientific, UK (pre Accumax, Isu Abxis polí). Epitop vyhľadávania bola vykonávaná pri teplote 100 ° C počas 20 minút s citrátovom tlmivom roztoku. BG4 farbenie bolo vykonané pri izbovej teplote na automatizovanom Leica Bond nástroje s králičie polyméru kit (Leica) po 15 min inkubácie s BG4 a 8 min inkubácie s anti-FLAG králičie polyklonálne protilátky (Cell Signaling Technology). Sklíčka bola kontrastne potom po dobu 5 minút s 0,02% hematoxylínom pre vizualizáciu bunková jadra. De-hydratačný a zúčtovanie boli vykonávané na automatickom Leica ST5020 Multistainer, a montáž sa vykonáva na automatizovanom sklo coverslipper Leica CV5030. Sklíčka boli skenované pomocou skenovacieho slide systému Aperio XT120 (Leica) a obrazy analyzované s použitím softvéru Aperio Imagescope Nuclear v9. Štatistické analýzy a hodnoty P boli vypočítané za použitia t test. Frekvencia-distribučné grafy boli vynesené za použitia GraphPad Prism (GraphPad Software).
Ľudia verzus vírusy - Môžeme sa v blízkej budúcnosti vyhnúť vyhynutiu?
Závažné komplikácie COVID-19 súvisiace s poruchou črevnej bariéry
Superbug E. coli šíriaca sa zlou hygienou toalety,
Domáce psy pravdepodobne neprenášajú SARS-CoV-2,
Antioxidanty v strave môžu zvýšiť riziko rakoviny čriev,
Označenie potenciálnych molekulárnych prediktorov reakcie na biologické terapie pri ulceróznej kolitíde
Diagnostika vírusových infekcií pomocou mikro a nanorozmerných technológií
Potreba celej populácie, rýchly, citlivý, a nákladovo efektívne diagnostické testovanie sa výrazne zvýšilo v dôsledku závažného akútneho respiračného syndrómu koronavírusu 2 (SARS-CoV-2), pôvodca koro
Strata mikrobiómu pri použití antibiotík ovplyvňuje reakciu na očkovaciu látku proti chrípke
Každý žijúci človek má v tráviacom trakte trilióny mikróbov, a viac ako 400 druhov baktérií v črevách, viac ako počet buniek v tele. Normálna črevná flóra je dôležitá pre udržanie eubiózy, mikrobiálna
Rastlinná strava by mohla vyliečiť vašu reumatoidnú artritídu
Podľa najnovšej recenzie zavedenie rastlinnej stravy by mohlo zmierniť opuchnuté kĺby a bolesť pri reumatoidnej artritíde (RA). RA je autoimunitného pôvodu, bolestivá kĺbová porucha spôsobená zápalo