PLoS ONE: Forhøjede niveauer af G-quadruplex Formation i menneskelige mave og leverkræft væv

Abstrakt

Fire-strandede G-quadruplex DNA sekundære strukturer er for nylig blevet visualiseret i kerner af humane dyrkede celler. Her viser vi, at BG4, en G-quadruplex-specifikt antistof, kan anvendes til farvning DNA G-quadruplex strukturer i patient-afledt væv under anvendelse immunohistokemi. Vi observerer en signifikant forhøjet antal G-quadruplex-positive kerner i humane cancere i lever og mave sammenlignet med baggrunden ikke-neoplastisk væv. Vores resultater tyder på, at G-quadruplex dannelse kan påvises og måles i patient-afledt materiale, og at forhøjede G-quadruplex dannelse kan være karakteristisk for visse kræftformer

Henvisning:. Biffi G, Tannahill D, Miller J, Howat WJ, Balasubramanian S (2014) Forhøjede niveauer af G-quadruplex Formation i menneskelige mave og leverkræft væv. PLoS ONE 9 (7): e102711. doi: 10,1371 /journal.pone.0102711

Redaktør: Mark Isalan, Imperial College London, England

Modtaget: 28. maj 2014; Accepteret: 23 juni 2014; Udgivet: 17 Juli 2014

Copyright: © 2014 Biffi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Forfatterne takker Cancer Research UK for programmet tilskud (C9681 /A11961) og kernen institutionel finansiering til Balasubramanian laboratoriet, og for en ph.d. studentship for GB (http://www.cancerresearchuk.org). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ikke-kanonisk G-quadruplex DNA sekundære strukturer kan dannes ud fra guanin-rige DNA-sekvenser af typen G _{3 + N L1 G 3 + N L2 G 3 + N L3 G 3+ (N = helst base, og L = loop), og sådanne sekvensmotiver er udbredt i hele det humane genom [1], [2]. G-quadruplexes er fire-strenget strukturer, der omfatter stakke af tetrader udformet gennem Hoogsteen hydrogen-binding af fire guaniner koordineres af en central monovalent kation [3]. Oligonukleotider foldet til en G-quadruplex struktur in vitro
har en høj termodynamisk stabilitet under nær-fysiologiske betingelser, i overensstemmelse med deres dannelse i celler [4]. Den forudsagte placering af G-quadruplex sekvensmotiver i regulatoriske regioner af genomet, såsom promotorer og telomerer, tyder på, at G-quadruplex strukturer kan have en vigtig rolle i genomet funktionen [5] - [7]. En række helicaser at løse G-quadruplexes er blevet identificeret og er en hypotese at bidrage til normale genom funktioner, såsom replikation, transkription og opretholdelse af genomstabilitet [8]. Visualisering af DNA G-quadruplex strukturer i humane celler har støttet eksistensen af ​​G-quadruplexes i genomet [9]. I disse eksperimenter blev en meget selektiv G-quadruplex-specifikt antistof (BG4), der genereres ved fagvisning og anvendes til at visualisere diskrete foci af G-quadruplex strukturer i kerner af human vævsdyrkningscellelinier. Dette antistof har givet en mulighed for at undersøge den cellulære rolle G-quadruplexes og også deres potentielle engagement i sygdom.}

G-quadruplex strukturer er blevet foreslået at være forbundet med cellulære funktioner, såsom replikation og transkription. For eksempel kan G-quadruplex stabilisering ved et lille molekyle undertrykke transskription af visse onkogener og /eller inducere DNA-skade ved telomerer og onkogener fører til replikation fejl og celledød [10] - [17]. G-quadruplex strukturer kan også være knyttet til genome ustabilitet og G-quadruplex sekvens motiver er fundet proksimalt til DNA breakpoints og steder af somatiske kopi nummer ændringer set i flere kræftformer [18], [19]. Helicaser at løse G-quadruplexes findes også lokaliseret på steder af genom ustabilitet [20] - [22], og sygdomme som Bloom og Werners syndromer, der viser øget genom ustabilitet og en disposition til kræft, har bidrager mutationer i G -quadruplex-løsning helicaser [23].

