PLoS ONE: povišene razine G-Quadruplex formacije u ljudskom želucu i raka jetre tkiva

Sažetak pregled

Četiri nasukan G-quadruplex DNA sekundarne strukture su nedavno vizualizirati u jezgri ljudskih stanica u kulturi. Ovdje, pokazali smo da BG4, protutijela G-quadruplex specifične, može se koristiti kako bi se obojilo DNK G-quadruplex strukture bolesnika izveden iz tkiva pomoću imunohistokemije. Promatramo značajno povećane niz G-quadruplex pozitivnih jezgri u ljudskim tumorima jetre i želuca u odnosu na okolnu non-neoplastičnog tkiva. Naši rezultati sugeriraju da je formiranje G-quadruplex može se otkriti i mjeriti u materijalu pacijenta-izvedeni i da povišeni G-quadruplex formacija može biti karakteristika nekih vrsta raka pregled

Izvor:. Biffi G, Tannahill D, Miller J, Howat WJ, Balasubramanian S (2014) Povišene razine G-Quadruplex formacije u ljudskom želucu i raka jetre tkiva. PLoS ONE 9 (7): e102711. doi: 10,1371 /journal.pone.0102711 pregled

Urednik: Marko Isalan, Imperial College London, Ujedinjeno Kraljevstvo pregled

Primljeno: 28. svibnja 2014; Prihvaćeno: 23. lipnja 2014; Objavljeno: 17. srpnja 2014 pregled

Copyright: © 2014 Biffi et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan pregled

Data Dostupnost:. The autori potvrđuju da su svi podaci na kojima se temelji nalaze u potpunosti na raspolaganju bez ograničenja. Svi relevantni podaci u radu i njegove popratne podatke datoteka pregled

Financiranje:. Autori zahvaljuju Cancer Research UK za grant programa (C9681 /A11961) i jezgre institucijskog financiranja na Balasubramanian laboratoriju, a za PhD stipendija za GB (http://www.cancerresearchuk.org). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

nekanonskih G-quadruplex DNA sekundarne strukture se mogu formirati od guanin bogatih sljedova DNA tipa G _{3 + N L1 G 3 + N L2 G 3 + N L3 G 3+ (N = bilo koja baza i L = petlja), a takve slijed motivi su prisutni tijekom cijelog ljudskog genoma [1], [2]. G-quadruplexes su četiri nasukan strukture koje sadrže hrpe tetrads formirane kroz Hoogsteen vodikovih veza četiri gvanini koordinira kationa središnje jednovalentni [3]. Oligonukleotidi presavijeni u strukturu G-quadruplex In vitro
imaju visoku termodinamičke stabilnosti pod blizini-fiziološkim uvjetima, u skladu s njihovom formiranju u stanicama [4]. Predviđeni položaj G-quadruplex motiva sekvence u regulacijskih regija genoma, kao što su promotori i telomera, sugerira da G-quadruplex strukture mogu imati važnu ulogu u funkciji genoma [5] - [7]. Niz helicases da riješi G-quadruplexes su identificirani i hipotetski doprinijeti normalne funkcije genoma, kao što su replikacija, transkripcija i održavanje stabilnosti genoma [8]. Vizualizacija DNA G-quadruplex konstrukcija u ljudskim stanicama podupire postojanje G-quadruplexes u genomu [9]. U tim pokusima, visoko selektivan G-quadruplex-specifičnog antitijela (BG4) generirano pomoću faga i koriste za vizualizaciju diskretnu težišta G-quadruplex struktura u jezgri ljudskog tkiva kulture staničnih linija. To antitijelo je pružio priliku da sonda stanični ulogu G-quadruplexes a također i njihov potencijalni angažman u bolesti. Pregled}

