PLoS ONE: Повышенные уровни G-Quadruplex образования в желудке человека и рака печени Tissues

Абстрактный
<р> Четыре скрученные G-квадруплекс ДНК вторичные структуры недавно были визуализированы в ядрах культивируемых клеток человека. Здесь мы покажем, что BG4, антитело G-квадруплекс специфические, могут быть использованы для окрашивания ДНК G-Quadruplex структур в тканях пациента, полученных с использованием иммуногистохимии. Мы наблюдаем значительно повышенные количества G-квадруплекс-положительных ядер в человека рака печени и желудка по сравнению с фоном без опухолевой ткани. Наши результаты свидетельствуют о том, что формирование G-квадруплекс могут быть обнаружены и измерены в материале пациента, полученных и что повышенные G-квадруплекс формация может быть характеристикой некоторых видов рака
<р> Цитирование:. Biffi G, Таннахилл D, J Миллер, Ховат WJ, Баласубраманьян S (2014) Повышенные уровни G-Quadruplex образования в желудке человека и рака печени тКАНЕЙ. PLoS ONE 9 (7): e102711. DOI: 10.1371 /journal.pone.0102711
<р> Редактор: Марк Isalan, Imperial College London, United Kingdom
<р> Поступило: 28 мая 2014 года; Принято: 23 июня, 2014 года; Опубликовано: 17 июля 2014
<р> Copyright: © 2014 Biffi и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник приписывают наличие
<р> Data:. авторы подтверждают, что все данные, лежащие в основе выводы полностью доступны без ограничений. Все соответствующие данные находятся в пределах своих подтверждающей информации, файлов бумаги и
<р> Финансирование:. Авторы благодарят Cancer Research UK для программного гранта (C9681 /A11961) и основного институционального финансирования в лабораторию Баласубраманьян, и для PhD студенчества для GB (http://www.cancerresearchuk.org). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> Неканоническая G-квадруплекс ДНК вторичные структуры могут быть сформированы из гуанина богатых последовательностей ДНК типа G <суб> 3 + N <югу> L1 G <югу> 3 + N <югу> L2 G <суб> 3 + N <югу> L3 G <югу> 3 + (N = любое основание и L = цикл) и такие мотивы последовательности, которые широко распространены во всем геноме человека [1], [2]. G-квадруплексы четыре двухцепочечной структуры, которые содержат штабеля тетрад, образованных за счет Хугстена водородных связей четырех гуанинами координированных центральным одновалентным катионом [3]. Олигонуклеотиды сложенные в G-квадруплексной структуры в пробирке
имеют высокую термодинамическую стабильность при близких к физиологическим условиям, в соответствии с их образованием в клетках [4]. Прогнозируемое расположение мотивов последовательности G-квадруплексных в регуляторных областей генома, такие как промоторы и теломер, позволяет предположить, что G-Quadruplex структуры могут иметь важную роль в функции генома [5] - [7]. Ряд геликаз, что решения G-квадруплексы были идентифицированы и выдвинули гипотезу, внести свой вклад в нормальных функций генома, таких как репликация, транскрипция и поддержание стабильности генома [8]. Визуализация ДНК G-квадруплексных структур в клетках человека поддерживает существование G-квадруплексов в геноме [9]. В этих экспериментах, весьма селективный G-квадруплекс-специфическое антитело (BG4) был сгенерирован фагового дисплея и используется для визуализации дискретных фокусы G-квадруплексных структур в ядрах линий культуре клеток человеческой ткани. Это антитело дало возможность зондировать клеточную роль G-квадруплексов, а также их возможного участия в развитии болезни.