i betragtning af den potentielle sammenhæng mellem G-quadruplex strukturer og menneskelig sygdom, er det et vigtigt mål at tage fat om der kan påvises G-quadruplexes inden humane væv. Vi undersøgte derfor detektion af DNA G-quadruplexes i patient-afledte væv, og om der er forskelle i G-quadruplex niveauer mellem ikke-neoplastiske og kræft væv. Ved anvendelse af G-quadruplex-specifikt antistof, BG4, i immunhistokemi med formalin-fikserede paraffin-indlejrede (FFPE) væv microarray sektioner, vi har opdaget udbredt DNA G-quadruplex dannelse i kerner af humane væv. Kvantificering af BG4-positive cellekerner afslørede mere omfattende dannelse af G-quadruplex strukturer i mave- og leverkræft sammenlignet med de tilsvarende baggrund ikke neoplastiske væv. Disse resultater tyder på, at behandlingen af ​​G-quadruplex strukturer er mis-reguleret i nogle menneskelige kræftformer.

Resultater og Diskussion

Vi satte os for at demonstrere tilstedeværelsen af ​​G-quadruplexes i kerner af menneskelig væv og at undersøge, om eventuelle forskelle er indlysende i patient-afledte cancervæv. Vores tilgang var baseret på påvisningen af ​​nukleare G-quadruplexes ved immunhistokemi (IHC) med G-quadruplex-specifikt antistof, BG4, på ikke neoplastiske og kræftvæv microarrays (TMAS). Specificiteten og selektiviteten af ​​BG4 for G-quadruplex strukturer og anvendelsen af ​​BG4 i immunofluorescens (IF) mikroskopi på humane celler er blevet beskrevet tidligere [9]. For at bestemme egnetheden af ​​BG4 for IHC, vi først afprøvet dette antistof i en model, der anvender dele fra FFPE cellepellets af MDA-MB-231 brystkræftceller, der tidligere blev observeret at vise nukleare G-quadruplex foci fra IF mikroskopi [9] . Som epitopgenfinding, enten varme-medieret (i citrat-baserede pH 6,0 eller Tris /EDTA-baserede pH 9,0 buffere) eller enzymatisk (med proteinase K), ofte kræves for at blotlægge antigene steder før antistofbinding, sammenlignede vi disse tre standard epitop hentning forbehandlinger. Efter BG4 inkubering blev farvning udført ved inkubering med et sekundært anti-FLAG-antistof, som genkender et FLAG-tag-epitop er til stede i BG4 antistof, efterfulgt af Leica peberrodsperoxidase polymer-baseret detektion anvendelse af Bond IHC-farvning platform. Efter denne protokol blev intens nukleare farvning observeret med BG4 efter epitopgenfinding (figur 1B og S1). blev ikke observeret nogen farvning i fravær af forbehandling (figur 1A) og kontroller udført i fravær af BG4 viste, at epitopgenfinding med citrat-buffer gav mindre baggrund end med Tris /EDTA (figur 1C og S1), hvorimod pre -Behandling med proteinase K medførte uspecifik nuklear farvning, selv i fravær af BG4 (fig S1). Desuden efter epitopgenfinding med citrat eller Tris /EDTA-buffere, DNase I-behandling forud for BG4 farvning førte til en kraftig reduktion i BG4 nuklear signalintensitet (figur 1 D og S1), hvilket yderligere bekræfter påvisningen af ​​DNA G-quadruplexes. Det nukleare BG4 signal set i IHC er i overensstemmelse med den tidligere påvisning af BG4 foci i kerner af vævskulturceller [9].

