PLoS ONE: Erhöhte Werte von G-Quadruplexbildung in menschlichen Magen und Leber-Krebs-Gewebe

Abstrakt

viersträngige G-Quadruplex-DNA-Sekundärstrukturen haben vor kurzem in den Kernen der menschlichen kultivierten Zellen sichtbar gemacht worden. Hier zeigen wir, dass BG4, ein G-Quadruplex-spezifischen Antikörper können verwendet werden, um DNA-G-Quadruplex-Strukturen in Patienten stammenden Gewebe färben Immunhistochemie. Wir beobachten eine signifikant erhöhte Anzahl von G-Quadruplex-positive Kerne in menschlichen Krebserkrankungen der Leber und des Magens im Vergleich zu Hintergrund nicht-neoplastischen Gewebe. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass G-Quadruplexbildung erkannt und in Patienten stammende Material und das erhöhte G-Quadruplexbildung ein Merkmal einiger Krebsarten gemessen werden kann

Citation. Biffi G, D Tannahill, Miller J, Howat WJ, Balasubramanian S (2014) erhöhte Werte von G-Quadruplexbildung in menschlichen Magen und Leber-Krebs-Gewebe. PLoS ONE 9 (7): e102711. doi: 10.1371 /journal.pone.0102711

Editor: Mark Isalan, Imperial College London, Vereinigtes Königreich

Empfangen: 28. Mai 2014; Akzeptiert: 23. Juni 2014; Veröffentlicht am: 17. Juli 2014

Copyright: © 2014 Biffi et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Datenverfügbarkeit. Die Autoren bestätigen, dass alle Daten, die Ergebnisse sind in vollem Umfang zur Verfügung, ohne Einschränkung zu Grunde liegen. Alle relevanten Daten sind in der Papier und seine Hintergrundinformationen Dateien

Finanzierung:. Die Autoren Cancer Research UK für Programm Zuschuss (C9681 /A11961) und Kern der institutionellen Förderung zur Balasubramanian Labor danken, und für einen PhD studentship für GB (http://www.cancerresearchuk.org). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

nicht-kanonischer G-Quadruplex-DNA-Sekundärstrukturen können aus guaninreichen DNA-Sequenzen des Typs G _{3 + N L1 G 3 + N L2 G gebildet werden 3 + N L3 G 3 + (N = eine beliebige Base und L = Schleife) und solche Sequenzmotive sind weit verbreitet im gesamten menschlichen Genom [1], [2]. G-Quadruplex sind viersträngige Strukturen, die durch eine zentrale einwertiges Kation koordiniert durch Hoogsteen Wasserstoffbrücken von vier Guanine gebildeten Stapel von Tetraden umfassen [3]. Oligonukleotide in eine Struktur G-Quadruplex gefaltet In-vitro-
haben eine hohe thermodynamische Stabilität unter nahezu physiologischen Bedingungen im Einklang mit ihrer Bildung in Zellen [4]. Die vorhergesagte Lage von G-Quadruplex-Sequenzmotive in regulatorischen Regionen des Genoms, wie Promotoren und Telomere, legt nahe, dass G-Quadruplex-Strukturen eine wichtige Rolle in der Genomfunktion haben können [5] - [7]. Eine Anzahl von Helikasen, die G-Quadruplexen lösen wurden identifiziert und werden die Hypothese zu normalen Genoms Funktionen wie Replikation, Transkription und der Aufrechterhaltung der Genomstabilität [8] beizutragen. Die Visualisierung von DNA G-Quadruplex-Strukturen in menschlichen Zellen hat die Existenz von G-Quadruplexen im Genom unterstützt [9]. In diesen Experimenten wurde ein hochselektiver G-Quadruplex-spezifischen Antikörper (BG4) wurde durch Phagen-Display erzeugt und verwendet, um diskrete Foci von G-Quadruplex-Strukturen in den Kernen von menschlichen Gewebekulturzelllinien sichtbar zu machen. Dieser Antikörper hat eine Gelegenheit, die zelluläre Rolle der G-Quadruplexe und auch ihre mögliche Beteiligung an Krankheit zu untersuchen.}