G-quadruplex strukture su predložili da je povezan s staničnih funkcija kao što su replikaciju i transkripciju. Na primjer, stabilizacija G-quadruplex mala molekula može potisnuti transkripciju određenih onkogena i /ili induciraju oštećenje DNA u telomera i onkogena dovodi do replikacije nedostatke i smrt stanica [10] - [17]. G-quadruplex strukture također može biti povezan s genoma nestabilnost i G-quadruplex slijed motivi su pronađeni proksimalno DNA prijelomnih točaka i mjesta somatske broju kopija mijenja vidjeti u nekoliko vrsta raka [18], [19]. Helicases da rješavanje G-quadruplexes također nalaze lokalizirane na mjestima genoma nestabilnosti [20] - [22] i bolesti kao što su Bloom-a i Werner-a sindroma, koji pokazuju povišene razine genoma nestabilnosti i predispozicijom za rak, da doprinose mutacije u G -quadruplex-rješavanje helicases [23]. pregled

s obzirom na potencijal odnos između G-quadruplex struktura i ljudske bolesti, to je važan cilj za rješavanje li G-quadruplexes može biti otkriven unutar ljudskog tkiva. Mi smo stoga istraživali otkrivanje DNA G-quadruplexes u bolesnika dobivena iz tkiva i da li postoje razlike u razinama G-quadruplex između ne-maligne i raka tkiva. Primjenom protutijela G-quadruplex specifična, BG4 u imunohistokemije s parafin uklopljenih (FFPE) microarray tkivo sekcije formalinom fiksiranih, otkrili smo rašireno DNA G-quadruplex formaciju u jezgre ljudskim tkivima. Kvantificiranje BG4-pozitivnih jezgri stanice pokazala šire nastajanje G-quadruplex struktura u karcinoma želuca i jetre u usporedbi s odgovarajućom pozadina bez maligne tkiva. Ovi rezultati ukazuju na to da obrada G-quadruplex struktura je pogrešno regulirana u nekim karcinoma u ljudi. Pregled

Rezultati i rasprava pregled

Postavili smo se utvrdi prisutnost G-quadruplexes u jezgrama čovjeka tkiva i istražiti da li je bilo razlike su jasno uočljive u bolesnika dobivena iz tkiva raka. Naš pristup se temelji na detekciji nuklearnog G-quadruplexes imunohistokemijom (IHH) sa G-quadruplex specifična antitijela, BG4, na ne-neoplastičnih i raka mikropoljima tkiva (TMAs). Specifičnost i selektivnost BG4 za G-quadruplex konstrukcija i primjena BG4 u imunofluorescencije (IF) mikroskopije na ljudskim stanicama su prethodno opisano [9]. Da biste utvrdili prikladnost BG4 za IHC, prvo smo testirali ovu antitijela u sustavu modela, koristeći dijelove iz FFPE stanične pelete MDA-MB-231 stanice raka dojke koje su prethodno uočene prikazati nuklearne G-quadruplex žarišta IF mikroskopom [9] , Kao epitopom nalaženje, bilo topline posredovane (u citrata bazi pH 6.0 ili Tris /EDTA se temelji na pH 9,0 puferi) ili enzimskim (s proteinazom K), često je potrebno izložiti antigena mjesta prije nego što se veže protutijelo, usporedili smo ove tri standardna epitop pronalaženje pred-tretmana. Nakon inkubacije BG4, bojenje izvedena je inkubacijom sa sekundarnim anti-flag antitijelom koje prepoznaje FLAG tag epitopa prisutna na BG4 protutijela, zatim Leica peroksidaza iz hrena bazi polimera detekciju pomoću Bond IHH bojanje platforme. Nakon ovog protokola, intenzivna nuklearna obojenje uočeno s BG4 tek nakon epitopom nalaženje (Slika 1B i S1). Ne obojenje uočeno u odsutnosti predobradu (slika 1A) i kontrola izvodi u odsustvu BG4 pokazali da epitop popravljanje sa citratnim bazi puferu dobije manje pozadine od onog s Tris /EDTA (slika 1C i S1), a pre -treatment s proteinazom K dovela je do nespecifične obojenje jezgre i u odsutnosti BG4 (Slika S1). Štoviše, nakon što epitopom nalaženje s citrat ili Tris /EDTA pufera, DNaze tretman prije BG4 bojenje dovelo do snažnog smanjenja intenziteta BG4 nuklearne signala (slika 1D i S1), što dodatno potvrđuje otkrivanje DNA G-quadruplexes. Nuklearni BG4 signal vidi u IHC je u skladu s prethodnim otkrivanje BG4 žarišta u jezgrama stanica za kulturu tkiva [9]. Pregled