Efter at have konstateret en IHC protokol for BG4, vi først bekræftet, at biopsi ikke-neoplastisk menneske vævsprøver kan farves under anvendelse BG4. Generelt observerede vi varierede BG4 farvningsmønstre på tværs af mange væv tyder forskelle i dannelsen af ​​G-quadruplexes mellem væv og også mellem celler i det samme væv (figur S2). Disse resultater indikerer, at den samlede dannelse af DNA G-quadruplexes i komplekse humane væv kan vurderes ved anvendelse BG4 i IHC, som udvider visualisering af G-quadruplex strukturer ud over IF mikroskopi i vævskulturceller. I en foreløbig undersøgelse af BG4 farvning på kræft væv sammenlignet med baggrund ikke-neoplastisk væv, forskelle i BG4 farvning intensitet eller distribution optrådte meste ufyldestgørende (data ikke vist), og i mange tilfælde streng kvantificering ikke var muligt på grund af betydelige forskelle i morfologi og tilstedeværelsen af ​​flere celletyper i maligne versus ikke-neoplastisk væv. I modsætning hertil for lever og mave, vores foreløbige undersøgelse antydede, at disse væv var let kvantificerbare grund af en mere ensartet udseende inden for og mellem ikke-neoplastiske og cancervæv. Vi brugte derfor Aperio Imagescope Nuclear (v9) billedanalyse software til at kvantificere procentdelen af ​​BG4-positive kerner til stede i TMAs. En separat billedanalyse sorterer blev udviklet for hver vævstype til præcist at identificere og separate rørende objekter, med de maligne og ikke neoplastiske prøver scoret med de samme parametre for nøjagtig sammenligning. Slående, i ni tilfælde, hvor vi havde to eksemplarer leverkræft TMA kerner med den tilsvarende matchede baggrund ikke-neoplastisk væv taget fra den samme patient, observerede vi et langt større antal af BG4-positive kerner i kræft (gennemsnit 60,3 ± 5,4%) versus ikke neoplastiske (gennemsnit 18,3 ± 2,12%) vævskerner (figur 2). Når individuelle cancer fænotyper blev undersøgt, fandt vi, at både hepatocellulært carcinom (HCC) og intrahepatisk cholangiocarcinom (ICC) viste signifikant større nuklear BG4 farvning sammenlignet med ikke-neoplastisk væv (Figur 2A-D og G). Selvom HCC og ICC har forskellige cellulære oprindelse, der udvikler sig hepatocytter eller galdegangene cholangiocytes henholdsvis viste både et større antal og intensitet BG4-positive kerner i forhold til det ikke-neoplastisk levervæv. Endvidere i metastaser (isoleret fra storcellet udifferentierede lungekarcinomceller sites) en stigning i BG4-positiv farvning blev også bemærket (Figur 2E-G). Vi observerede klare forskelle mellem ikke-neoplastiske og tumorvæv for en række forskellige tilfælde patientgrupper. Faktisk en mere omfattende analyse af kræft og baggrund ikke-neoplastiske TMA kerner herunder umatchede sager igen viste en stigning i BG4-positive kerner på tværs af HCC, ICC og metastatisk carcinom (figur 3A). Når alle tilfælde blev behandlet samlet, blev en ~2.4 gange stigning i antallet af BG4-positive kerner set i leverkræft sammenlignet med ikke-neoplastisk væv. (P < 0,001, figur 3B)

Svarende til forøgelse af G-quadruplex forekomst i leverkræft væv, en mere end 3-fold stigning i antallet af BG4-positive kerner blev observeret i maven adenocarcinom og signetring cellecarcinom sammenlignet med baggrunden ikke-neoplastisk væv taget fra samme individ (Figur 4). En mere omfattende analyse af mavekræft og ikke neoplastiske væv, herunder uovertruffen tilfælde bekræftede stigningen i antallet af BG4-positive kerner set i mavekræft sammenlignet med ikke-neoplastisk væv (figur 5). Ja, i individuel mavekræft undertyper, adenocarcinomer (oprindelse fra kirtel epitel), signetring celle carcinomer (adenocarcinomer karakteriseret ved mucin deposition) og gastrointestinale stromale tumorer (GIST, KIT-udtrykkende sarkomer af mesenchymal oprindelse), viste alle større antal BG4-positive kerner i forhold til ikke-neoplastisk mavevæv (figur 5A). Når alle sager blev behandlet samlet, ~3.1 gange flere BG4-positive kerner blev fundet i kræft versus ikke-neoplastiske væv (Figur 5B, P < 0,001). Det er bemærkelsesværdigt, at flere mave tumor undertyper, som har forskellige ætiologier og progression, alle er kendetegnet ved stigende BG4 farvning. Disse resultater er derfor meget, der tyder på en generel sammenhæng mellem en øget tilstedeværelse af G-quadruplex strukturer og mavekræft udvikling.