<Р> G-Quadruplex структуры были предложены быть связаны с клеточными функциями, такими как репликации и транскрипции. Например, стабилизация G-квадруплекс небольшой молекулы могут репрессировать транскрипцию определенных онкогенов и /или вызвать повреждение ДНК на теломеры и онкогенов приводит к репликации дефектов и гибель клеток [10] - [17]. G-Quadruplex структуры также могут быть связаны с нестабильность генома и мотивов последовательности G-квадруплекс были найдены проксимальнее точки останова ДНК и сайты соматического числа копий изменения, наблюдаемые в некоторых форм рака [18], [19]. Геликаз, которые решают G-квадруплексы также найдены локализованы на участках нестабильности генома [20] - [22], а также заболевания, такие как Блума и синдромы Вернера, которые показывают повышенные уровни нестабильности генома и предрасположенности к раку, имеют способствующие мутации в G -quadruplex-решения геликаз [23].
<р> Учитывая потенциальную связь между G-квадруплексных структур и болезни человека, это является важной задачей для решения ли G-квадруплексы могут быть обнаружены в тканях человека. Поэтому мы исследовали обнаружение ДНК G-квадруплексов в тканях пациентов происхождения и есть ли различия в уровнях G-квадруплексных между неопухолевых и раковых тканей. За счет использования G-Quadruplex специфические антитела, BG4, в иммуногистохимии с формалином фиксированных залитых парафином (FFPE) секций ткани микрочипов, мы обнаружили широко распространенную ДНК образование G-Quadruplex в ядрах тканей человека. Количественное ядер Bg4-позитивных клеток показали более обширное образование G-квадруплексных структур в желудке и печени рака по сравнению с соответствующим фоном неопухолевых тканей. Эти результаты свидетельствуют о том, что обработка G-квадруплексных структур неправильно регулируется в некоторых злокачественных опухолей человека.

Результаты и обсуждение
<р> Мы решили продемонстрировать наличие G-квадруплексов в ядрах человека ткани и исследовать ли какие-либо различия очевидны в тканях онкологических больных происхождения. Наш подход был основан на обнаружении ядерных G-квадруплексов методом иммуногистохимии (IHC) с G-квадруплексной-специфическим антителом, BG4, на неопухолевых и рака микрочипов ткани (TMAS). Специфичность и избирательность BG4 для G-квадруплексных структур и применение BG4 в иммунофлуоресценции (ИФ) микроскопии в клетках организма человека были описаны ранее [9]. Для того, чтобы определить пригодность BG4 для IHC, мы впервые проверили это антитело в модельной системе с использованием секций из клеточных гранул FFPE из MDA-MB-231 раковых клеток молочной железы, которые ранее наблюдались для отображения ядерного G-Quadruplex фокусы с помощью IF микроскопии [9] , Как извлечения эпитопа, либо теплостойких опосредованной (в цитратном основе рН 6,0 или Трис /ЭДТА на основе рН 9,0 буферов) или ферментативный (с протеиназы К), часто требуется подвергать антигенные участки перед переплетом антитела, мы сравнили эти три стандартных эпитоп извлечения предварительной обработки. После Bg4 инкубации проводили окрашивание путем инкубации со вторичным анти-FLAG антителом, которое распознает тег ФЛАГ эпитоп, присутствующий в Bg4 антитела, а затем Leica пероксидазы обнаружения на основе полимера с использованием окрашивания платформы Бонд IHC. В соответствии с этим протоколом, интенсивное ядерное окрашивание наблюдалось с BG4 только после извлечения эпитоп (Фиг.1В и S1). Ни один окрашивание не наблюдалось при отсутствии предварительной обработки (рисунок 1А) и контроля, осуществляемого в отсутствие BG4 показал, что восстановление эпитоп с буфером цитрата на основе дали меньше фона, чем с Трис /ЭДТА (фиг.1С и S1), в то время как предварительно -Лечение с протеиназы к привело к неспецифической ядерного окрашивания даже при отсутствии BG4 (рис S1). Кроме того, после извлечения эпитопа с цитратом или Трис /ЭДТА буфера, лечение ДНКазы I до BG4 окрашивания привело к сильному снижению интенсивности BG4 ядерного сигнала (рис 1D и S1), далее подтверждая обнаружение ДНК G-квадруплексов. Сигнал ядерной BG4 видели в IHC согласуется с предыдущим обнаружением Bg4 очагов в ядрах клеток для тканевой культуры [9].