Nakon što je uspostavio IHC protokol za BG4, najprije potvrdio da biopsije ne-neoplastični ljudski uzorci tkiva se može obojeni pomoću BG4. Općenito, zapazili smo raznolika BG4 Obrazac obojenja u mnogim tkivima što ukazuje na razlike u formiranju G-quadruplexes između tkiva i između stanica unutar istog tkiva (Slika S2). Ovi rezultati ukazuju da cjelokupna formiranje DNA G-quadruplexes složenim ljudskim tkivima može se procijeniti korištenjem BG4 u IHC, u svrhu produljenja vizualizaciju G-quadruplex konstrukcija iznad IF mikroskopijom u stanicama kulture tkiva. U privremenoj istraživanju BG4 mrlja na tkivu karcinoma u usporedbi s pozadinskom bez tumora, razlike u intenzitetu BG4 bojenja ili distribuciji pojavio uglavnom neuvjerljiv (podaci nisu prikazani), te u mnogim slučajevima strog kvantifikacija nije bilo moguće zbog značajnih razlika u morfologiji i prisutnost više tipova stanica u maligne odnosu na ne-neoplastičnim tkivom. Nasuprot tome, za jetru i želuca, naša privremena ispitivanje sugerira da ova tkiva su lako mjerljivi zbog više uobičajene primjene unutar i između ne-neoplastičnih i raka tkiva. Stoga smo koristili Aperio Imagescope Nuklearna (v9) za analizu slike kvantificirati postotak BG4-pozitivnih jezgri prisutnih u TMAs. Zasebna analiza slike klasifikator je razvijen za svaku vrstu tkiva kako bi se točno utvrdili i posebnim diranjem predmeta, pri čemu su maligne i ne-maligne uzorci zabio koristeći iste parametre za precizno usporedbu. Nevjerojatno, u devet slučajeva za koje smo imali duple raka jetre TMA jezgre s odgovarajućim uskladiti pozadini bez tumora, uzetog iz istog pacijenta, gledali smo daleko veći broj BG4 pozitivnih jezgri u raka (prosjek 60,3 ± 5,4%) u odnosu na ne-neoplastični (znači 18,3 ± 2,12%) tkiva jezgre (slika 2). Kad su ispitani pojedini fenotipova raka, otkrili smo da su i hepatocelularni karcinom (HCC) i intrahepatičkog kolangiokarcinom (ICC) pokazala je znatno veći BG4 bojenje nuklearne odnosu na ne-tumora, (slika 2A-D i G). Iako HCC i ICC imaju različite stanične podrijetlo, razvoj iz hepatocita ili žučovoda cholangiocytes odnosno, kako je pokazala veći broj i intenzitet BG4-pozitivnih jezgri u odnosu na ne-neoplastičnim jetrenog tkiva. Nadalje, metastaze (izoliran iz velikih stanica nediferenciranih mjestima pluća) povećanje BG4-pozitivnim bojanjem Zabilježeno (Slika 2E-G). opazili smo jasne razlike između ne-neoplastičnog i tumorskom tkivu u nekoliko različitih predmeta bolesnika. Doista, širi spektar analiza raka i pozadinske ne-maligne TMA jezgre uključujući neodgovarajući slučajevima opet pokazali povećanje BG4 pozitivne jezgre preko HCC, ICC i metastatskim karcinomom (Slika 3A). Kada su uzeti u obzir u svim slučajevima istodobno, ~2.4-struko povećanje broja BG4-pozitivnih jezgri je kod raka jetre u usporedbi sa ne-neoplastičnog tkiva. (P < 0.001, slika 3B) pregled