I leveren og maven TMAs, viste lidt eller ingen kvantificerbare BG4 farvning, måske nogle kræft væv kerner afspejler et problem i epitop stabilitet under kirurgisk biopsi indsamling eller alternativt peger på en reel variation i G-quadruplex dannelse i disse særlige væv. Det er dog at bemærke, at i intet tilfælde var enhver ikke-neoplastisk lever eller mave væv i udstrakt BG4-positive. Sidstnævnte observation bekræfter endvidere, at forøgelsen af ​​antallet af BG4-positive celler ses i cancer TMA kerner afspejler en sand forskel i G-quadruplex tilstedeværelse mellem de ikke-neoplastiske og maligne tilstande. Analyse af G-quadruplex farvning i andre kræftformer kan derfor være muligt og vores foreløbige analyse af pancreas væv tyder på, at, mens BG4 farvning i ikke neoplastiske pancreas er udbredt, er der en ~1.6 ganges forøgelse af BG4 kernefarvning i adenocarcinom væv ( P. < 0,01, figur S3)

Samlet set vores resultater der viser, at G-quadruplexes kan visualiseres ved IHC i ikke-neoplastiske og kræft menneskelige væv udvide vores tidligere fund, der afslørede tilstedeværelsen af ​​G-quadruplex strukturer i kernerne i kultur cellelinier [9]. Det er bemærkelsesværdigt, at vi observeret en stigning i antallet af G-quadruplex-positive celler for nogle cancervæv sammenlignet med ikke-neoplastiske tilfælde. De data, som vi præsenterer ikke i sig selv forklare, hvorfor flere G-quadruplexes er tydelige i de tilfælde af mave og leverkræft. Men der er flere linjer af beviser i litteraturen, der tyder en potentiel forening eller kausale forbindelse mellem G-quadruplexes og mekanismer, der bidrager til udvikling af kræft eller progression. For eksempel G-quadruplex strukturer, hvis ikke løst under DNA-replikation, kan repræsentere skrøbelige websteder, der promoverer genom ustabilitet, hvilket er en velkendt kendetegnende for cancer [24]. Faktisk er G-quadruplex sekvensmotiver findes på DNA breakpoints som fører til translokationer i BCL2-genet i lymfomer og inden for HOX11 genet i T-celle-leukæmier [25], [26]. Computational analyser har også foreslået mulige sammenslutninger af G-quadruplexes og breakpoint regioner i forskellige kræftformer [19].

Vi hypotesen, at en stigning i genomiske G-quadruplexes i kræft kan opstå fra mutationer i enzymer, der behandler G-quadruplexes og /eller genomisk ustabilitet på G-quadruplex sites. For eksempel Fanconi anæmi, Bloom og Werner syndromer, alle display genom ustabilitet med en prædisposition for cancer [27] - [29] og er resultatet af mutationer i DNA helicase enzymer, der har G-quadruplex-løsning aktivitet [30] - [32] . Nylige genom-dækkende undersøgelser har også vist, anerkendelse af G-quadruplex sekvenser ved yderligere løse helicaser såsom ATRX, PIF1 og XPB /D [20] - [22]. Desuden PIF1 er blevet foreslået at undertrykke genomisk ustabilitet på G-quadruplexes [22], mens ATRX tab er associeret med kromosomal ustabilitet i bugspytkirtlen neuroendokrine tumorer [33], og XPD mutationer forstyrre nukleotid excision DNA-reparation, der fører til kræft-tilbøjelige sygdomme sådanne som xeroderma pigmentosum [34].