<Р> Установив протокол IHC для BG4, мы впервые подтвердили, что биопсию неопухолевых человек образцы ткани могут быть окрашивали с использованием Bg4. Как правило, мы наблюдали различные модели BG4 окрашивания во многих тканях предполагая различия в образовании G-квадруплексов между тканями, а также между клетками в пределах одной ткани (рис S2). Эти результаты указывают на то, что общее образование ДНК G-квадруплексов в сложных человеческих тканей может быть оценена с помощью BG4 в IHC, тем самым расширяя визуализацию G-квадруплексных структур за пределы ИФ микроскопии в клетках культуры ткани. В предварительном обследовании BG4 окрашивания на раковые ткани по сравнению с фоном неопухолевых ткани, различия в интенсивности или распределении BG4 окрашивания появились в основном неубедительными (данные не показаны), а во многих случаях строгое количественное определение не было возможности из-за значительных различий в морфологии и наличие нескольких типов клеток в злокачественных по сравнению с не-опухолевой ткани. В противоположность этому, при заболеваниях печени и желудка, наша предварительная экспертиза предположил, что эти ткани были легко поддаются количественной оценке из-за более равномерного внешнего вида, так и между неопухолевых и раковых тканей. Поэтому мы использовали программное обеспечение для анализа изображений Aperio Imagescope Nuclear (v9) для количественной оценки процент Bg4-положительных ядер, присутствующих в ТМА. Отдельный анализ изображений классификатор был разработан для каждого типа ткани, чтобы точно определить и отдельных прикосновение к предметам, с доброкачественных и опухолевые образцы набрал с использованием тех же параметров для точного сравнения. Поразительно, но в девяти случаях, для которых мы имели дубликатом рака печени TMA ядра с соответствующим соответствием фоне неопухолевых ткани, взятой из того же самого пациента, мы наблюдали гораздо большее число BG4-положительных ядер при раке (в среднем 60,3 ± 5,4%) по сравнению с неопухолевых (в среднем 18,3 ± 2,12%) сердечники ткани (Рисунок 2). Когда были рассмотрены отдельные фенотипы рака, мы обнаружили, что оба гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) и внутрипеченочный холангиокарциному (ICC) показали значительно большую Bg4 окрашивание ядерного по сравнению с не опухолевой ткани (рис 2A-D и G). Хотя HCC и МТП имеют различные клеточные происхождения, развивающаяся из гепатоцитов или желчных протоков холангиоцитов соответственно, оба показали большее количество и интенсивность Bg4-положительных ядер по сравнению с неопухолевых ткани печени. Кроме того, при метастазах (изолированные от больших клеточных недифференцированных участков карциномы легких) увеличение Bg4-положительное окрашивание было также отмечено (рис 2E-G). Мы наблюдали явные различия между неопухолевых и опухолевых тканей для ряда различных клинических случаев. Действительно, более широкий круг анализ рака и фоновых неопухолевых ТМА ядер, включая несогласованных случаев снова показали увеличение Bg4-положительных ядер через ЖСК, МТП и метастатического (рис 3А). Когда все дела были рассмотрены вместе, ~2.4-кратное увеличение числа BG4-положительных ядер наблюдалось при раке печени по сравнению с не опухолевой ткани. (P &л; 0,001, рис 3B)

По аналогии с увеличение G-квадруплексной заболеваемости в ткани рака печени, больше, чем 3-кратное увеличение числа BG4-положительных ядер наблюдалось в аденокарциномы желудка и карциномы перстневидно клеток по сравнению с фоном неопухолевых ткани, взятой из той же особи (рис 4). Более широкий круг анализ рака желудка и неопухолевых тканей, включая несогласованных случаев подтвердили увеличение числа Bg4-положительных ядер видели в раке желудка по сравнению с не опухолевой ткани (рисунок 5). Действительно, в индивидуальной рака желудка подтипы, аденокарциномы (происходящих из железистого эпителия), карцином перстнем (аденокарциномы, характеризующиеся муцина отложение) и желудочно-кишечных стромальных опухолей (GIST, KIT-экспрессирующих саркомы мезенхимального происхождения), все показали большее количество Bg4-положительных ядер по сравнению с не-опухолевой ткани желудка (рис. 5А) Когда все дела были рассмотрены вместе, ~3.1 раза больше Bg4-положительных ядер были найдены при раке по сравнению с неопухолевых тканей (рис 5B, P &ЛТ; 0,001). Следует отметить, что несколько опухолей желудка подтипы, которые имеют различные этиологию и прогрессии, все характеризуются увеличением Bg4 окрашивания. Эти результаты, следовательно, весьма наводящий общей связи между увеличением присутствия G-квадруплексных структур и развития рака желудка.