G-Quadruplex-Strukturen wurden mit zellulären Funktionen wie Replikation und Transkription vorgeschlagen in Verbindung gebracht werden. Beispielsweise G-Quadruplex Stabilisierung durch ein kleines Molekül Transkription bestimmter Onkogene unterdrücken kann und /oder DNA-Schäden an Telomeren und Onkogenen induzieren führende Defekte und Zelltod Replikation [10] - [17]. G-Quadruplexstrukturen auch verknüpft sein können, Instabilität und G-Quadruplex-Sequenzmotive wurden proximal DNA Stützpunkte und Websites von somatischen Kopienzahl ändert sich in verschiedenen Krebsarten gesehen [18], [19] gefunden haben, um Genoms. Helikasen, die G-Quadruplexe lösen sind auch an den Standorten der Genominstabilität [20] lokalisiert gefunden - [22], und Krankheiten wie Bloom und Werner-Syndrom, die ein höheres Maß an Genominstabilität zeigen und eine Prädisposition für Krebs, haben einen Beitrag Mutationen in G -quadruplex-Lösung Helikasen [23].

das Potential Beziehung zwischen G-Quadruplex-Strukturen und menschliche Krankheit gegeben, ist es ein wichtiges Ziel, zu klären, ob G-Quadruplexe in menschlichen Geweben nachgewiesen werden kann. Wir untersuchten daher den Nachweis von DNA-G-Quadruplexen in Patienten stammenden Gewebe und ob es Unterschiede in G-Quadruplex Niveaus zwischen nicht-neoplastische und Krebsgeweben. Durch Verwendung des G-Quadruplex-spezifischen Antikörper, BG4, in der Immunhistochemie mit Paraffin eingebettetem (FFPE) Gewebemikroarray-Sektionen in Formalin fixierten, wir haben weit verbreitete DNA G-Quadruplex-Bildung in den Kernen von menschlichen Geweben nachgewiesen. Quantifizierung von BG4-positive Zellkerne zeigte, weitergehende Bildung von G-Quadruplex-Strukturen in Magen- und Leberkrebs im Vergleich zu den entsprechenden Hintergrund nicht-neoplastischen Geweben. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Verarbeitung von G-Quadruplex-Strukturen ist falsch geregelt in einigen Krebserkrankungen des Menschen.

Ergebnisse und Diskussion

Wir setzen, um das Vorhandensein von G-Quadruplexe in den Kernen von Mensch zu demonstrieren und Geweben zu untersuchen, ob irgendwelche Unterschiede ohne weiteres ersichtlich sind in Patienten stammKrebsGewebe. Unser Ansatz basiert auf der Detektion von Kern G-Quadruplexen durch Immunhistochemie (IHC) mit dem G-Quadruplex-spezifischen Antikörper, BG4, auf nicht-neoplastische und Krebsgewebe-Mikroarrays (TMAs). Die Spezifität und Selektivität von BG4 für G-Quadruplex-Strukturen und die Anwendung von BG4 in Immunofluoreszenz (IF) Mikroskopie auf menschliche Zellen zuvor beschrieben worden sind [9]. Um die Eignung von BG4 für IHC bestimmen, die wir getestet erste Antikörper in einem Modellsystem unter Verwendung von Abschnitten aus FFPE Zellpellets von MDA-MB-231 Brustkrebszellen, die zuvor beobachtet wurden, die Kern G-Quadruplex Brennpunkte von IF-Mikroskopie zeigen [9] . Als Epitopdemaskierung entweder Wärme vermittelte (in Citrat-basierten pH-Wert 6,0 oder Tris /EDTA-basierte pH 9,0 Puffer) oder enzymatische (mit Proteinase K), erforderlich ist oft Antigenstellen freizulegen, bevor Antikörper-Bindung verglichen wir diese drei Standard Epitop Retrieval Vorbehandlungen. , Gefolgt von Leica Meerrettich-Peroxidase-Polymer-basierte Erkennung mit Hilfe der Bond IHC-Färbung Plattform Nach BG4 Inkubation Färbung wurde durch Inkubation mit einem sekundären anti-FLAG-Antikörper durchgeführt, der in der BG4 Antikörper ein FLAG-Tag-Epitop erkennt. Nach diesem Protokoll wurde intensiv Kernfärbung mit BG4 beobachtet erst nach Epitopdemaskierung (1B und S1). Keine Färbung wurde in Abwesenheit der Vorbehandlung (1A) und Kontrollen in Abwesenheit von BG4 beobachtet zeigte, dass Epitopdemaskierung mit Citrat-basierten Puffer gab weniger Hintergrund als die mit Tris /EDTA (1C und S1), während pre -Behandlung mit Proteinase K zu unspezifischen Kernfärbung führte sogar in Abwesenheit von BG4 (Abbildung S1). Darüber hinaus wurde nach Epitopdemaskierung mit Citrat- oder Tris /EDTA-Puffer, DNase I-Behandlung vor BG4 führte Färbung zu einer starken Reduktion der BG4 Kernsignalintensität (1D und S1), das weiterhin den Nachweis von DNA-G-Quadruplexen bestätigt. Das Kern BG4 Signal in IHC gesehen ist mit der früheren Erkennung von BG4 Brennpunkte in den Kernen von Gewebekulturzellen konsistent [9].