sličan je porast incidencije G-quadruplex u raka jetre tkiva, veći od 3-struko povećanje broja BG4-pozitivnih jezgri zabilježeno je u želucu adenokarcinoma i karcinoma stanica pečatni prsten u usporedbi s pozadinskom bez tumora, uzetog iz istog pojedinca (slika 4). Širi spektar analiza raka želuca i ne-maligne tkivima uključujući neodgovarajući slučajeva potvrdio povećanje broja BG4 pozitivnih jezgri vidjeli u rak želuca u usporedbi s ne-tumora, (slika 5). Doista, u pojedinačnoj raka želuca pod-vrste, adenokarcinom (podrijetlom iz žljezdanog epitela), karcinomi stanica pečatni prsten (adenokarcinoma karakterizira mucin taloženje) i tumora gastrointestinalnog strome (GIST, KIT-izražavanje sarkoma mezenhima), svi su pokazali veći broj BG4-pozitivne jezgre u odnosu na ne-neoplastičnog tkivu želuca (Slika 5A). Kada su uzeti u obzir u svim slučajevima zajedno ~3.1 puta više BG4-pozitivne jezgre se nalaze u odnosu na karcinom ne-maligne tkivima (slika 5B, P < 0.001). Primjetno je da je nekoliko tumora želuca pod-vrste, koje imaju različite etiologije i napredovanje, a sve se odlikuju povećanje BG4 bojenja. Ovi rezultati su, dakle, vrlo sugestivan opće povezanosti povećane prisutnosti G-quadruplex strukture i razvoja raka želuca. Pregled

U jetri i želucu TMAs, neke jezgre rak tkiva pokazala je mali ili nikakav mjerljive BG4 bojenje, možda odražavajući problem u stabilnost epitopa tijekom kirurškog kolekcije biopsije ili alternativno ukazuje na pravi varijabilnosti u formiranju G-quadruplex u tim tkivima. To je ipak naglasiti da ni u kojem slučaju je bilo koji ne-neoplastični jetre ili želuca tkiva intenzivno BG4-pozitivan. Ova posljednja primjedba dodatno potvrđuje da je povećanje broja BG4-pozitivne stanice vidjeli u karcinom TMA jezgri odražava pravi razliku u G-quadruplex prisutnosti među ne-maligne i malignih stanja. Analiza G-quadruplex bojenjem na druge vrste raka, mogu se stoga moguće i preliminarnom analiza gušterače tkiva pokazuje da, dok BG4 bojenje u ne-neoplastičnog gušterače raširena, postoji oko 1,6 puta više za BG4 obojenje jezgre u adenokarcinoma tkivima ( p '. 0.01, Slika S3) pregled

Sve u svemu, naši rezultati pokazuju da G-quadruplexes mogu vizualizirati IHC u ne-maligne i oboljelima od raka tkiva proširiti naše ranije nalaze da je otkrio prisutnost G-quadruplex struktura u jezgre kulture staničnih linija [9]. Važno je napomenuti da smo uočili porast broja G-quadruplex-pozitivne stanice za neka tkiva raka u odnosu na ne-maligne slučajeve. Podaci koje ćemo predstaviti same po sebi ne objašnjava zašto se sve više G-quadruplexes su očiti u slučajevima karcinoma želuca i jetre. Međutim, postoji nekoliko linija dokaza u literaturi koje ukazuju potencijalnu povezanost ili uzročnu vezu između G-quadruplexes i mehanizama koji doprinose razvoju raka ili napredovanje. Na primjer, G-quadruplex strukture, ako se ne riješeno tijekom replikacije DNA, može predstavljati krhke stranice koje promiču genoma nestabilnost, koja je poznata znak za rak [24]. Doista, G-quadruplex motivi sekvenci nalaze se na DNA kontrolne točke koje dovode do translokacije unutar gena BCL2 u limfomima i unutar gena HOX11 u T-stanica leukemije [25], [26]. Računalne analize su također predložili moguće udruge G-quadruplexes i Prijelomna točka regije u različitim oblicima raka [19]. Pregled

Mi pretpostavljamo da bi povećanje genomske G-quadruplexes u rak može nastati zbog mutacija u enzima koji obrađuju G-quadruplexes i /ili genomske nestabilnosti na G-quadruplex stranicama. Na primjer, Fanconi anemija, sindromi Bloom-a i Werner-a, a sve za prikaz genom nestabilnosti s predispozicijom za rak [27] - [29], a rezultat su mutacija u DNA uzvojnicu enzima koji imaju G-quadruplex-rješavanje aktivnost [30] - [32] , Nedavni genoma širom studije su također naglasili priznavanje G-quadruplex sekvenci dodatnim otapanje, helicases poput ATRX, PIF1 i XPB /D [20] - [22]. Nadalje, PIF1 je sugerirano da suprimira genomske nestabilnosti na G-quadruplexes [22], a ATRX gubici povezano s kromosomskom nestabilnošću kod tumora pankreasa neuroendokrinih [33] i XPD mutacije poremetiti nukleotida odstranjenje popravak DNA koja dovodi do raka sklon bolesti takvih kao xeroderma pigmentna [34]. pregled