<Р> В печени и желудка ТМА, некоторые ядра ткани рака мало или вообще не количественному Bg4 окрашивание, возможно, показал, что отражает проблему в стабильности эпитопа во время сбора хирургической биопсии или в качестве альтернативы, указывающие на реальной изменчивости в формировании G-квадруплексной в этих конкретных тканях. Тем не менее следует отметить, что ни в коем случае было никакой неопухолевых печени или желудка ткани широко BG4-положительным. Это последнее наблюдение еще раз подтверждает, что увеличение числа Bg4-позитивных клеток видели в ядрах раковых TMA отражает истинную разницу в G-квадруплексной присутствии между неопухолевых и злокачественных состояний. Поэтому анализ G-квадруплексной окрашивания в других видов рака может быть возможным, и наш предварительный анализ ткани поджелудочной железы свидетельствует о том, что, в то время как BG4 окрашивание в неопухолевых поджелудочной железы широко распространена, существует ~1.6-кратное увеличение BG4 ядерного окрашивания в тканях аденокарциномы ( P &л;. 0.01, рис S3)

в целом, наши результаты демонстрируют, что G-квадруплексы могут быть визуализированы с помощью IHC в неопухолевых и раковых тканей человека расширить наши более ранние результаты, которые показали наличие G-квадруплексных структур ядра культуры клеточных линий [9]. Следует отметить, что мы наблюдали увеличение числа G-квадруплексных-позитивных клеток для некоторых раковых тканей по сравнению с неопухолевых случаев. Данные, которые мы представляем сами по себе не объясняет, почему все больше G-квадруплексы проявляются в случаях желудка и печени рака. Тем не менее, есть несколько линий доказательств в литературе, которые свидетельствуют о возможной связи или причинную связь между G-квадруплексов и механизмов, способствующих развитию рака или прогрессии. Например, G-Quadruplex структуры, если они не разрешены во время репликации ДНК, могут представлять собой хрупкие участки, которые способствуют нестабильности генома, который является хорошо известным признаком рака [24]. Действительно, G-Quadruplex мотивы последовательностей ДНК найдены на точки останова, которые приводят к транслокации в пределах гена BCL2 в лимфом и внутри гена HOX11 в Т-клеточных лейкозов [25], [26]. Вычислительные анализы также предложили возможные ассоциации G-квадруплексов и точки останова областей в различных раковых заболеваний [19].
<Р> Мы предполагаем, что увеличение геномных G-квадруплексов при раке может возникать из-за мутаций в состав ферментов, которые обрабатывают G-квадруплексы и /или геномная нестабильность на G-квадруплексных сайтов. Например, анемия Фанкони, синдромы Блума и Вернер, все дисплей нестабильность генома с предрасположенностью к раку [27] - [29] и являются результатом мутаций в ДНК геликазы ферментов, которые имеют G-Quadruplex-решения активностью [30] - [32] , Недавние геномные исследования также обратили внимание на признание G-квадруплексных последовательностей дополнительными разрешающих геликаз, таких как ATRX, PIF1 и XPB /D [20] - [22]. Кроме того, PIF1 было предложено, чтобы подавить нестабильность генома в G-квадруплексов [22], в то время как потеря ATRX связано с хромосомной нестабильности в панкреатических нейроэндокринных опухолей [33], и XPD мутации разрушают нуклеотидную эксцизионной репарации ДНК, что приводит к раку, подверженных заболеваниям таких а Xeroderma пигментная [34].