ein IHC-Protokoll für BG4 Nachdem festgestellt wurde, wir bestätigt zunächst, dass biopsiertem nichtneoplastische Menschen Gewebeproben können unter Verwendung von BG4 gefärbt werden. Im allgemeinen wir beobachtet variiert BG4 Färbungsmuster in vielen Geweben Unterschiede in der Bildung von G-Quadruplexen zwischen Geweben vorgeschlagen und auch zwischen den Zellen innerhalb des gleichen Gewebes (Abbildung S2). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Gesamt Bildung von DNA-G-Quadruplexe in komplexen menschlichen Geweben kann mit BG4 in IHC bewertet werden, wodurch die Erweiterung der Visualisierung von G-Quadruplexstrukturen über IF-Mikroskopie in Gewebekulturzellen. In einer vorläufigen Erhebung von BG4 Färbung auf Krebsgewebe im Vergleich zu Hintergrund nicht-neoplastischem Gewebe, Unterschiede in BG4 Färbeintensität oder Verteilung erschienen meist nicht schlüssig (Daten nicht gezeigt), und in vielen Fällen strenge Quantifizierung nicht möglich war, aufgrund signifikanter Unterschiede in Morphologie und Vorhandensein von mehreren Zelltypen in malignen versus nicht-neoplastischem Gewebe. Im Gegensatz dazu ist für Leber und Magen, vorgeschlagen unsere vorläufigen Prüfung, dass diese Gewebe aufgrund einer gleichförmigeren Aussehen leicht quantifizierbare waren innerhalb und zwischen den nicht-neoplastische und Krebsgeweben. Wir haben daher die Aperio Imagescope Nuclear (v9) Bildanalyse-Software den Prozentsatz der BG4-positiven Kerne in der TMAs zu quantifizieren. Eine separate Bildanalyse Klassifizierer wurde für jeden Gewebetyp entwickelt, genau zu identifizieren und zu trennen berührenden Objekten, wobei die malignen und nicht-neoplastische Proben erzielt die gleichen Parameter für genauen Vergleich verwendet. Auffallenderweise in neun Fällen, in denen wir doppelte Leberkrebs TMA Kerne mit dem entsprechenden angepaßten Hintergrund nicht-neoplastische Gewebe aus dem gleichen Patienten genommen hatten, beobachteten wir eine weit größere Anzahl von BG4-positive Kerne in Krebs (60,3 ± 5,4% bedeutet) im Vergleich zu nichtneoplastische (Mittelwert 18,3 ± 2,12%) Gewebekerne (Abbildung 2). Wenn einzelne Krebs Phänotypen untersucht wurden, haben wir festgestellt, dass sowohl hepatozellulären Karzinoms (HCC) und intrahepatische Gallengangskarzinom (ICC) zeigte deutlich höhere Kern BG4 Färbung im Vergleich zu nicht-neoplastischen Gewebe (2A-D und G). Obwohl HCC und ICC verschiedenen zellulären Ursprungs sein, von Hepatozyten oder Gallengang Cholangiozyten entwickeln jeweils zeigten beide eine größere Anzahl und Intensität der BG4-positive Keime im Vergleich zur nicht-neoplastischen Lebergewebe. Darüber hinaus wurde in Metastasen (isoliert aus großzelligen undifferenzierten Lungenkarzinom Stellen) eine Erhöhung der BG4-positive Färbung auch festgestellt (Abbildung 2E-G). Wir beobachteten deutliche Unterschiede zwischen nicht-neoplastischen Tumorgewebe und für eine Reihe von verschiedenen Patientenfälle. Tatsächlich ist ein breiter gefächerte Analyse von Krebs und Hintergrund nichtneoplastische TMA Kerne einschließlich unerreichte Fälle zeigten wieder eine Zunahme der BG4-positiven Kerne in HCC, ICC und metastasierendem Karzinom (3A). . (; 0,001, 3B P <)