Čini se da je rak jetre i želuca su vrlo heterogeni i nisu karakterizira zajednički genetski potpis ili visoko zastupljena mutacije vožnje koji se mogu jednostavno objasniti uočeni porast G-quadruplex struktura , Iako su mnogi karcinomi jetre povezane sa hepatitisom B ili C infekcija, patološko podaci dobiveni s TMAs ukazuje da ne postoji korelacija s BG4 bojanja. U sklopu budućeg rada, to će biti od vrijednosti za analizu ne-neoplastične i malignih uzoraka tumora za slučajeve gdje cijelog genoma sekvenciranje je zaposlenih da se razjasni genetsku pozadinu tumorskih /ne-maligne parovima, kako bi se uspostavio odnos između genotipa i G-quadruplex formacije kod raka. pregled

u zaključku, izvješćuju o uporabi antitijela G-quadruplex specifična, BG4 u IHC bojanja pokusima ljudske ne-neoplastičnih i raka tkiva. Ova studija nam je omogućila da identificiraju znatno veću prisutnost DNA G-quadruplex struktura u jezgri želuca i raka jetre stanica u usporedbi s odgovarajućim ne-maligne tkivima. Pretpostavljamo da se te razlike mogu biti ovisni o izmjenama staničnih procesa koji reguliraju stabilnost genoma ili promjene u kromatina stanju na G-quadruplex mjesta u tkivu raka. Naši rezultati podupiru mogućnost da se stanice raka mogu pružiti prozor selektivnosti koji bi ih osjetljiviji od ne-maligne stanice prema mala molekula G-quadruplex ciljanje strategije. Pregled

Materijali i metode pregled

Fiksiranje, ugradnja, secira i bojenje pelete stanica su provedena od strane histopatoloških jezgre službe u Cancer Research UK Cambridge Instituta. Imunohistokemija (IHH) korištenjem standardnih postupaka na automatizirani Leica Bond platforme s manjim promjenama. Ukratko, tkiva su fiksirani tijekom 24 h na sobnoj temperaturi (RT), u 10% neutralno puferirani formalin i obrađeni pomoću procesora Leica ASP300 tkiva sa de-hidratacije kroz serijama gradiranog etanola, čime je u ksilenu i infiltracije rastaljenim parafina. Ugrađivanje je izvedena na ugrađivanje Station Leica EG1160 i rezovi su na 3 um mikrotomom, lebdio na vodenoj kupelji postavljen na ~45-50 ° C dok glatka i ravna, prije skupljanja na mikroskopskom stakalcu i sušenja na 60 ° C 1 h. De-depilacija i re-hidratacija su provedena pomoću automatiziranog Leica ST5020 multistainer. MDA-MB-231 stanice adenokarcinoma dojke humanog dobivene su od ATCC LGC standarda. Za pelete MDA-MB-231 stanica, epitop dohvat izvedena je na 100 ° C za 20 min s Bond epitop dohvat 1 Solution (citrat bazi pufer pH 6.0), ili Bond epitop dohvat otopini 2 (Tris /EDTA bazi pufer pH 9,0) ili na 37 ° C tijekom 10 minuta, uz kit Bond enzim tretman (100 ug /ml proteinaze K u Tris-puferiranoj slanoj otopini, površinski aktivne tvari i 0,35% Proclin 950) kako bi se pronašli najbolje stanje. Komercijalno dostupne mikročipovima, ljudsko tkivo s odgovarajućim etičkog odobrenja u zemlji podrijetla su kupljeni od Insight Bio UK (za nas Biomax dd polja), a BioCat, Njemačkoj ili Stretton Scientific, UK (za Accumax, Isu Abxis polja). Epitop dohvat je proveden pri 100 ° C tijekom 20 minuta uz citratnom puferu. BG4 bojenje je provedena pri sobnoj temperaturi na automatizirani Leica Bond instrumentu zečjim polimera priborom (Leica) nakon 15 min inkubacije s BG4 i 8 min inkubacije s anti-FLAG zečjim poliklonskim protutijelom (Cell Signaling Technology). Rezovi su zatim protu 5 min s 0,02% hematoksilinom vizualizirati stanične jezgre. De-hidratacija i čišćenje odrađeno na automatizirani Leica ST5020 multistainer i montaža je izvršena na automatizirani stakla coverslipper Leica CV5030. Ploče su skenirane sa sustavom slide skeniranja Aperio XT120 (Leica) i slike analizirane pomoću Aperio Imagescope Nuklearna V9 softver. Statističke analize i P vrijednosti izračunate su korištenjem Student t-testa. Frekvencija-distribucije grafovi crtano pomoću GraphPad Prism (GraphPad Software). Pregled