<р> оказывается, что печень и желудок рака весьма неоднородны и не характеризуются общей генетической подписью или высоко представленной мутации вождения, которая может просто объяснить наблюдаемое увеличение G-квадруплексных структур , В то время как многие виды рака печени, связаны с гепатитом В или С-инфекции, патологическое информация, полученная с ТМА означает, что не существует корреляции с BG4 окрашивания. В рамках будущей работы, она будет иметь значение для анализа неопухолевых и злокачественных опухолевых образцов для случаев, когда весь-секвенирование генома используют с целью выяснения генетического фона опухоли /неопухолевых пар, с тем чтобы установить связь между генотипом и G-квадруплексной формирования рака.
<р> в заключение мы сообщаем использование G-квадруплексной специфические антитела, BG4, в экспериментах окрашивания IHC в неопухолевых и раковых тканей человека. Это исследование позволило нам выявить значительно большее присутствие ДНК G-квадруплексных структур в ядрах желудка и рака печени клеток по сравнению с соответствующим неопухолевых тканей. Мы предполагаем, что эти различия могут зависеть от изменений клеточных процессов, которые регулируют стабильность генома или изменения в состоянии хроматина на G-квадруплексных сайтов в раковых тканях. Наши результаты подтверждают возможность того, что раковые клетки могут обеспечить окно селективности, что бы сделать их более чувствительными, чем неопухолевых клеток по отношению к малой молекулы G-квадруплексной таргетирования стратегии.

Материалы и методы
<р> Закрепление, вложение, секционирования и окрашивания клеточных гранул были выполнены основной службе патоморфологическую в Cancer Research UK Кембриджского института. Иммуногистохимия (IHC) проводили с использованием стандартных методов на автоматизированной платформе Leica Bond с незначительными вариациями. В кратком изложении, ткани фиксировали в течение 24 ч при комнатной температуре (RT) в 10% нейтральном забуференном формалине и обработаны с использованием процессора тканевую Leica ASP300 с де-гидратации через серии градуированных этанола, очистка в ксилоле и инфильтрации расплавленным парафином. Встраивание проводили на Встраивание станции Leica EG1160 и получали срезы при 3 мкм с помощью микротома, плавали на водяной бане не установлен на уровне ~45-50 ° С до получения однородной массы и плоские, перед сбором на предметное стекло микроскопа и сушки при 60 ° C в течение 1 ч. Де-депиляция и регидрационной были выполнены с использованием автоматизированного Leica ST5020 multistainer. MDA-MB-231 клетки аденокарциномы молочной железы человека были получены из АТСС стандартов LGC. Для получения клеточных гранул MDA-MB-231, извлечение эпитоп проводили при 100 ° С в течение 20 мин с поисковой Bond эпитоп раствор 1 (цитрата на основе буфера, рН 6,0) или Bond раствора поиска взаимосвязанного эпитоп 2 (Трис /ЭДТА на основе буфера, рН 9,0) или при температуре 37 ° с в течение 10 мин с помощью набора ферментов Бонд предварительной обработки (100 мкг /мл протеиназы к в Трис-буферном растворе, поверхностно-активного вещества и 0,35% Проклина 950), чтобы найти наилучшее состояние. Коммерчески доступные микрочипов ткани человека с соответствующей этической утверждения в стране происхождения были приобретены у Insight Bio Великобритании (для США Биомакс Inc. массивов) и Biocat, Германия или Стреттон Scientific, Великобритании (для Accumax, Isu Abxis массивов). Эпитоп поиск проводили при 100 ° С в течение 20 мин с цитратом буфером. BG4 окрашивание проводили при комнатной температуре на автоматизированном приборе Leica Bond с комплектом кролика полимера (Leica) после 15 мин инкубации с BG4 и 8-минутной инкубации с анти-FLAG поликлональное антитело кролика (Cell Signaling Technology). Срезы затем контрастно в течение 5 мин с 0,02% гематоксилином для визуализации клеточных ядер. Де-гидратация и очистка были сделаны на автоматизированной Leica ST5020 multistainer, и монтаж был выполнен на автоматизированном стекле coverslipper Leica CV5030. Слайды были отсканированы с системой сканирования слайдов Aperio XT120 (Leica) и изображения анализировали с использованием программного обеспечения Aperio Imagescope ядерной V9. Статистический анализ и значения P были рассчитаны с использованием Т-теста Стьюдента. Графики частотной распределения были построены с использованием GraphPad Prism (GraphPad Software).