Ähnlich wie die Wenn alle Fälle zusammen betrachtet wurden, eine ~2.4-fache Erhöhung der Zahl der BG4-positiven Kerne wurde bei Leberkrebs im Vergleich zu nicht-neoplastischen Gewebe gesehen Anstieg von G-Quadruplex Häufigkeit in Krebsgewebe Leber, eine mehr als 3-fachen Anstieg in der Anzahl von BG4-positive Kerne wurde in Magen-Adenokarzinom und Siegelringzellkarzinom im Vergleich Hintergrund nicht-neoplastische Gewebe aus dem gleichen Individuum (Abbildung entnommen beobachtet 4). Eine umfassendere Analyse von Magenkrebs und nicht-neoplastischen Geweben einschließlich unerreichte Fälle bestätigt die Zunahme der Zahl der BG4-positiven Kerne in Magenkrebs gesehen im Vergleich zu nicht-neoplastischen Gewebe (Abbildung 5). Tatsächlich in einzelnen Magenkrebs-Untertypen, Adenokarzinome (aus Drüsenepithelien), Siegelringzellkarzinome (Adenokarzinome durch Mucin Ablagerung gekennzeichnet) und gastrointestinalen Stromatumoren (GIST, KIT-exprimierenden Sarkome mesenchymalen Ursprungs), zeigten alle größeren Zahl von BG4-positive Kerne im Vergleich zu nicht-neoplastische Magengewebe (5A). Wenn alle Fälle zusammen betrachtet wurden, ~3.1-fach BG4-positive Keime in der Krebstherapie im Vergleich zu nicht-neoplastischen Geweben (5B, P < 0,001) gefunden wurden. Es ist bemerkenswert, dass mehrere Magentumor-Untertypen, die unterschiedliche Ursachen und Verlauf haben, werden alle durch Erhöhung der BG4 Färbung gekennzeichnet. Diese Ergebnisse sind deshalb stark auf einen allgemeinen Zusammenhang zwischen einer erhöhten Präsenz von G-Quadruplex-Strukturen und Magenkrebs Entwicklung.

In der Leber und Magen TMAs, einige Krebsgewebe Kerne zeigten wenig oder keine quantifizierbare BG4 Färbung, vielleicht ein Problem, bei Epitop Stabilität während der chirurgischen Biopsie Sammlung reflektiert oder alternativ zeigte auf eine reale Variabilität in G-Quadruplexbildung in diesen bestimmten Geweben. Es ist jedoch bemerkenswert, dass in keinem Fall wurde jede nichtneoplastische Leber oder Magengewebe ausgiebig BG4-positiv. Diese letztere Beobachtung bestätigt weiterhin, dass die Zunahme der Zahl der BG4-positiv in den Krebs TMA Kerne gesehen Zellen in G-Quadruplex Präsenz zwischen den nicht-neoplastischen und malignen Zuständen einen wahren Unterschied widerspiegelt. Die Analyse der G-Quadruplex-Färbung bei anderen Krebsarten daher möglich sein kann, und welche die Auswertung von Pankreasgewebe legt nahe, dass, während BG4 Färbung in nicht-neoplastischen Pankreas weit verbreitet ist, gibt es eine ~1.6-fach ist Erhöhung der BG4 Kernfärbung in Adenokarzinom Gewebe ( P <. 0,01 Abbildung S3)