popratne podatke
Slika S1. pregled BG4 mrlje na pelete MDA-MB-231 staničnih parafin-ugrađen. A. Human MDA-MB-231 pelete raka dojke stanica su fiksirane, paraffin-embedded i obradi za IHC pomoću BG4 antitijela G-quadruplex specifične. Jaka BG4 bojenje (smeđa) je očito u staničnoj jezgri sljedeće epitopom nalaženje s Tris /EDTA-based puferu pH 9.0. Mjerilo odgovara 20 um. Jezgre su prebrojane s hematoksilinom (plava). B. Strong BG4 bojanja (smeđe) vidljiv u staničnoj jezgri nakon epitop pronalaženje s proteinazom K. C. No obojenje jezgre se opaža u odsutnosti BG4 antitijela nakon Tris /EDTA epitop pretraživanje. D. Ne nuklearna obojenost vidi sljedeću DNaza tretman prije BG4 mrlja nakon epitopom nalaženje s EDTA. E. Visoka razina nespecifičnog bojanja u nedostatku BG4 nakon epitopom nalaženje s proteinazom K. pregled doi: 10,1371 /journal.pone.0102711.s001 pregled (TIF)
Slika S2. pregled Non-neoplazije ljudska tkiva pokazuju varijabilna BG4 bojenje. Non-maligne tkiva su obojeni IHC pomoću BG4 antitijela G-quadruplex specifična. A. BG4 bojenje (smeđa) u korteksu bubrega pokazuje niz nuklearnih bojanja intenziteta u glomerula i povezanih struktura. Stanične jezgre su prebrojane s hematoksilinom (plava). Mjerilo odgovara 50 um B. slabo pozitivan BG4 obojenost vidjeti u prikupljanje tubula jezgre od medule bubrega. C. Koža pokazuje niz BG4 intenziteta u epidermisu s pozitivnim i negativnim jezgri razasutih, dok je dermis je uglavnom pozitivna. D. Većina jezgre u debelom crijevu su BG4-pozitivni. E. U maternice tijelu, slojeviti ljuskavi epitel je uglavnom BG4 negativne a pozitivno bojanje vidi više površinski. F. Kroz grudi duktalnih lobules, oba myoepithelial i lumena stanice pokazuju opći snažan BG4 bojanje s tek povremenim negativnih stanica pregled doi:. 10.1371 /journal.pone.0102711.s002
(TIF)
Slika S3. pregled Povišena prisutnost G-quadruplex strukturama u tkivima ljudske rak gušterače. Ne-neoplastičnih i raka tkiva pankreasa su bojani IHC pomoću BG4 antitijela G-quadruplex-specifičan, a broj BG4-pozitivnih jezgri je postignuto pomoću Aperio Imagescope softvera. A. jezgre ne-neoplastičnim pankreas tkiva pokazuju umjereno BG4 bojenja (smeđe) s brojnim neobojene jezgrama također prisutne. Stanične jezgre su prebrojane s hematoksilinom (plava). Mjerilo odgovara 50 um. B. BG4 bojanje u adenokarcinom tkivu gušterače je opsežniji s većim intenzitetom. C. Ukupna kvantificiranje broja BG4-pozitivnih jezgri u svim nisu neoplastičnih i gušterače tkivu raka. Stupci pogrešaka predstavljaju S.E.M * P < 0.01, n = 6 i 12 za ne-maligne i raka jezgre, odnosno pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0102711.s003 pregled (TIF) pregled

• PLoS ONE: Uvijek Gamble natašte: Glad je povezana s povoljnim Odluka Making
• PLoS ONE: Neočekivani Bezglavi i bezrep Riba u želucu od Shortfin Mako Isurus oxyrinchus