Поддержка информации Рисунок S1 изображения.
BG4 окрашивание на парафиновых срезах клеток гранул MDA-MB-231. А. человека MDA-MB-231 клеток рака молочной железы гранулы фиксировали, парафин и обрабатывали для IHC с использованием G-Quadruplex специфические антитела BG4. Сильно BG4 окрашивание (коричневый) проявляется в ядрах клеток после извлечения эпитопа с Трис /ЭДТА на основе буфера рН 9,0. Шкала бар соответствует 20 мкм. Ядра контрастно гематоксилином (синий). Б. Сильное окрашивание BG4 (коричневый) проявляется в ядрах клеток после извлечения эпитопа с помощью протеиназы К. С. Не наблюдается ядерное окрашивание в отсутствие BG4 антител после извлечения Трис /ЭДТА эпитоп. D. Нет ядерное окрашивание наблюдается после лечения ДНКазы перед Bg4 окрашивания после извлечения эпитопа с ЭДТА. E. Высокий уровень неспецифического окрашивания при отсутствии BG4 после извлечения эпитопа с протеиназы К.
DOI: 10.1371 /journal.pone.0102711.s001
(TIF) Рисунок S2
.
неопухолевых тканей человека показывают переменную Bg4 окрашивания. Неопухолевых ткани окрашивали IHC с использованием G-Quadruplex специфические Bg4 антитела. A. BG4 окрашивание (коричневый) в коре почек показывает диапазон интенсивности ядерных окрашивания в клубочков и связанных с ними структур. Ядра клеток контрастно гематоксилином (синий). Шкала бар соответствует 50 мкм B. слабоположительны BG4 окрашивание наблюдается в собирательных канальцев ядрах продолговатого мозга почки. C. Кожа показывает диапазон интенсивности Bg4 в эпидермисе с положительными и отрицательными ядрами, разбросанных по всему, в то время как дермы в основном положительно. D. Большинство ядер в толстой кишке являются BG4-положительными. E. В тела матки, многослойный эпителий в значительной степени BG4 отрицательным, тогда как положительное окрашивание наблюдается более поверхностно. F. На протяжении протоков молочной железы дольки, как миоэпителиальные и просветные клетки показывают общую сильную Bg4 окрашивание только случайными негативными клетками
DOI:. 10.1371 /journal.pone.0102711.s002
(TIF) Рисунок S3
.
Повышенные наличие G-квадруплексных структур в тканях рака поджелудочной железы человека. Неопухолевых и рак поджелудочной железы ткани окрашивались IHC с использованием G-Quadruplex специфические BG4 антитела, а количество BG4-положительных ядер оценивали с использованием программного обеспечения Aperio Imagescope. А. Ядра неопухолевых ткани поджелудочной железы показывают умеренное Bg4 окрашивания (коричневый) с большим количеством неокрашенных ядер также присутствует. Ядра клеток контрастно гематоксилином (синий). Шкала бар соответствует 50 мкм. B. BG4 окрашивание в аденокарциномы поджелудочной железы ткани является более обширным с большей интенсивностью. С. В целом определение количества числа BG4-положительных ядер во всех неопухолевых и панкреатических раковых тканей. Столбики ошибок обозначают s.e.m. * P &л; 0,01, п = 6 и 12 для неопухолевых и раковых ядер соответственно
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0102711.s003
(TIF)

• PLoS ONE: Всегда Gamble на пустой желудок: Голод связан с Выгодное принятия решений
• PLoS ONE: Неожиданное без головы и Бесхвостый рыбы в желудке Содержание Shortfin Мако Isurus oxyrinchus