Insgesamt sind unsere Ergebnisse zeigen, dass G-Quadruplexe durch IHC in nicht-neoplastischen und Krebs menschlichen Geweben erweitern unsere früheren Ergebnisse sichtbar gemacht werden, die das Vorhandensein von G-Quadruplex-Strukturen offenbart in die Kerne von Kulturzelllinien [9]. Es ist bemerkenswert, dass wir einen Anstieg in der Anzahl von G-Quadruplex-positive Zellen für einige Krebsgewebe im Vergleich zu nicht-neoplastischen Fällen beobachtet. Die Daten, die wir nicht in sich zu präsentieren erklären, warum mehr G-Quadruplexe in den Fällen von Magen und Leberkrebs offensichtlich sind. Allerdings gibt es verschiedene Hinweise in der Literatur, die einen möglichen Zusammenhang oder ursächliche Verbindung zwischen G-Quadruplexe und Mechanismen einen Beitrag zur Entwicklung von Krebs oder Progression vor. Beispielsweise G-Quadruplex-Strukturen, wenn nicht während der DNA-Replikation aufgelöst, können zerbrechliche Seiten repräsentieren, die Genominstabilität zu fördern, die ein bekanntes Merkmal von Krebs ist [24]. Tatsächlich sind G-Quadruplex-DNA-Sequenzmotive am gefunden Haltepunkte, die führen zu Translokationen innerhalb des BCL2-Gen in Lymphomen und innerhalb der HOX11-Gen in T-Zell-Leukämien [25], [26]. Computational Analysen haben auch Vereinigungen von G-Quadruplexe und Bruchpunkt-Regionen in verschiedenen Krebsarten vorgeschlagen [19].

Wir vermuten, dass eine Erhöhung der genomischen G-Quadruplexe in der Krebstherapie von Mutationen in Enzymen entstehen können, die G-Quadruplexe verarbeiten und /oder genomische Instabilität bei G-Quadruplex-Sites. Zum Beispiel Fanconi Anämie, Blooms und Werner-Syndrom, alle Anzeigegenominstabilität mit einer Prädisposition für Krebs [27] - [29] und von Mutationen in DNA-Helicase Enzyme führen, die G-Quadruplex-Auflösungs Aktivität aufweisen [30] - [32] . Aktuelle genomweite Studien haben auch die Erkennung von G-Quadruplex-Sequenzen durch zusätzliche Lösung Helikasen wie ATRX, PIF1 und XPB /D [20] - [22]. Darüber hinaus hat PIF1 vorgeschlagen worden, genomische Instabilität bei G-Quadruplexe zu unterdrücken, [22], während ATRX Verlust mit chromosomalen Instabilität in neuroendokrinen Tumoren der Bauchspeicheldrüse verbunden ist [33], und XPD Mutationen stören DNA Nukleotidexzisionsreparatur, die zu Krebs neigende Krankheiten führt solche wie Xeroderma pigmentosum [34].

Es scheint, dass die Leber und Magenkrebs sehr heterogen sind und nicht durch eine gemeinsame genetische Signatur oder einer hoch dargestellt Antriebs Mutation gekennzeichnet, dass die beobachtete Zunahme der G-Quadruplex-Strukturen einfach erklären kann . Während viele Leberkrebserkrankungen die mit Hepatitis B oder C-Infektion assoziiert sind, zeigt die pathologische Informationen mit dem TMAs erhalten, dass es keine Korrelation mit BG4 Färbung ist. Im Rahmen der künftigen Arbeit, wird es von Wert sein, nicht-neoplastischen und Proben bösartigen Tumor für Fälle zu analysieren, wo Vollgenomsequenzierung den genetischen Hintergrund der Tumor /nichtneoplastische Paare aufzuklären, um die Beziehung zu etablieren verwendet wurde, zwischen Genotyp und G-Quadruplex Bildung bei Krebs.