det fremgår, at lever og mavekræft er meget heterogene og er ikke kendetegnet ved en fælles genetisk signatur eller en højt repræsenteret drivende mutation, der kan simpelthen forklare den observerede stigning i G-quadruplex strukturer . Mens mange leverkræft er forbundet med hepatitis B eller C, den patologiske oplysninger med TMA'erne viser, at der er ingen korrelation med BG4 farvning. Som en del af det fremtidige arbejde, vil det være af værdi at analysere ikke neoplastiske og maligne tumorprøver til tilfælde, hvor hel-genom-sekventering er blevet anvendt til at belyse den genetiske baggrund af tumor /non-neoplastiske parvis for at fastslå forholdet mellem genotype og G-quadruplex dannelse i kræft.

Som konklusion, rapporterer vi brug af G-quadruplex-specifikt antistof, BG4, i IHC farvning eksperimenter af humane ikke-neoplastiske og kræft væv. Denne undersøgelse har gjort det muligt at identificere en signifikant højere forekomst af DNA G-quadruplex strukturer i kernerne i maven og leveren cancerceller sammenlignet med de tilsvarende ikke-neoplastiske væv. Vi hypotesen, at disse forskelle kan være afhængig af ændringer af cellulære processer, der regulerer genom stabilitet eller ændringer i kromatin tilstand ved G-quadruplex steder i kræft væv. Vores resultater støtter muligheden for, at kræftceller kan give et vindue af selektivitet, der ville gøre dem mere følsomme end ikke-neoplastiske celler i retning af et lille molekyle G-quadruplex målretning strategi.

Materialer og metoder

Fiksering, indlejring, sektionering og farvning af cellepellets blev udført af histopatologi kerneydelse på Cancer Research UK Cambridge Institute. Immunhistokemi (IHC) blev udført under anvendelse af standardmetoder på en automatiseret Leica Bond platform med mindre variationer. Kort fortalt blev væv fikseret i 24 timer ved stuetemperatur (RT) i 10% neutral bufret formalin og bearbejdet ved anvendelse af et Leica ASP300 vævsprocessor med de-hydrering gennem en gradueret ethanolserie, clearing i xylen og infiltration med smeltet paraffin. Indlejring blev udført på en Leica EG1160 Indlejring Station og snit blev skåret på 3 um med en mikrotom, flød på et vandbad indstillet på ~45-50 ° C, indtil glat og flad, før samling på et objektglas og tørring ved 60 ° C i 1 time. De-voksning og re-hydrering blev udført ved hjælp af en automatiseret Leica ST5020 Multistainer. MDA-MB-231 humant brystadenocarcinom celler blev opnået fra ATCC LGC Standards. For MDA-MB-231 cellepellets blev epitopgenfinding udført ved 100 ° C i 20 minutter med Bond epitopgenfinding Opløsning 1 (citrat-buffer pH 6,0) eller Bond epitopgenfinding opløsning 2 (Tris /EDTA-buffer pH 9,0) eller ved 37 ° C i 10 min med Bond enzym forbehandling kit (100 ug /ml proteinase K i Tris-bufret saltvand, overfladeaktivt middel og 0,35% ProClin 950) for at finde den bedste tilstand. Kommercielt tilgængelige menneskelige væv microarrays med passende etisk godkendelse i hjemlandet blev købt fra Insight Bio UK (for amerikanske Biomax Inc. arrays) og BioCat, Tyskland eller Stretton Scientific, UK (for Accumax, Isu Abxis arrays). Epitopgenfinding blev udført ved 100 ° C i 20 minutter med citratbuffer. BG4 farvning blev udført ved stuetemperatur på et automatiseret Leica Bond instrument med et kanin polymer kit (Leica) efter en 15 minutters inkubation med BG4 og en 8 min inkubation med et anti-FLAG polyklonalt kaninantistof (Cell Signaling Technology). Objektglas blev derefter modfarvet i 5 minutter med 0,02% hæmatoxylin at visualisere cellekerner. De-hydrering og clearing blev udført på en automatiseret Leica ST5020 Multistainer, og montering blev udført på en automatiseret glas coverslipper Leica CV5030. Slides blev scannet med en Aperio XT120 slide scanning system (Leica) og billeder analyseres ved hjælp af Aperio Imagescope Nuclear v9 software. Statistiske analyser og P-værdierne blev beregnet under anvendelse af t-test. Frekvens distribution grafer blev plottet ved hjælp af GraphPad Prism (GraphPad Software).