Abschließend berichten wir die Verwendung des G-Quadruplex-spezifischen Antikörper, BG4, in IHC Färbungsexperimente von humanem nicht-neoplastische und Krebsgeweben. Diese Studie hat es uns ermöglicht, eine deutlich höhere Anwesenheit von DNA G-Quadruplex-Strukturen, die in den Kernen von Magen- und Leberkrebszellen zu identifizieren, im Vergleich zu den entsprechenden nicht-neoplastischen Geweben. Wir vermuten, dass diese Unterschiede auf Veränderungen von zellulären Prozessen abhängig sein könnte, die die Stabilität des Genoms oder Veränderungen im Chromatin Zustand bei G-Quadruplex-Websites in Krebsgewebe regulieren. Unsere Ergebnisse unterstützen die Möglichkeit, dass Krebszellen ein Fenster der Selektivität können vorsehen, dass sie empfindlicher als nicht-neoplastischen Zellen in Richtung eines kleinen Moleküls G-Quadruplex-Targeting-Strategie machen würde.

Materialien und Methoden

Fixierung, Einbettung, Schneiden und Färben von Zellpellets wurden durch die Histopathologie Kerndienst an der Cancer Research UK Cambridge Institute durchgeführt. Immunhistochemie (IHC) wurde mit geringfügigen Variationen unter Verwendung von Standardverfahren auf einem automatisierten Leica Bond-Plattform durchgeführt. Kurz gesagt, für 24 h bei Raumtemperatur (RT) in 10% neutral gepuffertem Formalin wurden die Gewebe fixiert und verarbeitet, um ein Leica ASP300 Gewebeprozessor mit de-Hydratation durch eine abgestufte Ethanolreihe Verwendung in Xylol und Infiltration mit geschmolzenem Paraffinwachs löschen. Einbindung auf einem Leica EG 1160 Embedding-Station durchgeführt wurde, und Abschnitte bei 3 &mgr; m mit einem Mikrotom geschnitten wurden, schwebte auf einem Wasserbad bei ~45-50 ° C eingestellt, bis sie glatt und flach, bevor Sammlung auf einem Objektträger und Trocknen bei 60 ° C für 1 h. Entparaffinierung und Rehydrierung wurden unter Verwendung eines automatisierten Leica ST5020 Multistainers durchgeführt. MDA-MB-231 menschliche Brust-Adenokarzinom-Zellen wurden von ATCC LGC Standards erhalten. Für MDA-MB-231 Zellpellets, Epitopdemaskierungslösung bei 100 ° C für 20 min mit Bond Demaskierungslösung 1 (Citrat-basierten Puffer pH 6.0) oder Bond Demaskierungslösung 2 (Tris /EDTA-basierten Puffer pH 9,0) durchgeführt wurde, oder bei 37 ° C für 10 min mit Bond Enzym Vorbehandlungskit (100 ug /ml Proteinase K in Tris-gepufferter Kochsalzlösung, oberflächenaktive Mittel und 0,35% ProClin 950), um den besten Zustand zu finden. Im Handel erhältliche menschliche Gewebe-Mikroarrays mit entsprechenden ethischen Zulassung im Herkunftsland wurden von Insight Bio UK (für US-Biomax Inc. Arrays) und BioCat, Deutschland oder Stretton Scientific, UK (für Accumax, Isu Abxis Arrays) erworben. Epitopdemaskierung wurde bei 100 ° C für 20 min mit Citrat-Puffer durchgeführt. BG4 Färbung wurde bei RT auf einem automatisierten Leica Bond Instrument mit einem Kaninchen-Polymer-Kit (Leica) nach einer 15 min Inkubation mit BG4 und 8 min Inkubation mit einem anti-FLAG rabbit polyklonaler Antikörper (Cell Signaling Technology) durchgeführt. Die Objektträger wurden dann für 5 min mit 0,02% Hämatoxylin gegengefärbt die Zellkerne sichtbar zu machen. De-Hydratation und Clearing wurden auf einem automatisierten Leica ST5020 Multistainers getan und Montage auf einem automatisierten Glas Eindeckautomat Leica CV5030 durchgeführt. Die Objektträger wurden mit einem Aperio XT120 Dia Scan-System (Leica) gescannt und die Bilder analysiert, um die Aperio Imagescope Nuclear v9 Software. Statistische Analysen und P-Werte wurden berechnet die Student-t-Test. Frequenzverteilungsdiagramme wurden unter Verwendung aufgetragen GraphPad Prism (GraphPad Software).

Grundinformationen
Abbildung S1.
BG4 Färbung auf Paraffin eingebettetem MDA-MB-231 Zellpellets. A. Menschliche MDA-MB-231-Brustkrebszellpellets wurden fixiert, in Paraffin eingebettet und verarbeitet für IHC unter Verwendung des G-Quadruplex-spezifischen Antikörper BG4. Starke BG4-Färbung (braun) ist in Zellkerne folgende Epitopdemaskierung mit Tris /EDTA-basierten Puffer pH 9.0. Maßstabsbalken entspricht 20 &mgr; m. Die Zellkerne werden mit Hämatoxylin (blau) gegengefärbt. B. Strong BG4 Färbung (braun) ist in Zellkernen folgenden Epitopdemaskierung mit Proteinase K. C. Keine Kernfärbung in Abwesenheit des Antikörpers nach BG4 Tris /EDTA Epitopdemaskierung beobachtet wird. D. Keine Kernfärbung ist Behandlung nach DNase gesehen vor der BG4 Färbung nach Epitopdemaskierung mit EDTA. E. Hohe Konzentrationen von nicht-spezifische Färbung in Abwesenheit von BG4 nach Epitopdemaskierung mit Proteinase K
doi: 10.1371 /journal.pone.0102711.s001
(TIF)
Abbildung S2.
Nichtneoplastische menschlichen Geweben zeigen variable BG4 Färbung. Nicht-neoplastische Gewebe wurden durch IHC mit dem G-Quadruplex-spezifischen Antikörper BG4 gefärbt. A. BG4-Färbung (braun) in der Nierenrinde zeigt eine Reihe von Kern Färbeintensitäten in Glomeruli und die damit verbundenen Strukturen. Die Zellkerne wurden mit Hämatoxylin (blau) gegengefärbt. Maßstabsbalken entspricht 50 &mgr; m B. Schwach positive BG4-Färbung in den Sammelröhrchens Kerne der Niere Medulla zu sehen ist. C. Haut zeigt eine Reihe von BG4 Intensitäten in der Epidermis mit positiven und negativen Kerne verstreut, während die Dermis meist positiv ist. D. Die meisten Kerne in Kolon sind BG4-positiv. E. in der Gebärmutterkörper, die geschichtete Plattenepithel ist weitgehend BG4-negativ, während eine positive Färbung ist mehr oberflächlich gesehen. F. Während der Brust duktale Läppchen, beide myoepithelialen und Luminal Zellen zeigen allgemeine starke BG4 Färbung mit nur gelegentlichen negativen Zellen
doi:. 10.1371 /journal.pone.0102711.s002
(TIF)
Abbildung S3.
Erhöhte Präsenz von G-Quadruplex-Strukturen in menschlichen Geweben Bauchspeicheldrüsenkrebs. Nicht-neoplastische und Krebs wurden Pankreasgewebe durch IHC mit der G-Quadruplex-spezifischen Antikörper BG4 und die Anzahl von BG4-positive Kerne gefärbt wurde mit Aperio Imagescope Software erzielt. A. Die Kerne von nicht-neoplastischen Pankreasgewebe zeigen moderate BG4-Färbung (braun) mit vielen ungefärbten Kerne ebenfalls vorhanden. Die Zellkerne wurden mit Hämatoxylin (blau) gegengefärbt. Maßstabsbalken entspricht 50 &mgr; m. B. BG4 Färbung in Gewebe Adenokarzinom des Pankreas ist umfangreicher mit größerer Intensität. C. Gesamt Quantifizierung der Anzahl von BG4-positive Kerne in allen nicht-neoplastische und Bauchspeicheldrüsenkrebsgewebe. Fehlerbalken stellen die S.E.M. * P < 0,01, n = 6 und 12 für nicht-neoplastische und Krebs Kerne bzw.
doi:. 10.1371 /journal.pone.0102711.s003
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