Støtte Information
Figur S1.
BG4 farvning på paraffinindlejrede MDA-MB-231 cellepellets. A. Humane MDA-MB-231 brystkræft cellepellets blev fikseret, paraffin-embedded og behandlet til IHC hjælp af G-quadruplex-specifikt antistof BG4. Stærk BG4 farvning (brun) er tydelig i cellekerner efter epitopgenfinding med Tris /EDTA-buffer pH 9,0. Scale bar svarer til 20 pm. Kerner modfarvet med hæmatoxylin (blå). B. Kraftig BG4 farvning (brun) er tydelig i cellekerner efter epitopgenfinding med proteinase K. C. Ingen nuklear farvning observeres i fravær af BG4 antistof efter Tris /EDTA epitopgenfinding. D. nr nuklear farvning ses efter DNase-behandling forud for BG4 farvning efter epitopgenfinding med EDTA. E. Høje niveauer af ikke-specifik farvning i fravær af BG4 efter epitopgenfinding med proteinase K.
doi: 10,1371 /journal.pone.0102711.s001
(TIF)
Figur S2.
Non-neoplastiske humane væv viser variabel BG4 farvning. Ikke neoplastiske væv blev farvet ved IHC under anvendelse af G-quadruplex-specifikt antistof BG4. A. BG4 farvning (brun) i nyrerne cortex viser en række intensiteter nukleare farvning i glomeruli og tilhørende strukturer. Cellekerner blev modfarvet med hæmatoxylin (blå). Scale bar svarer til 50 um B. Svagt positiv BG4 farvning ses i opsamlingskasserne tubulære kerner i nyren medulla. C. Hud viser en række BG4 intensiteter i epidermis med positive og negative kerner spredt, mens dermis er overvejende positive. D. De fleste kerner i tyktarmen er BG4-positive. E. I livmoderen, den lagdelte pladeepitel er i vid udstrækning BG4-negative hvorimod positiv farvning ses mere overfladisk. F. Gennem bryst duktale lobules begge myoepithelial og luminale celler viser generel stærk BG4 farvning med kun lejlighedsvise negative celler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0102711.s002
(TIF)
Figur S3.
Forhøjet tilstedeværelse af G-quadruplex strukturer i humane bugspytkirtel kræft væv. Ikke neoplastiske og cancer pancreas væv blev farvet ved IHC under anvendelse af G-quadruplex-specifikt antistof BG4, og antallet af BG4-positive kerner blev scoret med Aperio Imagescope software. A. kerner af ikke-neoplastisk bugspytkirtlen væv show moderat BG4 farvning (brun) med mange ufarvede kerner også til stede. Cellekerner blev modfarvet med hæmatoxylin (blå). Scale bar svarer til 50 um. B. BG4 farvning i pancreas adenocarcinom væv er mere omfattende med større intensitet. C. Samlet kvantificering af antallet af BG4-positive kerner på tværs af alle ikke-neoplastiske og bugspytkirtelkræft væv. Fejlsøjler repræsenterer S.E.M. * P < 0,01, n = 6 og 12 for ikke-neoplastiske og kræft kerner, henholdsvis
doi:. 10,1371 /journal.pone.0102711.s003
(TIF)

• PLoS ONE: Always Gamble på tom mave: Sult er forbundet med fordelagtige beslutning Making
• PLoS ONE: Uventet Headless og haleløse fisk i maven indhold makohaj Isurus oxyrinchus